Cromatografia: Método de Separação

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Faculdade 
Bezerra de 
Araújo
Prof. Jonas Santos
21/10/2021
Cromatografia: modo de separação
Cromatografia
 A cromatografia é um
método físico-químico
de separação e está
fundamentada na
migração diferencial dos
componentes de uma
mistura, que ocorre
devido a diferentes
interações, entre duas
fases imiscíveis: fase
móvel e a fase
estacionária.
Chromatotron
10/21/2021
Cromatografia em Camada Delgada 
(CCD)
Consiste na 
separação dos 
componentes de 
uma mistura, 
onde a fase 
móvel (líquida) 
migra sobre uma 
camada fina de 
adsorvente 
retido em uma 
superfície plana 
(fase estacionária 
– sólida)
Sílica: lipofílicos, 
aldeídos, cetonas, 
fenóis, ácidos 
graxos, 
aminoácidos, 
alcalóides, 
terpenóides e 
esteróides.
Alumina: 
compostos 
lipofílicos.
Fase móvel: 
série 
eluotrópica
n-hexano
Ciclo-hexano
i-propiléter
Tolueno
Benzeno
Éter dietílico
Clorofórmio
Diclorometano
Acetona
Acetado de etila
Nitrometano
Acetonitrila
n-propanol
Etanol
Metanol
Ácido acético
Água
Sais
Tampões
Ureia 
M
en
os
 p
ol
ar
M
ais polar
Desativam a sílica
Fator de 
retenção (Rf): 
é relativo ao 
caráter polar 
da substância

 dc: distância percorrida pelo componente da mistura
 ds: distância percorrida pelo solvente (eluente)
 Reprodutibilidade: 
 Sistema de solvente utilizado
 Adsorvente
 Espessura da camada de adsorvente
 Quantidade relativa de analito
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Preparo de placa 
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Placa 
 Pré-fabricadas: com ou sem indicadores de fluorescência
 Semi-preparativas: adsorvente misturado a água ou outro 
solvente, formando uma pasta é aplicada sobre uma 
superfície plana (vidro ou alumínio).
 Secagem lenta para não formar rachaduras
 Ativação de sílica (estufa)
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Semi-preparativa
Ativação de 
placas
 Deve-se ativar as placas para retirar substâncias aderidas ao 
adsorvente
 A ativação é um aquecimento e varia para cada adsorvente
 Sílica, alumina e terra diatomácea: 105°C-110°C por 30-60min
 Celulose: 105°C até no máximo 10min
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Amostra 
 O analito é dissolvido em solvente volátil
 Soluções não muito diluídas, nem muito concentradas
 Aplicar a amostra com auxílio de capilar
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Fase móvel
 O objetivo é a maior separação possível, maior Rf entre os 
compostos da mistura
 Testes preliminares são necessários para ajuste da 
polaridade
 Melhores resultados são obtidos com misturas de solventes
 Método dos anéis concêntricos para testar solvente
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Eluente Β-naftol
(Rf)
p-toluidina 
(Rf)
CH2Cl2 0,375 0,500
CH2Cl2/EtOAc 25% 0,700 0,575
CH2Cl2/EtOAc 50% 0,775 0,625
CH2Cl2 CH2Cl2/EtOAc 25% CH2Cl2/EtOAc 50%
Cuba 
cromatográfica
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 Recipiente com tampa onde é realizado a corrida
 Nível de solvente deve ficar abaixo dos pontos de aplicação 
da amostra
 Papel de filtro é colocado na parede da cuba para facilitar a 
saturação
Cuba 
cromatográfica
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Métodos 
reveladores
 Método físico: compostos UV-ativos, que aparecem como 
manchas em fundo fluorescente, se a placa for iluminada com 
lâmpada de luz ultravioleta.
 Método químico: quase todas as classes de substâncias orgânicas 
(exceto alcanos e haletos alifáticos) reagem com iodo farmando
complexos. A formação desses complexos é reversível.
 Compostos coloridos: possuem cromóforos visíveis a olho nú
(comprimentos de onda na região do visível – 400-750 nm)
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Métodos 
reveladores
 Revelação por luz ultravioleta (254 ou 364 nm): indicado porá 
substâncias com cromóforos (sistemas conjugados), pois 
absorvem radiação UV e tornam-se fluorescentes.
 Revelarção com vapores de iodo: revelador universal para 
qualquer substância orgânica. Forma manchas marrons.
 Métodos químicos (destrutivos): a solução reveladora é 
borrifada. Após aquecimento ocorre a reação da substância com o 
revelador formando manchas coloridas.
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Revelando CCD
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Alcalóides: Dragendorff, iodoplatinado
(Bi(NO3)3 + KI)
Antioxidantes: β-caroteno
Saponinas, terpenos e esteróides:
anisaldeído sulúrico
Fenólicos: FeCl3
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Vantagens e 
desvantagens
• Fácil execução
• Rapidez
• Boa resolução
• Baixo custo
• Versatilidade
• Acompanhar 
reações usando 
padrões
• Difícil 
reprodutibilidade
• Cuidado da na 
determinação exata 
do Rf
• Método qualitativo
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Fontes de 
erros
 A) placa foi mal cortada ou caiu de forma errada na cuba
 B) cuba não está saturada com vapor
 C) defeito no corte da placa, pode ter desprendido sílica
 D) analito muito concentrado
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(A) (B) (C) (D)
Erro na 
escolha do 
solvente
 A) solvente muito polar
 B) solvente muito apolar
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(A) (B)
Aplicações 
 Análise qualitativa de misturas de substâncias
 Monitoramento de síntese
 Controle de qualidade
 Análise preliminar para técnicas mais robustas
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Prof. Jonas Santos
princípio de cromatografia de papel
 O princípio envolvido é a cromatografia de partição em que as substâncias são
distribuídas ou particionadas entre as fases líquidas. Uma das fases é a água, que
fica retida nos poros do papel de filtro utilizado; e outra é a fase móvel que se
move sobre o papel. Os compostos da mistura se separam devido às diferenças de
afinidade com a água (em fase estacionária) e com os solventes da fase móvel
durante o movimento da fase móvel sob a ação capilar dos poros do papel.
 O princípio também pode ser a cromatografia de adsorção entre as fases sólida e 
líquida, em que a fase estacionária é a superfície sólida do papel e a fase líquida é a 
fase móvel. Mas a maioria das aplicações da cromatografia em papel funciona com 
base no princípio da cromatografia de partição, ou seja, dividida em fases líquidas.
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Usos e 
aplicações
 A cromatografia em papel é especialmente usada para a 
separação de uma mistura contendo compostos polares e não 
polares.
 Para separação de aminoácidos.
 É usado para determinar compostos orgânicos, bioquímicos na 
urina, etc.
 No setor farmacêutico, é utilizado para a determinação de 
hormônios, medicamentos, etc.
 Às vezes, é usado para avaliação de compostos inorgânicos como 
sais e complexos.
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Classificação 
 Cromatografia ascendente: Como o nome indica, o 
cromatograma ascende. Aqui, o desenvolvimento do papel ocorre 
devido ao movimento do solvente ou deslocamento para cima no 
papel.
 O reservatório de solvente está na parte inferior do copo. A ponta 
do papel com manchas de amostra apenas mergulha no solvente 
na parte inferior para que as manchas permaneçam bem acima do 
solvente.
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Classificação 
 Cromatografia descendente: aqui, o desenvolvimento do papel 
ocorre devido ao deslocamento do solvente para baixo no papel.
 O reservatório de solvente está no topo. O movimento do solvente 
é auxiliado pela gravidade além da ação capilar.
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Classificação 
 Modo radial: aqui, o solvente se move do centro (ponto médio) 
para a borda do papel de cromatografia circular. Todo o sistema é 
mantido em uma placa de Petri coberta para o desenvolvimento 
do cromatograma.
 O pavio no centro do papel mergulha na fase móvel em uma placa 
de Petri, pela qual o solvente escorre para o papel e move a 
amostra radialmente para formar os pontos de amostra de 
diferentes compostos como anéis concêntricos.
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