Aula 10 Imobilizacao de enzimas

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Prof. Guilherme Luiz de Castro Carvalho
Farmacêutico-Bioquímico (UFMG)
Mestre em Tecnologia Nuclear (USP)
Doutor em Tecnologia Nuclear (USP)
IMOBILIZAÇÃO 
ENZIMÁTICA
Limitam uso disseminado de enzimas.
 ↑Custo de obtenção e purificação;
 ↓Estabilidade em solução;
INTRODUÇÃO
Encarecem produto final.
Enzimas podem ser utilizadas em diversos processos em escala
laboratorial ou industrial.
Importantes na produção e transformação de matérias-primas.
 Dificuldade de recuperação enzima do meio reacional.
IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
Utilização enzimas na forma Imobilizada
Visando obtenção de reações com:
• Maior uniformidade tecnológica;
• Viabilidade econômica.
Enzimas imobilizadas (insolubilizadas)
Enzimas confinadas, ou localizadas em região definida do espaço, com
retenção de suas atividades catalíticas.
ENZIMAS LIVRES x IMOBILIZADAS
LIVRES IMOBILIZADAS
Instabilidade
↑estabilidade (Faixas mais amplas 
de pH e temperatura; ↓interferência 
de inibidores e/ou ativadores)
Alto custo ↓custo
Não regeneração Reutilização
Dificuldade 
controlar reação
↑controle da reação
IMOBILIZAÇÃO ENZIMAS
Objetivo:
Liga enzimas, por meios químicos ou físicos, a suportes inertes. 
Área da tecnologia enzimática que reúne as técnicas que permitem a
utilização desses catalisadores repetida e continuamente.
Obter vantagens no uso de enzimas em contraposição às
desvantagens de alto custo e baixa estabilidade das preparações.
Negativo: Impedimento estérico da molécula de substrato.
 Modificação química da molécula:
Positivo: Substrato não sofre impedimento estérico pela matriz.
Negativo: Alterações no sítio ativo podem tornar enzima inativa.
 Ligação física da enzima em uma matriz inerte:
Positivo: Maior velocidade de reação e facilidade no preparo.
MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃO
 Enzimas insolúveis:
 Enzimas solúveis:
Após imobilização em material sólido, passam a constituir fase diferente do meio
de reação, geralmente líquido.
Enzima permanece na mesma fase em que estão os substratos (reagentes) e
os produtos da reação.
IMOBILIZAÇÃO ENZIMAS SOLÚVEIS
Enzima livre contida em câmara ou compartimento, através do qual
substrato (reagente) passa e é convertido em produto.
Enzimas que mantêm sua solubilidade inalterada.
Separadas do restante da solução por membranas semipermeáveis,
fibras porosas ou membranas de ultrafiltração.
Permite utilização contínua e prolongada da enzima.
IMOBILIZAÇÃO ENZIMAS SOLÚVEIS
 Imobilização sem modificação química da enzima
Enzima nativa aprisionada em câmara por membrana ou fibra,
impermeáveis à enzima, porém permeáveis ao substrato e produto.
Enzima não sofre qualquer alteração em seu microambiente.
Capaz passar pelos poros do sistema.
Limitação:
 Produtos da reação devem ser moléculas pequenas.
 Imobilização com modificação química da enzima:
Retenção por membranas com porosidade elevada.
∆ química na enzima, pela ligação de compostos de massa molar
variada, sem alterar solubilidade e atividade catalítica da enzima.
↑Massa molar e diâmetro da enzima 
IMOBILIZAÇÃO ENZIMAS INSOLÚVEIS
Enzima sofre modificação no seu microambiente.
Enzima sofre modificação na solubilidade, passando a operar em fase
diferente do solvente, onde estarão presentes os substratos e produtos.
 Aprisionamento:
 Matriz (Gel);
 Cápsula (Fibra);
 Microcápsula.
 Ligação ao suporte:
 Adsorção;
 Iônica;
 Covalente.
 Ligação cruzada (Cross-linking):
 Inclusão em uma matriz;
 Encapsulação;
 Microencapsulação.
Imobilização por inclusão ou Aprisionamento:
 Enzima retida na rede tridimensional de polímero insolúvel na água;
Aprisiona ou enclausura enzima no interior de matriz polimérica, cápsulas
ou microcápsulas delimitadas por membrana semipermeável;
 Enzima não estabelece ligação química com suporte;
Tipos:
IMOBILIZAÇÃO ENZIMAS INSOLÚVEIS
 Possibilita entrada e saída do substrato e produto, mas não da enzima.
 Conserva a sua integridade molecular.
INCLUSÃO EM UMA MATRIZ
Consiste no aprisionamento moléculas de enzimas em malhas de
polímero geliforme.
Proteínas: Colágeno, Gelatina, Albumina.
 Simples ligação física entre enzima e suporte;
Não emprega reagentes químicos.
 Limitações difusionais são intensas.
Matriz
Polímeros sintéticos: Silicone, Poliacrilamida, Nylon.
Polissacarídeos: Alginato, Quitosana, Pectina.
 Sem risco de desnaturação;
INCLUSÃO MATRIZ - ALGINATO DE CÁLCIO
ENCAPSULAMENTO
Enzima é imobilizada no interior de esferas, cujo envoltório é constituído por
um polímero geliforme e semipermeável.
Poliacrilamida
E E
E E
E
E
E
E
ENCAPSULAMENTO
Acetato de celulose
Enzima em solução 
alginato de sódio
Solução CaCl2 contendo 
íon bivalentes (Ca+2)
Gotejada
Gota alginato entra em 
contato com solução CaCl2.
Forma-se uma esfera, dentro da qual 
Enzima é retida (membrana = 
polímero de alginato de cálcio)
E E
ENCAPSULAMENTO
Preparação de sistema emulsionado, onde enzima está confinada no
interior das micelas.
 Polimerização pode provocar desativação da enzima.
MICROENCAPSULAMENTO
 Não encapsular enzima que destruam a matriz polimérica;
 Enzimas hidrolíticas são inadequadas para microencapsulamento;
Pois substrato geralmente tem alto peso molecular.
Solução aquosa 
enzima
Hexametilenodiamina Fase orgânica
Emulsificante
Cloreto sebacila
Obtém-se as gotículas da solução 
enzimática envolvidas por 
película semi-permeável
Resultante da 
polimerização da diamina 
com cloreto sebacila.
MICROENCAPSULAMENTO
Imobilização ligação ao suporte
Ligação da enzima a suportes insolúveis, gerando uma fase
diferente do meio reacional, onde enzima está fixada.
IMOBILIZAÇÃO ENZIMAS INSOLÚVEIS
Classificada de acordo com tipo de ligação da enzima com suporte.
 Adsorção;
 Iônica;
 Covalente.
Enzima deve ser fixar tão solidamente quanto possível.
 Fixação das enzimas sobre suporte sólido
Depende natureza química do suporte e da enzima.
IMOBILIZAÇÃO POR ADSORÇÃO
União entre enzima e suporte inerte através de adsorção física.
Método simples e rápido de aplicabilidade generalizada. 
 Mistura suporte insolúvel à solução de enzima (condições adequadas);
 Separa suporte com enzima adsorvida do meio de reação.
Limitação:
Condições ótimas de imobilização mantidas para não alterar sistema.
Carvão ativado, óxidos metálicos, vidros, resinas poliméricas.
Suportes: 
Enzima se une ao suporte através de atrações eletrostáticas.
 Cargas opostas presentes no suporte e na enzima.
IMOBILIZAÇÃO IÔNICA
Grupos funcionais ionizáveis do suporte interagem 
especificamente com grupos da enzima.
Condições monitoradas pra preservar integridade do sistema.
Limitação: 
IMOBILIZAÇÃO IÔNICA
Polianilina 
IMOBILIZAÇÃO IÔNICA
IMOBILIZAÇÃO POR LIGAÇÃO COVALENTE
Grupos suporte (aminoalquila, aminoarila, 3-glicidoxipropil-carboxila) são
ativados por reagente específico (ex: glutaraldeído) que introduz grupo
carbonila para reagir com grupos nucleofílicos da enzima.
glutaraldeído
Lisina e arginina (NH2), ácido aspártico e glutâmico (COOH), 
Serina e tionina (OH) e Cisteína (SH). 
Formação ligações covalentes entre grupos funcionais na superfície do
suporte insolúvel e grupos funcionais dos resíduos de aminoácidos da enzima.
IMOBILIZAÇÃO POR LIGAÇÃO COVALENTE
IMOBILIZAÇÃO POR LIGAÇÃO COVALENTE
Grupos importantes para atividade catalítica não devem se envolver
na formação da ligação covalente entre enzima e suporte.
Suportes:
Inorgânicos, polímeros naturais e sintéticos.
Ex: Vidro; Sílica; Sephadex; Celulose; Nylon e Poliestireno.
Vantagens:
 Maior eficiência e estabilidade.
 Não são tão suscetíveis a pH, força iônica, solventes e temperatura.
Condições mais drásticas e maior número de etapas de reação (↑tempo).
Limitação:
Enzimas ligadas umas às outras, formando estrutura tridimensional 
complexa (sistema reticulado).
IMOBILIZAÇÃO LIGAÇÃO COVALENTE CRUZADA
Cross linking
 Livre de suporte.
Ligação covalente entre moléculasde enzima e reagentes bifuncionais de
↓massa molar, formando agregados unidos por ligações intermoleculares.
 Rápida reação com grupos amino superficiais da molécula de enzima
Carbodiimida = fácil reação com grupos carboxilas.
IMOBILIZAÇÃO LIGAÇÃO COVALENTE CRUZADA
Não envolve associação da enzima com suporte sólido.
Glutaraldeído é o reagente bifuncional de primeira escolha.
Produto da ligação de várias moléculas enzima pelos reagentes bifuncionais
se torna insolúvel e precipita, formando agregado sólido cataliticamente ativo.
MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃO
Métodos Imobilização Enzimas
Aprisionamento
Ligação em 
Suportes 
Sólidos
 Adsorção (carvão ativo)
 Ligação Covalente (celulose, sílica)
 Ligação Iônica (celulose)
Matriz MicrocápsulaCápsula
Ligação covalente 
cruzada
(crosslinking)
EFEITOS CAUSADOS PELA IMOBILIZAÇÃO
Por mais suave que seja o procedimento, é razoável esperar algum tipo de
efeito sobre sua atividade catalítica.
(c) e (d) previnidos usando espaçadores ou realizando imobilização na presença 
de substrato
INFLUÊNCIA IMOBILIZAÇÃO NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA.
Invertase
EFEITOS IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
Dentre vários efeitos que a imobilização pode causar salienta-se:
 Resistência difusionais externas
 Efeitos difusionais internos
 Modificação da estrutura tridimensional
 Efeitos estéricos e de conformação
 Efeitos de Microambiente
 Efeitos difusionais
 Interação enzima - suporte é quase sempre aleatória.
Enzima ligada ao suporte, sofre alguma mudança na conformação,
abalando sua eficiência catalítica.
EFEITOS DE MICROAMBIENTE:
Comportamento cinético de enzima presa a suporte carregado pode
diferir do apresentado pela enzima livre.
Região do sitio ativo torna-se menos acessível ao substrato.
IMPEDIMENTO ESTÉRICO:
Enzima ligada a suporte sujeita a circunvizinhança diferente, podendo
refletir sobre parâmetros cinéticos.
EFEITOS IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
EFEITOS DIFUSIONAIS:
Se velocidade difusão substrato for < que velocidade de transformação
pela enzima, a velocidade da reação será reduzida, já que nem todas
moléculas de enzimas estarão em contato com o substrato.
EFEITOS IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
Para enzima imobilizada sobre ou dentro de suporte sólido, o substrato e o
produto devem ser capaz de difundir através do suporte.
VANTAGENS IMOBILIZAÇÃO ENZIMÁTICA
 Maior resistência a variações de pH e tratamentos térmicos;
 Podem ser reutilizadas;
 Continuidade dos processos químicos;
 Maior controle dos processos químicos;
 Facilidade separação produtos;
 Redução problemas com efluentes;
 Maior repetibilidade do processo;
 ↑Estabilidade;
 ↓custos.
DESVANTAGENS
 Aleatoridade da interação enzima-suporte;
 Inexistência de um método geral de imobilização;
  atividade catalítica.
Efeitos: Difusionais; Estéricos / Conformacionais e Microambiente
TIPOS DE SUPORTE
Classificação de suportes inertes:
Ex: Atividade esterase de Bacillus subtilis imobilizada em vários
suportes e por diferentes métodos.
TIPOS DE SUPORTE
Geralmente condições de imobilização para uma enzima só podem ser
estabelecidas empiricamente.
Enzima Imobilizar
Vários Suportes e 
Diferentes Métodos
Avaliar a Atividade do 
Sistema
Escolher o suporte e o 
método que apresentam > 
atividade
TIPOS DE SUPORTE
Não existe método geral de imobilização e nem suporte universal. 
TIPOS DE SUPORTE
Características
Inter-
cruzamento
Adsorção
física
Enlace 
Iônico
Complexação
Metálica
Enlace 
Covalente
Retido
Preparação Média Simples Simples Simples Difícil Difícil
Força de união Forte Fraca Média Média Forte Média
Atividade Enzimática Baixa Média Alta Alta Alta Baixa
Regeneração do 
suporte
Impossível Possível Possível Possível Rara Impossível
Custo da
imobilização
Médio Baixo Baixo Médio Alto Médio
Estabilidade Alta Baixa Média Média Alta Alta
Aplicabilidade Não Sim Sim Sim Não Sim
Proteção da enzima 
contra 
microrganismos
Possível Não Não Não Não Sim
DIFERENTES TÉCNICAS IMOBILIZAÇÃO