Resumo Eletroforese

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- a visualização dos resultados de uma PCR convencional é realizada após 
 eletroforese em um gel sólido composto por agarose ou poliacrilamida 
 - usa-se agarose para material genético (DNA e RNA) 
 - usa-se gel de poliacrilamida para proteínas 
 Método 
 - deslocamento do DNA pelo gel por tempo determinado com aplicação de carga 
 elétrica 
 - devido à carga negativa do fosfato, o ácido nucleico tende a se deslocar para o polo 
 positivo DNA tem carga negativa 
 - fragmentos de DNA maiores têm mais dificuldade em percorrer o gel 
 - fragmentos de DNA menores se deslocarão mais rápido 
 - sendo possível separar os fragmentos por tamanho 
 Géis de agarose 
 - compostos por um açúcar complexo derivado de algas que permite separar os 
 fragmentos de DNA de 50 a 20.000 pb 
 - quanto maior a concentração de agarose (de 0,5% a 2%), menores serão os poros, 
 tornando mais difícil a passagem do DNA 
 - concentração altas são usadas quando se pretende trabalhar com fragmentos 
 pequenos de DNA 
 - precisa aplicar um marcador para escala - leader 
 - precisa do “poço branco” que não vai DNA para não amplificar 
 - caso o poço branco amplifique, quer dizer que está contaminado com DNA 
 externo 
 Desenho de primer 
 - o primer é uma sequência de DNA que serve como ponto de início para extensão 
 - DNA polimerase só pode estender uma fita pré-existente 
 - é utilizado o ‘forward primer’ e o ‘reverse primer’ para amplificar bem 
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 É necessário saber: 
 ➔ comprimento do amplicon (fragmento de interesse) 
 - a recomendação para a PCR convencional varia (maiores ou igual mil pb) 
 - cálculo do comprimento: 
 (posição do primer reverse - posição do primer forward) + 1 
 - amplicon muito pequeno é difícil para visualizar no gel 
 - amplicon muito grande diminui a eficácia de amplificação 
 ➔ temperatura de Melting (momento onde 50% das fitas já foram desnaturadas) 
 - metade das fitas estão na forma simples e a outra metade na dupla hélice 
 - a Tm equivale a % GC + comprimento do primer 
 - a diferença dos primers não pode ser maior que 3°C 
 - Tm = 4°C (G+C) + 2°C (A+T) 
 ➔ temperatura de anelamento 
 - temperatura na qual os primers se pareiam ao DNA molde 
 - calculada a partir da temperatura de Melting 
 - TA = Tm - 4/5°C 
 - ⬆TA: pouco produto/ausência de anelamento 
 - ⬇TA: anelamento inespecífico 
 ➔ porcentagem de guanina-citosina 
 - 40-60% GC: estabilidade 
 - passou de 60% precisa alterar a temperatura 
 ➔ problemas na estrutura dos primers 
 ➔ comprimento dos primers 
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