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1 Bioterismo Classificação dos animais Cuidados com a saúde dos animais Genética Classificação dos biotérios: • Quanto a finalidade (criação, manutenção e experimentação) – vide resumos anteriores Classificação dos animais: • Quanto ao status sanitário/condição sanitária • Quanto ao status genético/condição genética Classificação quanto ao status sanitário 1. Convencionais (haloxêmicos) 2. Gnotobióticos a. Germfree (GF) b. Flora Definida (FD) 3. Livres de Germes Patogênicos Específicos (SPF) Relação dos animais com seu meio ambiente particular e específico. Isso inclui: • Organismos associados aos animais • Organismos presentes dentro dos limites do ambiente físico e barreiras sanitárias Basicamente é a microbiota, o conjunto de organismos associados. Vírus, bactérias e parasitas. Quando mais eficientes as barreiras sanitárias, menores as chances de contaminação dos animais de experimentação. Importante saber a origem do animal e as condições em que eles são mantidos durante a experiência, para assim podermos encaixar o animal no grau correto. 1. Convencionais (haloxênicos): animais que possuem microbiota indefinida por serem mantidos em ambiente desprovido de barreiras sanitárias rigorosas. As barreiras utilizadas nos animais convencionais são os princípios básicos de higiene – limpeza e desinfecção do ambiente e material utilizado e troca de uniformes (avental) para o trabalho com esses animais. São usualmente criados em sistemas de gaiolas abertas e em condições de livre acesso, sendo sujeitos a novas infecções. 2. Gnotobióticos (vida conhecida): possuem microbiota associada definida, não conhecida ou não detectável, e devem ser criados em ambientes dotados de barreiras sanitárias absolutas. Eles vivem e são produzidos em isoladores e são originados a partir de animais Germfree. Exemplos de materiais dos isoladores: inox e fibra de vidro. a. Germfree (GF) (axênicos): animais totalmente livres de microbiota, ou seja, isentos de parasitas internos e externos, bactérias, fungos, protozoários, richetsia e vírus. Eles são o primeiro degrau para atingirmos os animais de flora indefinida (FD) e SPF. Várias espécies foram estudadas em ambiente GF, mas os ratos e camundongos foram os que melhor responderam a ele. Porém existem alguns microrganismos, como bactérias e vírus, que possuem maior resistência e podem ser adquiridas por transmissão vertical (exemplo: vírus da Cório Meningite Linfocítica). A testagem de colônias deve ser realizada. Utilização: estudo de imunologia, câncer, radiações, doenças entéricas, dentárias, nutricionais etc. Obtenção: intervenção cirúrgica em fêmea gestante. É realizada a histerectomia estéril do útero gravídico e introdução dele em isolador estéril, onde os animais serão mantidos sob procedimentos de manipulação extremamente rigorosos para mantê-los livres de germes. Como ocorre: Os embriões em desenvolvimento são protegidos da contaminação pela barreira placentária, limitando o tipo e quantidade de material que entra em contato com o feto. O desafio da obtenção do animal GF está na hora do parto, que é quando o filhote entra em contato com organismos do meio externo pela primeira vez. 2 A histerectomia ocorre 24h antes do parto e, muitas vezes, esses filhotes precisam ser reanimados após o parto. Os recém-nascidos obtidos assepticamente nos isoladores estéreis têm a opção de usar uma ama-de- leite GF ou amamentação manual para mantê-los, mas geralmente é utilizada a ama-de-leite. b. Flora Definida (FD): são animais GF intencionalmente contaminados com microrganismos específicos. Após essa contaminação, o animal pode se enquadrar em: • Monoxênico: contaminado com um tipo de microbiota • Dixênico: contaminado com dois tipos de microbiota • Polixênico: contaminado com vários tipos de microbiota Obtenção: transferência de animal Germfree de seu isolador para um de barreira restrita. Ele pode ser alimentado com ração saturada com microrganismos específicos ou através da amamentação, cama e fezes de seus pais. Pode ser inoculada uma cultura pura dos contaminantes selecionados. Utilização: restabelecer relação entre flora entérica selecionada e taxa de crescimento, susceptibilidade à infecção experimental e efeito de endotoxinas. 3. Animais Livres de Germes Patogênicos Específicos (SPF): animais livres de microrganismos específicos, mas não necessariamente livres de outros inespecíficos. • Heteroxênicos: apresentam apenas microrganismos não-patogênicos. Obtenção: animais Germfree são infectados com flora conhecida e não patogênica e colocados em ambiente estéril, mas sem isoladores. Exemplo: animal que apresenta ausência de patógenos respiratórios, como a gripe, é desejável para se investigar o efeito de um medicamento na função pulmonar. Diferença entre animais convencionais e Germfree: Germfree: • Coração menor; consequentemente, o funcionamento cardíaco, o fluxo de sangue para a pele, fígado e intestino e consumo de oxigênio também são menores; • Paredes capilares e alveolares no pulmão menos espessas; • Maturação sexual mais lenta; demoram mais para entrar em período reprodutivo. • Conteúdo cecal com pH maior, em virtude da ausência dos ácidos graxos voláteis produzidos pelo metabolismo fermentativo da microflora intestinal. • Crescimento, peso e temperatura corporal iguais são os mesmos. É importante ter conhecimento dessas diferenças para que a comparação entre outros animais seja bem definida e erros de interpretação não ocorram. Ou seja: O padrão sanitário dos animais se classifica em três grupos distintos: animais gnotobióticos, que possuem microbiota associada definida e devem ser criados em ambiente com barreiras sanitárias absolutas; animais livres de germes patogênicos específicos (specific pathogen free – SPF), que não apresentam microbiota capaz de determinar doença, ou seja, albergam somente microrganismos não patogênicos; e animais denominados de convencionais, que possuem microbiota indefinida por serem mantidos em ambiente desprovido de barreiras sanitárias rigorosas. 3 Quanto ao status genético 1. Outbreed (não-consanguíneos) 2. Inbreed (consaguíneos – isogênicos) 2.1 Híbridos 2.2 Mutantes A partir de agora, entramos no tópico de controle genético, manutenção de colônia e reprodução das espécies convencionais. 1. Outbreed – não consanguíneos: São os heterogênicos ou heterozigotos – a consanguinidade chega a apenas 1%. São os animais convencionais de laboratório. Eles apresentam constituição genética variada, em estado de heterozigose, o que deve ser conhecido e mantido. Características: • Animais mais robustos • Mais férteis • Maior número de filhotes por ninhada • Menor susceptibilidade a variações do meio • Fenótipo variável Utilidade: Realizar experimentos similares às condições naturais, que são populações heterogêneas Para evitar o acasalamento de parentes próximos, é realizado o emprego do sistema de acasalamento rotacional. A colônia se desenvolve em vários grupos de igual número, assim como o número de machos e fêmeas em todos eles. Colônias com maior número de indivíduos possui maior quantidade de grupos. 2. Inbreed – consanguíneos São os isogênicos: índice de 99% de homozigose. São os produtos de 20 gerações consecutivas do acasalamento entre irmãos ou entre pais e filhos. Esses animais são o mais idênticos possíveis que se pode obter, possuindo características fixadas. Cada linhagem tem sua característica individual e única. Geralmente esses animais vivem em isoladores. Características:• Animais de menor porte • Menos férteis • Menor número de filhotes por ninhada Roedores outbreed podem ter de 10 a 12 filhotes por ninhada. Um inbreed costuma ter de 2 a 4. Isso também representa maior custo, já que serão necessárias mais ninhadas para se conseguir um N relevante para pesquisa. • Uniformidade fenotípica • Estabilidade genética a longo prazo Utilidade: Pesquisas que querem características fixas e que passe para todas as gerações. DBA/1J: camundongo inbreed muito comum. Utilizado como modelo para artrite reumatoide e imunização. Esse 1 é a cepa com que ele foi modificado, e o J é o laboratório de onde ele veio. Exemplos de isogênicos: 2.1 Híbridos Animais provenientes de duas linhagens isogênicas; Vantagem: Animais mais vigorosos, prole mais numerosa, uniformidade fenotípica e melhor aceitação aos transplantes de tecidos Desvantagem: só podem ser reproduzidos a partir do cruzamento de linhagens consanguíneas, o que obriga o pesquisador a manter ambas as linhagens para produzir o híbrido de interesse. 2.2 Mutantes • Mutações naturais espontâneas • Identificadas a partir de fenotipagem e/ou genotipagem • Existem sistemas de acasalamento específicos (retrocruzamentos) que tem como objetivo comparar os efeitos do alelo mutante sem a interferência de outras combinações gênicas. São três: backcross, cross-intercross e cross- backcross-intercross. Coisogênico: mutação ocorre no núcleo reprodutivo de uma linhagem isogênica, gerando um novo alelo mutante que substitui o alelo original Congênico: fixação de uma característica a partir de repetidos cruzamentos. Transgênicos: animais que possuem um segmento de DNA de outra espécie. 4 Animal Knockout: Esses animais possuem um gene intencionalmente inativado; muitas vezes são produzidos através de recombinação homóloga. Ocorre comprometimento no sistema imune. Exemplo: o camundongo c57BI/6 normal é nocauteado é resultam em C57BI/6 knockout INF-g. são camundongos deficientes em interferon-gama, sendo incapazes de controlar a infecção por patógenos como Tripanossoma cruzi. Camundongos com mesmo genótipo e que expressam esse fator sobrevivem a infecção. Se ele recebe um medicamento e ele responde, muito provavelmente esse estudo é promissor. Fatores que afetam a reprodução São relevantes principalmente quando se fala em uma taxa de reprodução já reduzida dos animais inbreed. • Condições ambientais • Manejo • Modificações genéticas (inbreed ou outbreed) • Variabilidade genética • Padrão sanitário (Germfree, SPF, FD...) • Nutrição (A restrição calórica entre 15-30% dos ratos pode levar a interrupção do ciclo estral e ao atraso da maturidade sexual, por exemplo) • Olfato Os roedores são muito sensíveis a percepção de feromônios (liberados pela pele, na urina e fezes), e isso causa influencia direta no comportamento das fêmeas. Podem sentir os feromônios de outros animais a partir da roupa do manipulador ou no ambiente. Passar álcool na pele antes de aplicar um medicamento também não é ideal. Ratos ficam mais ariscos, mas camundongos sentem bastante. • Audição Roedores escutam infra e ultrassons. Ruídos que ultrapassem 85dB prejudicam a qualidade reprodutiva. Exemplo: máquina de lavar gaiola ao lado do ambiente dos animais. Importância do controle genético • Reduzir o número de animais utilizados diminuindo as variações dentro/entre grupos • Garantir a manutenção de colônias de produção fechadas • Uniformidade fenotípica (quando é isso que se quer) • Estabilidade genética: comparação de resultados experimentais ao longo do tempo e entre laboratórios. Cuidados com a saúde dos animais Saúde = bem-estar físico e psicológico Características observadas • Peso: A queda dele pode representar saúde precária ou pode ser decorrente do procedimento realizado; • Pele e anexos: Elástica, úmida, lisa, rósea ou com a característica da linhagem. Anormalidades podem ser decorrentes de alimentação, temperatura, alergia e verminoses; tomar cuidado com a troca de alimentação no período de adaptação, pois às vezes eles eram adaptados a outro tipo de alimentação; • Pelos: homogêneo, brilhosos, sem áreas alopécicas ou feridas; • Olhos: brilhantes, umidificados e mostrando vivacidade; • Orelhas: inchaço na base pode ser tumoral; • Dentes: devem gerar atrito com alimentos. O crescimento excessivo pode gerar má oclusão, que é a quebra ou desalinhamento; geralmente é um problema hereditário. Em biotérios, deve-se investigar quem são os pais e o que está acontecendo com eles. Pode ser realizado o desgaste ou adaptar a alimentação. • Sistema circulatório: sempre realizar a inspeção habitual do comportamento e batimentos cardíacos – não dá para contar, mas pode-se monitorar. • Sistema respiratório: eles são muito susceptíveis a doenças do trato respiratório, já que eles sempre são mantidos a uma temperatura controlada. Monitorar se há espirros, por exemplo. 5 • Sistema genitourinário: cuidado especial com Leptospira sp. A infecção se dá a partir da urina de roedores selvagens e pode ser transmitida ao homem. Sempre manipular com luvas. Acasalamento A escolha depende de fatores como: • Característica genética necessária • Espaço existente no biotério • Número de animais necessários Acasalamento de animais heterogênicos: • Produção de população natural. • Escolha de métodos de acasalamento que evitem a consanguinidade • Permitir que a população se mantenha constante em todas as suas características pelo maior número de gerações possíveis • Manter o alto nível de heterozigose • Preservar a estabilidade da população inicial de alelos e sua frequência o máximo possível durante as gerações Colônia de Fundação: Para que tudo isso ocorra, tem- se a chamada colônia de fundação. É a matriz. Eles não são vendidos nem sairão daquele local. Características da colônia de fundação heterogênicos: • Mínimo de 200 casais • Fechada (não há introdução de novos pares reprodutivos) • Monogâmica • Acasalamento randômico (indivíduos com igual chance de participação) • Não pode haver critérios de seleção para não fixar alelos • Tempo reprodutivo fixo (30 semanas) • Aumentar os intervalos entre gerações (o máximo possível – usar da quinta ninhada pra frente) • Renovação do casal ocorre de 6 a 8 meses. Caso um casal não esteja procriando adequadamente, deve haver a substituição desse casal. Se não for possível, substituir pela F1, F2... Colônia de produção e/ou expansão: é a segunda linha após a colônia de fundação. Os descendentes da colônia de fundação, após o desmame, vão para crescimento/fornecimento. 6 Importante: manter o mesmo número de filhotes mamando para manter a uniformidade dos animais durante o crescimento. Acasalamento de animais isogênicos: Pode haver problemas de animais inférteis, com malformações, morte repentina e mutações. Características: • Preservar a isogenicidade e alto coeficiente de consanguinidade • Evitar contaminações genéticas, mutações e heterozigose residual • Colônia de fundação: 10-20 pares monogâmicos Manejo do acasalamento • Separação física de diferentes linhagens • Sistema de identificação controlado • Núcleo da fundação deve vir de um ancestral comum • Colônia pedigree • Observar animais com variações fenotípicas – pode ocorrer graças a contaminação ou mutação Método Lane-Peter (Traffic-light): método de identificação para animais isogênicos. São colocadas fitas coloridas nas caixas. • Faixa branca: F1 da colôniafundadora • Faixa verde: F1 da faixa branca • Faixa amarela: F1 da faixa verde • Faixa vermelha: F1 da faixa amarela Método reprodutivo das Linhas Paralelas: Uma tendência que vem sendo implementada nos biotérios é a do congelamento dos óvulos a partir da colônia de expansão, diminuindo custos e evitando que animais sejam criados e eutanasiados desnecessariamente. 7 Métodos de acasalamento 1. Monogâmico 2. Poligâmico 1. Monogâmico: um macho e uma fêmea permanecem juntos permanentemente na gaiola. No caso dos roedores, é amplamente utilizado em colônias de fundação de animais consanguíneos onde se empregam acasalamento entre irmãos. Comum em mice. Vantagens: • Fácil identificação dos filhotes • Manutenção de registro fidedigno • Elevada porcentagem de cios férteis pós-parto • Elevada porcentagem de filhote desmamados • Maior controle das enfermidades • Boa seleção dos reprodutores Desvantagens: • Aumento de mão-de-obra • Necessidade de grande número de machos reprodutores; • Necessidade de espaços maiores 2. Poligâmico: um macho para um grupo de duas ou mais fêmeas. Mais utilizado em colônias de animais de produção de roedores e na grande maioria das espécies primatas. Vantagem: • Maior número de animais em menos espaço Desvantagens: • Dificuldade para registro dos animais • Identificação da fêmea e do macho não fértil Sistemas de acasalamento 1. Acasalamento ao acaso 2. Sistema rotacional Método Poiley Método Falconer 3. Acasalamento consanguíneo Colônias com 10 – 25 animais: o sistema utilizado é o de consanguinidade mínima. O princípio básico diz que cada macho contribui com um macho e cada fêmea contribui com uma fêmea para a geração seguinte. Para que isso ocorra, todos devem ser acasalados ao mesmo tempo para não haver sobreposição de gerações. Colônias de 25 – 100 animais: o sistema utilizado é o rotacional. O objetivo é evitar o acasalamento de parentes próximos Colônias acima de 100 machos: acasalamento ao acaso, já que a chance de consanguinidade é menor. 1. Acasalamento ao acaso: a chance de acasalamento de um macho qualquer e uma fêmea qualquer da população é igual para todos os animais. Em grandes populações, o acasalamento ao acaso preserva os genes e as suas frequências ao longo das gerações, desde que não haja seleção ou mutações ocorrendo (lei de Hardy-Weinberg) Já em populações menores, a tendência é que haja a perda de alelos e a fixação de outros. Ou seja: homozigose. 2. Sistema rotacional: evita o acasalamento de parentes próximos e assegura que a próxima geração venha de um espectro mais amplo de pais do que seria se fosse ao acaso. É empregado onde existe uma contínua substituição das colônias sem distinção entre as gerações. Esses acasalamentos são arranjados de forma sistemática e a escolha dos animais é feita dentro dos grupos. 2.1 Método Poiley: quanto menor o número de unidades reprodutivas, maior o número de grupos formados; costumam ser de 3 a 12 grupos. Esses acasalamentos seguem esquemas predefinidos e podem ser realizados de acordo com as necessidades de reposição de cada grupo. 8 2.2 Método Falconer: Também ocorre a formação de grupos, mas em vez de embaralharmos os novos grupos a serem formados, fixamos um dos sexos e rotacionamos o outro. 4. Acasalamento consanguíneo: Realizada com irmãos da mesma ninhada. Ocorre a manutenção das características da linhagem consanguínea; Fixação de características ou desenvolvimento de novas linhagens. Ao partir de um casal representante, acasala-se todos os irmãos de todas as ninhadas; à medida que a colônia cresce, se começa a selecionar quais os melhores casais e apenas acasala-se os filhotes desses casais. Ao atingir 20 casais, se inicia a reposição deles. Após 3 gerações consecutivas, escolhe-se um novo casal para rederivar a colônia de maneira que possamos traçar uma única linha no pedigree dos casais atuais até o casal ancestral comum. Assim, evita- se o distanciamento dos animais em reprodução com o ancestral. Um menor número de casais representa maior chance de fixação de alelos desejáveis. Referências Molinaro, E. M., Majerowicz, J., Couto, S. E. R., Borges, C. C. A., & Moreira, W. C. (2009). Animais de laboratório. EPSJV. ANDRADE, Antenor; PINTO, Sergio Correia; OLIVEIRA, Rosilene Santos de. Animais de laboratório: criação e experimentação. Editora Fiocruz, 2006.
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