Resumo_rompimento celular

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Resumo – Rompimento celular 
 
Objetivo: Obtenção de produtos associados às células 
Algumas perguntas que devemos fazer 
 A molécula de interesse é termolábil? 
 É sensível a tensões de cisalhamento; 
 É sujeita a ação de enzimas? 
 Como é a parede celular do microrganismo? 
Como definir o método a ser utilizado 
 Preservação da biomolécula; 
 Tempo de operação, rendimento do processo, gasto de energia, custo; 
 Estrutura da parede celular (células animais x vegetais x M.O.); 
 O processo influencia diretamente na concentração e “qualidade” do bioproduto, 
preservando a atividade biológica e reduzindo a presença de contaminantes. 
 
 CLASSIFICAÇÃO 
o Mecânicos 
 Homogeneizador de alta pressão; 
 Moinho de bolas; 
 Ultrassom. 
o Não mecânicos 
 Choque osmótico; 
 Congelamento e descongelamento; 
 Termólise. 
o Químicos 
 Álcalis; 
 Solventes; 
 Detergentes. 
o Enzimáticos 
 Lise enzimática 
 
MÉTODOS MECÂNICOS 
 Estrutura celular rompida fisicamente; 
 Alta eficiência e ampla aplicação; 
 Tamanho e forma das células, estrutura da parede celular  Fatores que são 
considerados na definição do processo; 
 Estabilidade mecânica do m.o. (Varia com a idade do cultivo, taxa de crescimento, 
espécie, temperatura do meio e composição do meio); 
 
 
 
 
Equipamentos 
o Homogeneizador de alta pressão 
Técnica mais utilizada na indústria, pistões aplicam altas pressões à suspensão 
celular, que passam por um orifício estreito e se chocam contra uma superfície 
rígida e imóvel em uma câmara de baixa pressão. A queda da pressão e o 
impacto provocam rompimento celular preservando a integridade das 
biomoléculas. ↑ tamanho células = ↑rompimento; ↑ pressão = ↑eficiência; 
necessita de refrigeração; O equipamento possibilita a recirculação = 
↑eficiência (mas pode causar perda da biomolécula de interesse. 
 
o Moinho de bolas 
Suspensão celular passa por uma câmara de trituração (v ou h) provida de um 
eixo rotativo e preenchida com esferas (↑ superfície de atrito). A ruptura ocorre 
por conta da taxa de cisalhamento causada pelas esferas na parede celular das 
células. A eficiência depende. Eficiência depende da geometria da câmara, 
velocidade do agitador, tamanho e carga de esferas, velocidade de alimentação 
e concentração celular. 
 Tamanho e composição das partículas 
o Vidro, aço inox, cerâmica; 
o Quanto menor o diâmetro, maior a eficiência; 
o Quando a molécula de interesse está no espaço periplasmático 
 utilizar esferas maiores; 
o Escala industrial: diâmetro mínimo 0,4 mm (facilita a separação 
do homogeneizado que é contínuo). 
 Carga de esferas 
o Câmara horizontal: esferas devem ocupar entre 80 e 85% do 
volume; 
o Câmara vertical: esferas devem ocupar entre 50 e 60% do 
volume; 
o Esferas muito pequenas: pouca colisão entre as esferas; 
o Esferas muito grandes: muito colisão entre as esferas; 
 Concentração celular 
o Pouca influência na eficiência do rompimento; 
o Recomendação: 30 a 50% (v/v). 
 Velocidade de alimentação 
o ↑ fluxo de alimentação: ↓eficiência; 
o Variável dependente da velocidade do agitador; carga das 
esferas, geometria do equipamento e propriedades do m.o.; 
 Temperatura 
o Libera muito calor; 
o Remoção de calor por resfriamento; 
o Temperatura controlada (5 e 15 °C); 
 Tempo de rompimento ideal 
o Tempo em que há menor número de células e aumento no 
rendimento do processo. 
 
o Ultrassom 
 Cavitação causada por ondas sonoras de alta frequência convertidas em 
vibrações em meio líquido. Que resulta no colapso de microbolhas e 
liberação de ondas de choque que resultam em impacto e aumento da 
tensão de cisalhamento. Escala laboratorial. 
 
Limitações dos métodos mecânicos 
 As forças de cisalhamento elevadas podem destruir organelas celulares e causar 
desnaturação de proteínas; 
 Como o rompimento é integral todo o conteúdo intracelular é liberado (ác. 
nucleicos, organelas e fragmentos celulares). 
 
MÉTODOS NÃO MECÂNICOS 
o Choque osmótico 
 Altera a pressão osmótica a que a célula é submetida, que resulta na 
permeabilidade seletiva, é um método indicado para bactérias gram (-) 
o Congelamento e descongelamento 
 Rompimento celular causado pelos ciclos de congelamento e 
descongelamento. A formação de cristais de gelo, no congelamento, 
ocasiona o rompimento da célula ou formação de poros permeáveis 
para retirada do composto de interesse; 
 Fatores que influenciam no processo: tipo e idade da célula, 
temperatura e velocidade dos ciclos de congelamento e 
descongelamento; 
 Resistência a este rompimento: Quanto há presença de crioprotetores 
(biopolímeros, aminoácidos); 
 ↓ velocidade de congelamento = ↑ tamanho dos cristais e eficiência. 
o Termólise 
 Rompimento celular causado por aumento de temperatura da 
suspensão. Processo realizado por meio de banho termostático, injeção 
de vapor direto, tambor rotativo, spray-drier. Os fragmentos celulares 
maiores são removidos por filtração ou centrifugação. 
 
MÉTODOS QUÍMICOS 
o Álcalis 
 Compostos de interesse e estáveis a pH acima de 11; 
 Baixo custo, fácil execução, aplicação em grande escala; 
 Extração de compostos orgânicos em leveduras; 
 Álcalis: hidróxido de amônio e hidróxido de sódio 
 Desvantagem: geração de resíduos 
o Solventes 
 Desidratação química nas células; 
 Deve ser utilizando para biomoléculas que não sejam desnaturadas por 
determinados solventes; 
 Solventes: etanol, tolueno, metanol e acetona 
o Detergentes 
 Usados para romper a membrana das células e liberar o material 
intracelular na forma sensível; 
 Dissociam proteínas e lipoproteínas da parede celular: formação de 
poros e liberação de biomolécula; 
 Processo afetado pela temperatura, pH e estrutura celular; 
 Cuidados: formação de espuma, desnaturação e precipitação proteica. 
 
MÉTODOS ENZIMÁTICOS 
o Lise enzimática 
 Hidrolisam as paredes celulares de células microbianas; 
 Adequado para recuperação de bioprodutos sensíveis a tensão de 
cisalhamento ou pressão geradas pelos métodos mecânicos; 
 Fatores a considerar: presença de inibidores, possibilidade de reciclo da 
enzima; 
 Podem ser associados a métodos mecânicos quando resistentes à 
tensão de cisalhamento. 
 
Vantagens 
 Fácil controle do pH e temperatura; 
 ↓investimento e ↑especificidade para degradar a parede celular; 
 Utilização de enzimas que liberam somente as biomoléculas de 
interesse. 
 
Desvantagens 
 Alto custo das enzimas  escala industrial; 
 Estado fisiológico do m.o. afeta a eficiência da lise celular. 
 
OUTROS MÉTODOS 
o Micro-ondas; 
o Energia elétrica pulsada 
 Campos elétricos pulsados – PEF (Eletroporação na parede); 
 Descargas elétricas de alta tensão-HVEA  Danos às paredes celulares 
devido à alta tensão e diferentes fenômenos secundários.