Apostila módulo 4 (1)

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Apostila
Módulo 4
Maria de Lourdes M. de Souza 
Doutora em Química de Produtos Naturais
Monalisa Santana C. de Jesus
Mestre em Química
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Todos os direitos reservados.
A reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou em parte, 
constitui violação dos direitos autorais (Lei nº 9.610).
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 Cromatografia Liquida de Alta Eficiência
 Sistema de solventes
 Bomba
 Injetor
 Coluna
 Detectores
Módulo 4
.
CLAE 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
HPLC – É uma abreviação do nome em inglês :
High Performance (Pressure) Liquid Chromatography.
 CLAE é um tipo de cromatografia que usa um líquido como fase móvel,
geralmente uma mistura de 2 a 4 solventes, e uma fase estacionária de
partículas muito pequenas, especialmente preparadas e empacotadas em
colunas que resistem a alta pressão, necessitando de uma bomba de alta
pressão, para eluir a FM através da FE.
 É uma técnica capaz de realizar separações de misturas complexas e
quantificar uma grande quantidade de seus componentes com alta
resolução, sensibilidade e eficiência.
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Instrumentação básica da CLAE
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Instrumentação básica da CLAE
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Características da Fase Móvel (FM)
 Ser de alto grau de pureza ou fácil purificação (filtrado
em membrana de 0,45 mm);
 Dissolver a amostra sem decompor seus componentes;
 Não decompor nem dissolver a fase estacionária;
 Ter baixa viscosidade;
 Ser compatível com o tipo de detector;
 Ter polaridade adequada para permitir a separação dos
componentes da amostra
Além disso, deve-se considerar:
 Propriedades físico-químicas adequadas para
separação
 Segurança e
 Custo
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Reservatório para a Fase Móvel (FM)
Degaseificação da FM:
Garantir a reprodutibilidade da vazão e;
Estabilidade da linha base.
Filtro do reservatório:
Captar a fase móvel e evitar que 
partículas suspensas na FM obstruam os 
capilares ou contaminem a bomba.Fot
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Bombas Recíprocas:
Vantagem:
Alta pressão de saída (10.000 spi);
Pequeno volume interno;
Mudança da fase móvel;
Eluição por gradiente;
Vazões constantes.
Desvantagens:
Fluxo pulsado que deve ser atenuado (uso de
amortecedor);
Cavitação (bolhas) devido à compressão.
Sistema de bombeamento
Isocrático
A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou
mistura de solventes), ou seja,
A composição da fase móvel permanece constante ao
longo de toda a análise.
Capaz de separar um número limitado de analitos.
Gradiente
A composição da fase móvel varia durante a análise.
Sistema de solventes depende da polaridade das
substâncias a serem analisadas e dos interferentes
presentes na amostra.
Separação de amostras complexas.
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Exemplos de corridas isocráticas
Fonte: HPLC (2020).
Baixa resolução ente 
os picos 2 e 3
Boa resolução mas tempo de 
análise muito longo30% B
40% B
50% B
35% B
Exemplo de corrida em gradiente
Fonte: HPLC (2020).
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Injetor automático
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Sistema de Injeção
INJEÇÃO MANUAL
 A amostra é introduzida com seringa na posição de 
carregar (Load).
 Após virar a válvula para a posição de injetar (Inject), a 
amostra é carregada pela fase móvel até o início da 
coluna.
AMOSTRADOR AUTOMÁTICO
 As amostras são postas em um frasco e os frascos 
dentro do amostrador.
 O amostrador automático :
1 - Mede o volume correto para injeção.
2 - Injeta a amostra.
3 - Prepara o injetor para uma próxima amostra.
Coluna
Geralmente em aço inox ( mais popular, maior pressão);
Coluna de vidro reforçado (até 600 psi, utilizada para 
biomoleculas);
PEEK polímero ( biocompatível e quimicamente inerte com 
a maioria dos solventes).
A escolha de uma coluna apropriada é o ponto 
crítico para o sucesso da análise.
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Coluna = Fase Estacionária
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Coluna = Fase Estacionária
As colunas são “recheadas” com partículas porosas, com 
diâmetro de 1,8 – 5 μm.
Partículas porosas com fase ligada quimicamente, que separa 
os componentes da amostra.
Desenvolvimento das partículas 
Fonte: Meneses (2020).
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 Utilização de pré-coluna;
 Limpeza da coluna: eliminar sais , tampões e aditivos de FM após o
uso. Realizar a limpeza periodicamente, a fim de restaurar ou ativar
a fase estacionária;
 Guardar a coluna com as extremidades vedadas com as tampas
de proteção para evitar perda de sua fase móvel ou contaminações;
 Sentido: deve-se ter um cuidado especial para que não seja
invertido o sentido de injeção realizado em sua primeira utilização;
 Evitar choques de pressão, térmicos e mecânicos: as colunas
não devem sofrer choques para evitar desestabilização das fases
estacionária e móvel no seu interior;
 Filtração e pureza da fase móvel:. os solventes utilizados devem
ter pureza cromatográfica;
 pH: respeitar as faixas de pH recomendadas pelo fabricante da
coluna. Evitar faixas extremas de pH, < 2 ou > 8.
Cuidados com as Colunas
 Precipitações: o pré-tratamento da
amostra deve considerar a eliminação
de partículas e impurezas que podem
ser adsorvidas, evitar precipitações
avaliando as características das
amostras a serem analisadas e
escolher a fase móvel adequada para
que não ocorra problemas de
precipitação.
Cuidadoscom as Colunas (cont.)
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Características ideais de um 
detector para CLAE
O detector é a parte do equipamento que permite “ver” e localizar, 
no tempo e no espaço, a passagem de cada substância da 
amostra, na saída da coluna cromatográfica. O detector transforma 
a variação da concentração do analito, em um sinal elétrico 
proporcional. Deve:
 Ter sensibilidade e seletividade adequada;
 Ter boa estabilidade e reprodutibilidade;
 Fornecer resposta em uma ampla faixa linear;
 Ter baixo volume interno;
 Fornecer resposta rápida independente da vazão;
 Não destruir a amostra;
 Ter similaridade de resposta a todos os solutos.
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Detectores mais utilizados
1. Detector por índice de refração;
2. Detector por espectrofotometria; 
Uv/Visível (monocromático e DAD);
3. Detector por fluorescência;
4. Detector por condutividade elétrica;
5. Detector por espectrometria de massas.
Detector por Índice de Refração
Mede a diferença do índice de refração entre a fase móvel e as
substâncias eluídas da coluna.
O IR é uma medida da capacidade de uma molécula em desviar
a luz em uma fase líquida.
A quantidade de deflexão é proporcional à concentração.
O detector IR é considerado universal porém, pouco sensível e
sofre com a variação da temperatura.
Fonte: Introdução... (2008).
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Detector por Espectrofotometria 
UV/visível
A concentração do analito na amostra se determina pela aplicação da
lei de Lambert-Beer:
A = ε.b.C
Onde: A = absorbância,
ε = absortividade molar do analito,
b = caminho ótico da célula (cm) e,
C = concentração do molar analito (moles/L).
Fonte: Espectrofotometria...(2016).
Esquema Detectores 
espectrofotométricos
UV/Vis. com λ variável
DAD
Detector por Arranjo de Diodos
Lâmpada de Tungstênio
Lâmpada de Deutério
Lentes
1024 Diodo
Filtro de óxido de 
hólmio
Célula de amostra
Fenda programável
Grade de difração
Lâmpada de Tungstênio
Lâmpada de Deutério
Lentes
1024 Diodos
Filtro de óxido de 
hólmio
Célula de amostra
Fenda programável
Grade de difração
Diodo da 
amostra
Lâmpada de Deutério
Lentes
Filtro de óxido de 
hólmio
Filtro de óxido de 
hólmio
Fenda
Célula 
de 
amostra
Grade de 
difração
Espelho
Espelho
Diodo de 
referência
divisor 
de feixe
190nm
950nm
Fonte: Siqueira...(2019).
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DAD
Detector por Arranjo de Diodos
Fonte: Rosolia (2020).
Detector por Fluorescência
.
fotomultiplicador
foto-
multiplicador
de controle
rede de 
difração
célula de 
fluxo
Monocromador de emissão Monocromador de excitação
modulador
lâmpada de Xenônio
fenda
rede de 
difração
Fonte: Meneses (2020).
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Detecção por condutividade
A detecção por condutividade é o método de detecção 
padrão na cromatografia de íons.
Ela é empregada para detectar uma vasta gama de 
analitos, passando por ânions, cátions e até aminas.
Fonte: Rosolia (2020).
Espectrometria de Massas
Técnica que analisa íons em fase gasosa, separa 
esses íons pela sua razão massa/carga (m/z), 
identifica e quantifica a abundância de seus 
respectivos íons m/z.
Antes da separação no MS as moléculas devem 
ser convertidas em íons;
Os íons são separados em função de suas razões 
massa-carga (m/z).
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Referências
BERGQUIST, C. W. L C School: Escola de Cromatografia Líquida waters. Waters 
Commercial: 1999. Apostila do curso avançado de 40h em Cromatografia Líquida de Alta 
Eficiência.
COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.;BONATO, P. S.(org.) Fundamentos de cromatografia. 5. ed. 
Campinas: Editora da UNICAMP, 2006. 452 p.
HPLC: High Performance Liquid Cromatography. Cromatografia Líquida de Alta 
Performance. Cromatografia Líquida de Alto Desempenho. Cromatografia Líquida de Alta 
Eficiência (CLAE). UFJF, 2016. 29 p. Aula. Disponível em: 
www.ufjf.br/quimica/files/2016/08/AULA-HPLC.pdf . Acesso em: 9 abr. 2020.
GONÇALVES, L. M. Cromatografia líquida. FL1201 Química Analítica Instrumental. 
Diurno1º semestre 2019. 11 maio 2019. USP. Disponível em: 
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4686635/mod_resource/content/1/Aula%2010%20L
C.pdf. Acesso em: 19 fev. 2020. 48 slides. online.
INTRODUÇÃO aos métodos cromatográficos. Disponível em: 
https://www.slideshare.net/IsabelleMacedo/cromatografia-64106182. Acesso em: 19 fev. 
2020. Acesso em: 19 fev. 2020. 130 slides. Online.
MAY, T. Laboratório de óleos essenciais . 2015. 1 fotografia. Color. Banco Multimídia 
Embrapa. Brasília, DF: Embrapa. (Embrapa Agroindústria de Alimentos). Img. 6590. 
Disponível em: http://sistemas.sede.embrapa.br/bme/handle/item/2578. Acesso em: 9 abr. 
2021.
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Equipe responsável 
Embrapa Agroindústria de alimentos
Nome Atribuição
Maria de Lourdes Mendes de Souza Gestora do projeto do curso, Conteudista, 
Diagramadora e Produtora de vídeo
Monalisa Santana Coelho de Jesus Conteudista e Diagramadora
Rosemar Antoniassi Conteudista e Revisora de texto
André Luis do Nascimento Gomes Programação Visual, Gestor da Marca e 
Comunicação
Natalia Souza Merces Revisora de texto, Suporte técnico e
Comunicação
Luciana Leitão Mendes Revisora de texto e Comunicação
Kadijah Suleiman Jaghub Comunicação
Camila Stephan Marques da Silva Designer Instrucional
Leandro Goncalves de Souza Leão Suporte técnico
Celma R. M. de Araújo Normalizacão bibliográfica .
MAY, T. Cromatografia gasosa e espectometria de massas . 2015. 1 fotografia. 
Color. Banco Multimídia Embrapa. Brasília, DF: Embrapa. (Embrapa Agroindústria de 
Alimentos). Img. 3706. Disponível 
em: http://sistemas.sede.embrapa.br/bme/handle/item/2899.
MENESES, G. B. Cromatografía liquida de alta eficacia. UNSA. Facultad de Ciencias
Naturales y Formales. Arequipa. 9 dez. 2013. Disponível em: 
https://es.slideshare.net/GabBerriosMeneses/hplc-29034181 Acesso em: 19 fev. 
2020. 57 slides. online. 
PIOVEZAN, M. Cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE (High performance liquid
chromatography – HPLC). Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia. 
Florianópolis, SC. Disponível em: 
https://docente.ifsc.edu.br/marcel.piovezan/MaterialDidatico/AIN%202/AIN%202_Aula%202
_HPLC%20Instrumenta%C3%A7%C3%A3o.pdf. Acesso em: 19 fev. 2020. 37 slides. 
Online.
ROSOLIA,A. Cromatografia e suas aplicações em purificação de proteínas e 
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aplicacoes-em-purificacao-de-proteinas-e-peptideos-alexandre-rosolia-assessor-tecnico-
hplc.html. Acesso em: 19 fev. 2020. 81 slides. online.
SIQUEIRA, G. Cromatografia líquida de alta eficiência. A3 Analítica Consultoria & 
Treinamento. 2019. Disponível 
em: https://a3analitica.com.br/bloga3pharma/2019/01/08/principios-de-cromatografia-a-
liquido-hplc/ . Acesso em: 14 abr. 2021
.