Relatório 2 - Cromatografia em Coluna

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
Química Orgânica Experimental
PRÁTICA N° 2
Cromatografia em coluna: extração e fracionamento de pigmentos vegetais
Aluna: Maria Clara Oliveira Kind
Relatório apresentado à disciplina
QUI031 do curso de Química da
UFMG.
Professor: Cláudio Donnici
Turma: PE2
Belo Horizonte
Novembro de 2022
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1. INTRODUÇÃO
A cromatografia é um método físico-químico de separação e identificação de espécies
químicas em uma mistura. A cromatografia em coluna, foco do presente trabalho, possibilita
a separação através do fenômeno de adsorção, se baseando na distribuição dos
componentes entre uma fase estacionária e uma fase móvel.
A adsorção da amostra pelas fases irá depender da polaridade das substâncias envolvidas
durante o processos de eluição da coluna, no qual a fase móvel atravessa a estacionária,
arrastando as moléculas com diferentes velocidades, a depender da afinidade e facilidade
de retirá-las da interação com a fase estacionária.
Trata-se de uma competição pelos componentes da amostra, controlada pela diferença de
polaridade das fases durante a cromatografia do extrato de espinafre, visando a separação
da clorofila e do β-caroteno presente na planta (Fig.1).
a)
b)
Figura 1. Estruturas do (a) β-caroteno e (b) clorofila, em que R= CH3 para clorofila a e
R=CHO para clorofila b.
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2. OBJETIVOS
● Introduzir a técnica da cromatografia de adsorção em coluna;
● Extrair pigmentos vegetais e fracioná-los por meio da cromatografia.
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
3.1. MATERIAIS
➢ Coluna com torneira;
➢ Papel absorvente;
➢ Pipeta conta-gotas;
➢ Erlenmeyer de 125 mL;
➢ Proveta de 25 mL;
➢ Bastão ou tubo de vidro;
➢ Suporte, mufas e garras;
➢ Béqueres de 50 e 250 mL;
➢ Almofariz com pistilo;
➢ Espátula;
➢ Tela de amianto;
➢ Aro ou tripé;
➢ Bico de gás;
➢ Funil de haste longa.
3.2. REAGENTES
➢ Sílica Gel 60;
➢ Hexano;
➢ Acetona;
➢ Água destilada;
➢ Folhas de espinafre.
3.3. PROCEDIMENTOS
1) Preparo do extrato
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● Ferver, em um béquer de 250 mL, cerca de 10 g de folhas de espinafre em água
destilada. Utilizar as folhas sem as nervuras centrais e deixar em ebulição por dois
minutos. A água da fervura pode então ser desprezada na pia e, em seguida, as
folhas devem ser resfriadas e bem enxugadas com papel toalha.
● Transferir as folhas enxutas para um almofariz e triturá-las com 15 mL de uma
mistura 1:1 de acetona e hexano. Nesta etapa, devido à volatilidade das
substâncias, pode ser necessário aumentar o volume de solvente adicionado.
● Transferir a solução verde do fundo do almofariz e para um béquer de 50 mL.
● Adicionar duas espátulas de sílica e levar à capela de exaustão para secagem. O
extrato se incorpora à sílica e os solventes utilizados evaporam, restando um pó
verde.
2) Empacotamento da coluna
● Fixar a coluna de vidro verticalmente no suporte universal utilizando as mufas e
garras, de modo que a montagem fique firme. Fechar a torneira, transferir 10mL de
hexano e inserir um pequeno pedaço de algodão na coluna, o posicionando na parte
anterior à torneira, a fim de impedir que a fase estacionária escoe durante a eluição.
● Preparar uma suspensão com 5 g de sílica e cerca de 10mL de hexano, com
atenção à formação de bolhas que podem ser prejudiciais para o correto
empacotamento.
● Adicionar a mistura no topo da coluna e abrir a torneira para que o líquido escoe
parcialmente, com atenção para que a coluna nunca fique completamente seca.
● O solvente recolhido deve ser novamente adicionado até que as paredes da coluna
fiquem limpas e a fase móvel suficientemente nivelada. Quando atingidas as
condições, acertar o enchimento para que o hexano esteja aproximadamente 5 cm
acima do topo da fase estacionária e fechar a torneira.
3) Eluição da coluna cromatográfica
● Adicionar o extrato no topo e lavar as paredes da coluna com hexano em pouca
quantidade. Abrir a torneira e permitir que o líquido escoe parcialmente, sem que
seque.
● Proceder à eluição completando a coluna com hexano, sempre cerca de 5 cm acima
do topo do extrato e recolher o solvente no frasco indicado como fração I. Quando a
primeira banda colorida estiver próxima da torneira, trocar o frasco pelo referente à
fração ll, e recolhê-la até que o eluente perca a cor.
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● Substituir o frasco coletor e iniciar a eluição com acetona, recolhendo desta vez no
frasco indicado para a fração lll. A aproximação da segunda banda colorida na saída
da coluna, indica que o frasco deve ser novamente trocado, para a coleta da fração
IV.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram separadas as quatro frações propostas:
Fração Cor Identificação
I Transparente Hexano
II Amarela β-Caroteno
III Transparente Acetona/Hexano
IV Verde Clorofila
Tabela 1: Composição majoritária das frações coletadas na cromatografia
A primeira banda colorida coletada na fração ll, se trata do β-caroteno por causa da típica
cor amarela. Essa afirmação é confirmada se observada a polaridade do hidrocarboneto
carotenoide, que é menor que a da molécula de clorofila e portanto, deve ser eluída
primeiro, com o hexano.
A molécula da clorofila tem diversas ligações polarizadas, e carbonilas presentes nas
funções éster, aldeído e ácido carboxílico, conferindo a ela maior interação com a sílica gel
na fase estacionária. Como previsto, a banda colorida verde foi coletada posteriormente,
após a troca do hexano pela acetona, o solvente mais polar.
O extrato de espinafre também foi analisado na técnica de espectroscopia do infravermelho,
e espectroscopia IV, confirmando a presença da clorofila e caroteno na amostra, e
evidenciando a presença de oxalato de cálcio, muito comum em diversas espécies de
plantas, sendo responsáveis pela formação de “drusas”, que causam sensação arenosa ao
serem mastigadas. Os resultados estão anexados ao final do arquivo.
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Figura 2. Frações II e IV, respectivamente, coletadas em laboratório para o experimento
referente.
Caso a eluição começasse pela fase móvel mais polar, ou seja, acetona em vez de hexano,
tanto a clorofila quanto o β-caroteno seriam arrastados como uma mistura, não havendo
separação, pois a sílica gel não seria capaz de reter um dos compostos.
Em uma mistura de sólidos - sendo um álcool, um hidrocarboneto saturado, e uma cetona -,
por exemplo, a separação com fase estacionária sílica gel 60 seguiria de forma semelhante
em termos da ordem de eluição: da fase móvel menos polar para a mais polar. Uma
sugestão possível seria utilizar o hexano para eluição da primeira banda, contendo o
hidrocarboneto, seguido da acetona para eluição da cetona e, por fim, utilizar etanol para
eluir a fração de álcool.
Quanto a fase estacionária, além da sílica gel, são utilizadas em cromatografia em coluna
vários outros sólidos que diferem em atividade e tamanho de partículas/porosidade, como o
óxido de alumínio, celulose microcristalina, carvão ativado e silicato de magnésio. Além da
escolha correta em termos de polaridade, estes adsorventes são selecionados de forma a
evitar possíveis reações indesejáveis na coluna, seja com a fase móvel ou com a amostra
em análise.
5. CONCLUSÃO
Utilizando cromatografia de adsorção em coluna, foi possível extrair e fracionar os
compostos β-caroteno e clorofila em uma amostra de espinafre. O procedimento, realizado
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utilizando hexano e acetona como fase móvel e sílica gel 60 como fase estacionária, se
mostrou suficientemente eficiente.
6. REFERÊNCIAS
● COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Introdução a métodos
cromatográficos. 6. Ed. Canpinas: Editora UNICANP, 1995.
● FONSECA, S.F; GONÇALVES, C.C.S. Extração de Pigmentos do Espinafre e
Separação em Coluna de Açúcar Comercial. Experimentação no ensino de química.
Revista Química Nova na Escola, Vol. 20, p. 55-58, 2004.
● Química Orgânica Experimental. Roteiro Cromatografia Em Coluna (CC): Extração E
Fracionamento De Pigmentos Vegetais. Departamento de Química da UniversidadeFederal de Minas Gerais. Belo Horizonte. 2018.