15ª AULA

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Bibliografia 
•  Lodish H., Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., and Darnell J., Molecular Cell Biology (4ª 
Ed.), Freeman W.H. and Company (USA), Cap 15 (2000). 
•  Campbell N.A., Reece J.B., and Mitchell L.G., BIOLOGY (5ª Ed.), Addison-Wesley, 1999. 
•  Nelson D.L., and Cox M.M., Lehninger – Principles of Biochemistry (4ª Ed.), Freeman W.H. and 
Company (USA), pp 406-408 (2005). 
•  Transporte activo primário. ATPases: características funcionais, características 
estrururais e localização. Ca++-ATPase da membrana plasmática: função e 
características. Permutador de Na+/Ca++: função celular. 
•  Ca++-ATPase do retículo sarcoplasmático: caracterização e função. 
Transporte Passivo 
Difusão simples 
Difusão facilitada 
Transporte Activo 
- ATP + ATP 
Proteínas Transportadoras 
  Difusão Facilitada 
  Não requer ATP; move a favor do gradiente de concentração 
  Canais 
  Canais iónicos 
•  Iões movem a favor do gradiente eletroquímico 
•  Usualmente específico para um tipo de ião 
  Aquaporinas 
  Transportadores 
•  Transportador de glicose 
•  Altera a conformação 
  Transporte Activo 
  Requer ATP; move contra o gradiente de concentração 
  Bombas iónicas 
ATPases 
TRANSPORTE ACTIVO 
Transporte ativo 1º 
Transporte atico 2º 
TRANSPORTE ACTIVO 
K+= 139 mM K+ = 4 mM 
∆G = 2,3 RT log 139/4 + ZF∆Ψ
 = (+ 2,1 Kcal/mol) + (– 1,6 Kcal/mol) 
 = + 0,5 Kcal/mol 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
- 
- 
- 
- 
Movimento K+f K+d não ocorre espontaneamente 
  é necessário energia 
ATPases 
TRANSPORTE ACTIVO 1º 
F = 23063 cal / mol.K 
R = 1,987 cal / mol.K 
T = 12 ºC = 298 ºK 
∆Ψ= -70mV 
ATPases (função) 
* Produção celular de ATP (fundamental) 
 dinitrofenol, FCCP morte celular 
* Manutenção de Na+ , K+ , pH=7,0, Ca++ 
 enzimas celulares estão especializadas para funcionarem em 
 condições muito precisas 
* Manutenção de gradientes iónicos — ∆Ψm 
 Se ∆Ψm a excitabilidade celular perde-se 
* Síntese proteica requer (K+)d elevada 
 Transporte de aa, acúcares requer um gradiente de Na+ 
* Eritrócitos – 50% do ATP é utilizado para o transporte de iões 
 Neurónios – 25% do ATP é utilizado para o transporte de iões
Classes de ATPases 
ATPases – Classe P 
Hormona 
10-3 M Ca++ 
10-7M Ca++ 
CaM-Ca++ 
1ATP 
CaM (Mw = 17 000) – regula a actividade da ATPase da M.P. dos 
 eritrócitos e de outras membranas 
(CaM-Ca) liga alostericamente à enzima activando-a 
Km (Ca++-ATPase) = 1-10 µM elevada afinidade 
Activada por Mg++ 
2Ca++ / 1ATP 
Ca++d Ca-CaM - Ca++-ATPase (possui um local de ligação para Ca-CaM) 
Ca++-ATPase da membrana plasmática 
Ca++-ATPase 
2Ca++ 
A CALMODULINA é uma proteína largamente distribuída no citosol que 
contém 4 locais para ligação de Ca++. Cada mão EF tem um motivo hélice-
alça-hélice. Para concentrações citosólicas de Ca++ superiores a 5x10–7 M, 
a ligação do Ca++ à calmodulina altera a sua conformação. O complexo 
resultante Ca++/CaM enrola-se à volta de hélices expostas da proteína alvo, 
alterando a sua actividade. 
“Switching” mediado pela Ca++/calmodulina 
Estrutura da Calmodulina, proteína de 150 aa, com 4 locais de ligação para o cálcio 
Sítio de ligação de Ca2+ na calmodulina. Calmodulina tem 4 sítios 
de ligação de Ca2+, cada um com um motivo hélice-alça-hélice. O Ca2+ 
liga-se à alça que liga duas hélices. Esse motivo ocorre em várias 
proteínas que ligam Ca2+ e é conhecido como a mão EF. 
As 4 mãos EF, conformações Hélice-
alça-Hélice (nas posições 20, 56, 93 
e 129), ligam iões Ca2+ para afectar 
vários sistemas biológicos: regulam 
um grande nº de enzimas 
dependentes da Ca2+, em particular 
algumas proteína cinases e 
fosfatases, muitas das quais afectam 
sistemas que vão da acção muscular 
e c-AMP até à libertação de insulina. 
E 
F 
E 
F 
Calmodulina 
Proteina cinases e fosfatases, ex. de enzimas moduladas por Ca-CAM 
Esquema da interacção entre o Ca++ e calmodulina e as suas respectivas apoenzimas. A 
ligação sucessiva de 4 iões de Ca++ à CaM induz uma série de alterações conformacionais que 
a tornam mais compacta ocasionando a exposição dum domínio hidrofóbico (DH) que serve de 
interface para a interacção da CaM com as enzimas dependentes da sua acção moduladora. 
Esquema da inactivação da calmodulina pela trifluoperazina. A trifluoperazina (TFP) antagoniza 
a formação do complexo CaM-enzima por ocupação do domínio hidrofóbico (DH) que constitui o 
local de interacção entre as 2 proteínas. Este tipo de ligação da TFP é específico para a CaM e 
depende da ligação de Ca++ à proteína. Contudo a TFP pode ligar-se não especificamente a 
outros locais de ligação, não dependendo, neste caso, da presença de Ca ++. 
Actividade da Ca++-ATPase na presença e na ausência de calmodulina 
  A CaM estimula a actividade de ATPase e de transporte de Ca++ 
  A Trifluoperazina inibe o efeito da CaM 
  As duas actividades (Transporte de Ca++ e Actividade ATPásica) são dependentes de CaM 
  Processos acoplados 
REGULAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE Ca2+ NA CÉLULA 
ATP ADP + Pi 
[Ca2+]=10-7M 
Membrana 
Plasmática 
[Ca2+]=10-3M 
Ca2+ 
ATP ADP + Pi 
Bomba de Ca2+ 
Ca2+ 
Bombas H+ 
Mitocôndria 
Retículo 
Endoplasmático 
Ca2+ 
Ca2+ Citosol 
ATP ADP + Pi 
Ca2+ 
Ca2+-ATPase 
Proteína complexante 
de Ca2+ 
Ca2+ 
Na+-Ca2+ Antiporter 
+ 
Na+ 
+ + 
– – 
+ 
+ - - 
Ca2+ 
- 
Modelo de distribuição de Ca2+ nas células em repouso. Nas células em repouso, a 
baixa (Ca++)livre no citosol é mantida pela extrusão do ião através da membrana 
plasmática, e por acumulação de Ca++ pelas mitocôndrias e pelo RE. Nas células 
“excitáveis” a extrusão de Ca++ é devida à troca com Na+, enquanto que, nas células 
“não-excitáveis” é devida a transporte activo 1º pela Ca++-ATPase. 
•  Menor afinidade por Ca2+ do que a Ca2+-ATPase 
–  Trocador baixa o nível do Ca2+ citosólico para alguns micramolar 
–  Ca2+-ATPase baixa o nível do Ca2+ citosólico para a gama submicramolar 
•  Maior capacidade para extruir Ca2+ do que a Ca2+-ATPase 
–  Trocador pode transportar 2000 Ca2+ /segundo 
–  Ca2+-ATPase pode transportar 30 Ca2+ /segundo 
Permutador Sódio-Cálcio 
Outro exemplo de ATPase da Classe P 
Ca++-ATPase do Retículo Sarcoplasmático das células musculares 
Ca-ATPase do Retículo Sarcoplasmático – Classe P 
1 ATP 2 Ca++ 
2 Ca++ 1-2x10-7 M Ca++ 
1 ATP 
Bomba de Ca++ do Músculo 
80% da proteína membranar; Mw = 100 000 
α-polipetídeo — actividade de ATPase (Km = 10-7 M; alta afinidade) 
RS lúmen Ca total = 10-2 M 
 calsequestrina: Km = 1 mM; 1 mol/43 Ca++ 
 proteína ligadora de Ca++ de alta afinidade; Km = 3-4 µM 
RESERVATÓRIO de Ca++ 
Qual a importância? 
Ca++-ATPase do RS 
Ca++ 
1 ATP 
Ca++ 
Qual a importância? 
Diminui a energia necessária para transportar Ca++ do citosol para o RS 
calsequestrina 
proteína ligadora de Ca++ de alta afinidade 
Proteínas complexantes 
de Ca2+ 
Ca2+ 
Papel da Ca++-ATPase do Retículo Sarcoplasmático