Tipos de Sequenciadores de DNA

Prévia do material em texto

Biotecnologia e Informática
Aluna Geovaneide de Sousa Nonato Teixeira
Matricula 20185131508
 Trabalho Sobre
Diferentes tipos de sequenciadores
Geovaneide de S. N. Teixeira
Diferentes tipos de sequenciadores
 
1 Métodos de sequenciamento
1.1 Método de Sanger
1.1.1Método de Sanger automatizado
1.2 Piro sequenciamento
1.2.1 Preparo da Amostra
1.3 PCR em emulsão
1.3.1 Sequenciamento
1.4 Sequenciamento por síntese
2 Sequenciamento de Nova Geração (NGS)
2.1 Segunda geração
2.2 Terceira geração
2.3 Quarta geração
Métodos de sequenciamento
Método de Sanger
O método de Sanger, também chamado de método de terminação de cadeia, é uma 
técnica que utiliza a DNA- polimerase I de Escherichia coli para sintetizar cópias 
complementares do DNA de fita simples a ser sequenciado. O método consiste na 
adição de nucleotídeos modificados, chamados didesoxiribonucleotídeos (ddNTP’s), 
que não possuem o grupo OH livre do carbono 3’ da pentose, e impedem o crescimento 
de um fragmento de DNA em replicação pela DNA polimerase após sua adição. Quando 
os ddNTP’s tentam se ligar com a fita de DNA, com a ausência do OH, o próximo 
nucleotídeo não tem onde se ligar e a replicação para, assim, é possível obter fitas do 
mesmo DNA com número de resíduos diferentes. O método envolve a produção de 
muitas cópias de DNA e tem como componentes, além do DNA molde a ser 
sequenciado, uma enzima DNA polimerase, um par de oligo nucleotídeos iniciadores 
(primer, senso e antisenso) e os quatro nucleotídeos do DNA ou
desoxirribonucleosídeos tri fosfatados (dATP, dTTP, dCTP, dGTP- Adenina, Timina, 
Citosina e Guanina). Além disso, como característica peculiar do Método de Sanger são 
adicionados à mistura de reagentes versões terminadoras de cadeia, os 
didesoxinucleosídeos tri fosfatados (ddTNPs) para os quatro nucleotídeos de cadeia 
existentes, cada um marcado com um corante de uma cor diferente.
Ocorre que durante a execução da técnica, quando o análogo didesóxi é incorporado ao 
poli nucleotídeo em crescimento no lugar do nucleotídeo normal correspondente, o 
crescimento da cadeia é terminado devido a ausência de um grupo 3-OH, o que impede 
a formação de uma nova ligação fosfodiesterase. Ao se usar somente uma pequena 
quantidade de ddNTP, uma série de cadeias cortadas é gerada, cada uma tendo sido 
terminada pelo análogo didesóxi em uma das posições ocupadas pela base 
correspondente. São feitas reações para cada um dos quatro ddNTPs e as quatro 
misturas das reações são separadas, simultaneamente, por eletroforese em canaletas 
paralelas em um gel de sequenciamento- gel de poliacrilamida.
No método de Sanger, uma fita simples de DNA a ser sequenciada é combinada em um 
tubo com primer, DNA polimerase e nucleotídeos. Os quatro dideoxinucleotídeos 
marcados com corantes na extremidade 5’ são adicionados, mas em concentrações 
menores do que as dos nucleotídeos comuns. A mistura de reação é primeira aquecida 
para desnaturação do DNA molde, então resfriadas para que os primers possam se ligar 
ao molde de fita simples. Quando o primer se liga, a temperatura é aumentada de novo, 
permitindo que a DNA polimerase sintetize um novo DNA a partir do primer. A DNA 
polimerase continuará a adicionar nucleotídeos à cadeia até que aconteça a adição de 
um dideoxinucleotídeo ao invés de um normal. Uma vez que um dideoxinucleotídeo 
não tem oxidrila ou hidroxila na extremidade 3’, para a reação.
Esse processo é repetido em um número de ciclos, e quando o ciclo se completa, é 
garantido que um dideoxinucleotídeo terá se incorporado em todas as posições do DNA 
alvo em pelo menos uma reação, ou seja, o tubo irá conter fragmentos de diferentes 
comprimentos, terminando em cada uma das posições de nucleotídeos no DNA. As 
extremidades dos fragmentos serão rotuladas com corantes que indicam o nucleotídeo 
final. Depois que a reação é executada, os fragmentos são levados através de um longo e 
fino tubo sob uma matriz de gel em um processo chamado de eletroforese capilar em 
gel, onde pequenos fragmentos movem-se rapidamente através dos poros de gel, 
enquanto longos fragmentos movem-se mais devagar. Assim que cada fragmento cruza 
a ‘‘linha de chegada’’ no final tubo, ele é iluminado por um laser, permitindo que o 
corante anexado seja detectado.
O menor fragmento (que termina com apenas um nucleotídeo depois do primer) 
atravessa a linha de chegada primeiro, seguido do próximo menor fragmento (terminado 
com dois nucleotídeos depois do primer) e assim por diante. Assim sendo, a partir das 
cores doa corantes registrados uma após a outra no detector, a sequência do pedaço 
original de DNA pode ser construída com um nucleotídeo por vez. Os dados registrados 
pelo detector consistem em uma série de picos em intensidade de fluorescência. A
sequência de DNA é lida a partir dos picos no cromatograma. Em um único gel é 
possível resolver não mais que 300 a 400 fragmentos consecutivos através do auxílio de 
instrumentos computadorizados
Método de Sanger automatizado
Para sequenciar grandes extensões de DNA, o método de Sanger pode ser acelerado 
através da automação. Isso exigiu que as técnicas de marcação radioativa descritas 
anteriormente, que não são facilmente automatizadas, fossem substituídas por técnicas 
de marcação fluorescente (eliminando danos à saúde e problemas de armazenamento 
decorrentes do uso de nucleotídeos radioativos).
Cada um dos quatro ddNTPs usados para terminar a extensão de cadeia é ligado 
covalentemente a um marcador fluorescente de cor diferente e as reações de extensão de 
cadeia são realizadas em um único tubo que contém os quatro ddNTPs marcados. A 
mistura de fragmentos formados é, então, submetida à eletroforese em uma 'única 
canaleta do gel de sequenciamento e a medida que cada fragmento sai do gel, sua base 
terminal é identificada de acordo com o seu espectro de fluorescência, que é 
característico para cada base, por um sistema de detecção de fluorescência induzido por 
laser, em cada reação, ou seja, para cada base (A,T,G,C) utiliza-se um fluorocromo 
diferente (uma cor diferente), de modo que os produtos podem ser reunidos e a 
eletroforese destes realizada em um único canal do gel de sequenciamento. O sinal 
fluorescente diferencial emitido por cada fragmento, após iluminação com um feixe de 
laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de onda. a luz 
emitida é detectada por escaneamento do gel e a sequência deduzida por computador. 
Variáveis mais modernas, mais rápidas e poderosas; incluem a robotização total do 
processo com a inclusão das etapas de purificação e da reação de síntese da cadeia do 
DNA.
Nos sistemas mais avançados, o gel de sequenciamento está contido em um conjunto de 
até 96 capilares, em vez de uma placa de gel; a preparação e a aplicação da amostra são 
realizadas por sistemas robotizados; e a eletroforese e a análise dos dados são 
completamente automatizadas. Esses sistemas podem sequenciar simultaneamente 96 
amostras de DNA, cerca de 650 bases por hora.
Piro sequenciamento
O piro sequenciamento é um sistema de sequenciamento de segunda geração. É o 
sistema utilizado pela plataforma 454 Life Science. A metodologia é capaz de 
determinar qual das quatro bases foi incorporada na cópia do DNA molde. Essa técnica 
é utilizada no sequenciamento de novo (sequenciamento de genomas desconhecidos) 
principalmente para elucidação de genomas bacterianos. O sistema é dividido em três 
etapas: preparo da amostra, PCR em emulsão e o sequenciamento O piro 
sequenciamento baseia-se em seguintes passos:
1- A amostra dos fragmentos de DNA;
2- Ligação de sequências adaptadoras nas extremidades de cada fragmento, em que são 
utilizados dois adaptadores diferenciados, um em cada extremidade 5' e 3' da fita;
3- Rompimento das fitas de DNA duplos em uma fita de DNA simples
4- Ligação das sequências adaptadoras em Nano esferas, denominadas beads. Estas 
Nano esferas possuem sequências que pareiam comas sequências adaptadoras, sendo 
que, estatisticamente, espera-se que apenas uma sequência se ligue a cada bead;
5- O próximo passo após ocorrer a ligação do DNA às beads, é a amplificação. No caso 
do piro sequenciamento, essa amplificação é realizada em uma solução oleosa 
emulsificada, denominada PCR em emulsão; assim então, as beads serão internalizadas 
por gotículas de óleo e a única fita de DNA ligada a nano esfera dará origem a várias 
outras fitas, que também se ligarão a essas Nano esferas. Desta forma, cada bead ficará 
com milhares de cópias de uma única sequência de DNA. Realizado o processo de 
amplificação, a solução é transferida para uma placa contendo milhões de nano poços, 
que possuem diâmetros suficientes para apenas uma bead. Logo após os reagentes da 
reação de sequenciamento são adicionados, sendo utilizados neste caso, as enzimas 
DNA polimerase, ATP sulfurizasse, luciferase e apirase e o substrato luciferina. O 
sequenciador adicionará um nucleotídeo (dNTP) por vez, que será utilizado no lugar do 
ATP pelo fato de ser o substrato da enzima luciferase. A incorporação de um 
nucleotídeo liberará um piro fosfato, que vai converter-se em ATP pela ação da enzima 
ATP sulfurilase, na presença de dATPαS. O ATP gerado será utilizado pela enzima 
luciferase para converter a luciferina em oxiluciferina, um processo que liberará luz. 
Caso um nucleotídeo adicionado pelo sequenciador não seja incorporado, a enzima 
aspirase o degradará, garantindo a limpeza do sistema e permitindo que um novo 
nucleotídeo seja adicionado à placa.
Em cada um dos nano poços está ocorrendo milhares de reações ao mesmo tempo, onde 
uma câmera CCD é responsável por filmar a placa e enviar todos os dados para um 
computador. Chegando ao computador, poderá ser realizada a identificação da 
sequência de cada nano poço, através da análise dos picos luminosos gerados pela 
adição de cada nucleotídeo. O piro sequenciamento é considerado um método mais 
eficiente que o método de Sanger se considerarmos que a cobertura da sequência é 
muito maior, sendo uma determinada base lida várias vezes. Entretanto, o método tem 
como contrariedade a necessidade de usar um número maior de reagentes.
Preparo da Amostra
O DNA é clivado em fragmentos aleatórios e pequenos de 300-500pb e são então 
ligados a adaptadores que possuem uma sequência específica que permite a ligação 
desse fragmento a microesferas de captura de DNA.
PCR em emulsão
A reação em cadeia da polimerase (português brasileiro) ou simplesmente PCR- 
Polimerase Chain Reaction (termo inglês), trata-se de uma técnica de biologia molecular 
utilizada atualmente para diferentes tipos de estudos que segue desde caracterização de 
diversidade genética das espécies até exames de paternidade e á elucidação de crimes 
ligados a biologia forense. Essa técnica é basicamente utilizada para amplificar 
determinados trechos de DNA dos organismos assim permitindo uma maior facilidade 
de analises dos mesmos.
Então o DNA de uma amostra biológica (sangue, sêmen, etc.) é extraído de um 
indivíduo e purificado, e sendo então submetido a vários ciclos de aquecimento e 
resfriamento em um termociclador, este aparelho é composto por um bloco capaz de 
aquecer e resfriar de acordo com o sentido da corrente elétrica aplicada. O 
termociclador divide a reação de PCR em três etapas, que são: desnaturação, 
anulamento e extensão. A desnaturação é caracterizada pelo aumento da temperatura 
(91 a 95 °C) com a finalidade de romper as pontes de hidrogênio e, assim permitir a 
abertura da dupla fita. O anelamento está relacionado com a ligação dos primes na 
região específica que se deseja amplificar e é caracterizada pelo abaixamento da 
temperatura (55 a 62 °C). Esta temperatura está diretamente relacionada com a 
composição dos primers. A terceira etapa, a extensão, envolve a ativação da Taq 
Polimerase (72 °C) e subsequentemente a síntese das novas cadeias (NASCIMENTO; 
SUAREZ; PINHAL, 2010), estas alterações de temperatura ocorrem em torno de 30 a 
40 vezes e são chamadas de ciclo (NOVAIS; PIRES-ALVES, 2004).
Nesse processo então são utilizados além do DNA água, uma Taq DNA-polimerase, 
iniciadores, os chamados primers (moléculas de ácidos nucleicos que demarcam o treco 
a ser amplificado), também os DNTPs, dentre outros componentes, cada gotícula possui 
uma microesfera, assim funcionando como um micro reator sem contaminantes ou 
sequências competidoras. Depois de uns 30 ciclos de aquecimento e resfriamento, um 
determinado trecho de DNA poderá ser duplicado mais de um bilhão de vezes, para 
poder então compará-lo com diferentes indivíduos da população, ou dos progenitores e 
de seus respectivos descendentes; após a PCR, as microesferas com os seus respectivos 
fragmentos são depositadas em uma placa onde cada poço possui apenas uma 
microesfera. A placa do sequenciamento contém 1,6 milhões de poços; é necessário que 
depois da PCR o trecho seja submetido a uma separação eletroforética, este meio serve 
de transporte para a separação do DNA, onde nesse tipo de experimento é usado 
normalmente um gel de poliacrilamida, então colocado a uma solução de brometo de 
etílico ou nitrato de prata corar os fragmentos amplificados.
Essa técnica pode ser utilizada para a identificação de indivíduos. Determinadas 
mutações que afetam o DNA podem alterar o tamanho dos fragmentos que são 
amplificados na PCR; indivíduos diferentes da população podem apresentar fragmentos 
de diferentes comprimentos, e nesse caso como são herdáveis, eles podem ser passados 
para a prole seguindo os princípios de herança mendeliana. Sendo assim, nesses tipos de 
estudos são escolhidas aquelas regiões do genoma que apresentam grande variação de 
tamanho. Quando diferentes regiões do genoma de um mesmo indivíduo é submetida a 
PCR e a separação eletroforética, é possível gerar um perfil exclusivo de amplificação, 
que se assimila a uma impressão digital.
As microesferas são ressuspendidas em uma mistura de reagentes de PCR, água, 
dNTPs, oligo nucleotídeos iniciadores e Taq DNA-polimerase para a amplificação do 
fragmento. Cada gotícula possui uma microesfera, assim funcionando como um micro 
reator sem contaminantes ou sequências competidoras. Após a PCR, as microesferas 
com os seus respectivos fragmentos são depositadas em uma placa onde cada poço
possui apenas uma microesfera. A placa do sequenciamento contém 1,6 milhões de 
poços.
Sequenciamento
O DNA é sequenciado em ciclos, e a cada ciclo um nucleotídeo é adicionado à reação. 
Se o nucleotídeo conhecido adicionado for incorporado à sequência um sinal de luz é 
emitido. Um dos quatro dNTPs é adicionado ao poço, se o dNTP for complementar ao 
DNA molde e incorporado à sequência a DNA polimerase catalisa a sua inserção e 
libera um íon piro fosfato.
DNA n resíduos + dNTP → DNA n+1 resíduos + P2O74-
A adenosina-5´-fosfossulfato adicionada reage com o piro fosfato para formar ATP, 
essa reação é catalisada pela enzima ATP-sulfurilase.
P2O74- + Adenosina-5´-fosfossulfato → ATP + SO42-
O ATP formado mais a luciferina e O2 produz oxiluciferina e um facho de luz visível, 
quimiluminescência. A quantidade de nucleotídeos adicionados é proporcional à 
intensidade da luz detectada, assim é possível determinar o número de nucleotídeos 
adicionados.
ATP + Luciferina → Luz + Oxiluciferina
A última etapa é a de lavagem onde a apirase é adicionada ao poço para a degradação de 
nucleotídeos que não reagiram.
NTP + 2H2O→ NMP + 2PO43-
Sequenciamento por síntese
O sequenciamento por síntese, assim como o sequenciamento de Sanger, faz uso de 
DNA polimerase e nucleotídeos terminadores marcados com diferentes fluoróforos. É o 
tipo de sequenciamento utilizado pela plataforma ilumina. A inovação dessa técnica 
consiste na clonagem in vitro dos fragmentos a serem sequenciados, em uma plataforma 
sólida de vidro, processo também conhecido como PCR de fase sólida O que 
proporciona um sequenciamento em ampla escala com maior rapidez e precisão. Essa 
técnicaé dividida em 3 etapas, a preparação da amostra, o cluster (formação de grupos 
de fragmentos na placa) e o sequenciamento.
Na etapa de preparação, o fragmento de DNA da amostra a ser sequenciado é ligado a 
sequencias adaptadoras em suas extremidades. Esses adaptadores são semelhantes a 
adaptadores que são fixados previamente a superfície da placa de clonagem, por sua 
extremidade 5’, de modo a deixar a extremidade 3’ livre para o sequenciamento.
Já na etapa de cluster, os fragmentos de DNA são hibridizados através dos seus 
adaptadores em suas extremidades aos adaptadores previamente fixados na placa, o que 
promove uma grande estabilidade a sequência e um bom acesso as enzimas. Essa 
hibridização é seguida de uma etapa de amplificação, onde são disponibilizados dNTPs 
não marcados, para que seja sintetizada a fita complementar dos fragmentos de DNA 
imobilizados na placa, formando assim os clusters de fragmentos a serem sequenciados.
Já na terceira etapa, o sequenciamento propriamente dito, 4 diferentes nucleotídeos 
terminadores marcados são fornecidos para as reações de sequenciamento que ocorrem 
dentro de cada cluster. A cada ciclo de sequenciamento apenas 1 nucleotídeo marcado é 
disponibilizado, porém a alta densidade dos clusters de sequenciamento possibilita que 
o sinal de fluorescência gerado com a incorporação de cada um dos nucleotídeos 
terminadores tenha uma intensidade suficiente para garantir sua detecção exata. A 
leitura do sinal de fluorescência é realizada ao término de cada ciclo. Em seguida, 
ocorre uma etapa de lavagem para remoção dos reagentes excedentes, remoção do 
terminal 3’ bloqueado e do fluoróforo do nucleotídeo incorporado no ciclo anterior para 
dar continuidade ao sequenciamento. A leitura das bases é feita pela análise sequencial 
das imagens capturadas em cada ciclo de sequenciamento O resultado final é um 
sequenciamento base-por-base altamente preciso.
Sequenciamento de Nova Geração (NGS)
O projeto do genoma humano, a necessidade de obter informações genéticas para 
medicina personalizada, o avanço da tecnologia e outras demandas impulsionaram o 
desenvolvimento de novas metodologias de sequenciamento com melhor qualidade, 
menor custo, maior rapidez e maior capacidade de geração de informações. Esses novos 
métodos pertencem ao grupo de Sequenciamento de Nova Geração (NGS, do 
inglês Next-Generation Sequencing), podendo ser de segunda, terceira ou quarta 
geração. Dentre esses métodos, destacam-se o 454 Roche (pirossequeciamento), o 
Illumina, o Ion-torrent, o PacBio e o Nanopore.
Segunda geração
Na maioria dos sequenciamentos, parte-se do princípio que a DNA polimerase irá 
adicionar nucleotídeos em uma fita de DNA complementar a uma fita molde. A 
identificação da ordem de quais nucleotídeos estão sendo incorporados permite o 
conhecimento da sequência da molécula em questão. A reação de adição de um 
nucleotídeo à molécula de DNA naturalmente causa liberação de H+ e, 
consequentemente, uma alteração no pH e na condutividade. No método Ion Torrent, 
vários segmentos de DNA a serem sequenciados estão dispostos em um chip contendo 
um sensor que detecta essa variação no pH e uma DNA polimerase. Um tipo de 
nucleotídeo (A, T, C ou G) é fornecido por vez ao chip. Se o segmento de DNA possui 
determinado nucleotídeo em sua sequência, nessa posição, ele será incorporado e a 
mudança de pH será detectada, do contrário, não ocorrerá reação de incorporação e 
nenhuma alteração é detectada. Assim é possível saber qual nucleotídeo foi adicionado. 
Ciclos de fornecimento de A, T, C e G são constantemente repetidas até que todos os 
segmentos tenham suas fitas complementares formadas e a sequência obtida. Devido a 
essa detecção direta, Ion Torrent é um método de sequenciamento bastante rápido
Outros sequenciamentos de segunda geração são: 454 Roche e Illumina.
Terceira geração
O método de PacBio utiliza uma única molécula de DNA de fita simples que é 
submetida a replicação por DNA polimerase imobilizada em um micro poço. Durante a 
replicação, são utilizados nucleotídeos marcados com fluoróforos de diferentes cores. À 
medida que os nucleotídeos vão sendo incorporados, os fluoróforos são liberados, 
causando emissão de luz em um comprimento de onda específico. A luz é detectada, e 
como a adição de cada nucleotídeo resulta em uma fluorescência diferente, é possível 
identificar a ordem de adição dos nucleotídeos e, portanto, obter a sequência da 
molécula de DNA. PacBio é considerado uma metodologia de alta acurácia.
Quarta geração
O NanoPore é um dos métodos de sequenciamento mais recentes e oferece diversas 
vantagens. O sequenciamento é realizado em um dispositivo portátil e pequeno, que 
contém uma entrada USB que permite o carregamento dos dados a qualquer momento. 
Não há incorporação de nucleotídeos nessa metodologia e a sua praticidade permite que 
sequenciamentos sejam realizados de maneira rápida em qualquer ambiente sem a 
necessidade de muitos recursos. Nessa metodologia, uma única fita da molécula de 
DNA é induzida a passar por um nano poro presente em uma membrana. A cada base 
nucleotídica constituinte da molécula que passa pelo poro, é detectada uma alteração na 
amperagem, que será característica de cada base, permitindo o sequenciamento.
Referencias 
1. MARTINS, Cesar. The next generation sequencing. Botucatu: Unesp, 2013. 
Color.
2. LIFE TECHNOLOGIES. Ion Torrent Amplicon Sequencing. Disponível em: 
<http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/applied_markets_marketing/docume
nts/generaldocuments/cms_094273.pdf>. Acesso em: 10 abr. 2018.
3. PACBIO. Smart Sequencing. Disponível em: <https://www.pacb.com/smrt-
science/smrt-sequencing/>. Acesso em: 10 abr. 2018.
4. OXFORD NANOPORE TECHNOLOGIES. DNA: nanopore 
sequencing. Disponível em: <https://nanoporetech.com/applications/dna-
nanopore-sequencing>. Acesso em: 10 abr. 2018.
Geovaneide de S.N. Teixeira