AVALIAÇÃO - MICROBIOLOGIA EXPERIMENTAL

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA 
CENTRO DE CIENCIAS E TECNOLOGIA 
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA 
BACHARELADO EM QUÍMICA INDUSTRIAL 
 DISCIPLINA: Microbiologia Experimental 
 PROFESSORA: Dra. Helvia W. Casullo de Araújo 
 ALUNO: Allan Figueirêdo Leite 
 
AVALIAÇÃO 
 
1. Na técnica dos tubos múltiplos para a avaliação da água potável, quais os meios 
de cultura utilizados? As bactérias identificadas? A temperatura e o tempo de 
incubação para cada bactéria e ser identificada? E como se identifica a presença 
das bactérias nessa técnica? (2,0) 
A técnica de múltiplos tubos é indicado para determinação de microrganismos, tais 
como coliformes totais, coliformes termotolerantes, Escherichia coli, Pseudomonas 
aeruginosa, entre outros. Este método é simples, e requer 48 horas para o teste 
presuntivo seguido, de 48 horas para o teste confirmativo. Em tubos de ensaio com 
tubos de durhan, é feita as diluições tanto para o teste presuntivo, quanto para o 
confirmativo. Em 5 tubos de ensaio com Caldo Lauril Sulfato Triptose, são diluídos 
1mL da amostra em cada tubo para realização do teste presuntivo, homogeneizados 
e colocados na estante de tubo de ensaio por 48 horas. Após o resultado positivo do 
teste presuntivo, são diluídos em mais 5 tubos de ensaio 1 mL da amostra, neles 
agora contendo Caldo Verde Bile Brilante, estes darão o resultado sobre coliformes 
totais; em mais 5 tubos de ensaio são diluídos 1 mL da amostra, este agora com 
Caldo EC (Escherichia coli), este para resultado para coliformes termotolerantes. A 
positividade desses testes se dá pela presença de gás nos tubos de Durhan. São 
considerados coliformes os microrganismos que, por esta técnica sejam capazes de 
fermentar lactose nos testes presuntivos e confirmativos, com produção de gás a 35 
°C a 45 °C. 
Para a realização da contagem presuntiva de coliformes totais, é inoculado, em 5 
tubos de ensaio, 1 mL da amostra no caldo lactosado(CL). A positividade é indicada 
pelo crescimento e presença de gás nos tubos de Duhran, massa celular e o meio 
fica turvo. 
A presença de coliforme fecais é observada a partir da inoculação de 1 mL da 
amostra em 5 tubos com meio de cultura EC. Com isso, é encontrado a presença de 
coliformes termotolerantes ou fecais, havendo formação de massa celular, gás e o 
meio também fica turvo. 
2. Qual a importância da diluição das amostras no laboratório de microbiologia? E 
esquematize uma diluição de 1:1000. Pode-se utilizar a mesma pipeta sim ou não? 
Justifique sua resposta. (2,0) 
Diluição é o procedimento de adição de uma substância a outra para reduzir a 
concentração de uma das substâncias. Em microbiologia de alimentos, comumente são 
utilizadas diluições decimais da amostra, adotando-se rotineiramente dois critérios: 
massa por unidade de volume (m/v) e volume por unidade de volume (v/v). Diluições 
decimais são diluições em que a quantidade de substância a ser diluída corresponde à 
unidade, ou múltiplos da unidade e o volume final da solução diluída é igual a 10 ou 
múltiplo de 10 (diluições de base 10). 
 
1. Prepara-se uma diluição 1:10 da cultura em fase estacionária em solução, isto é, 
misturar 1 mL da cultura em fase estacionária com 9 mL de solução (10⁻¹); 
2. A partir da diluição 1:10 preparada e após homogeneização em agitador de tubos, 
tomar 1 mL e misturar com 9 mL de solução, de forma a obter a diluição 1:100 da 
cultura em fase estacionária (10⁻²). 
3. A partir da diluição 1:100 preparada e após homogeneização em agitador de tubos, 
tomar 1 mL e misturar com 9 mL de solução, de forma a obter a diluição 1:1000 
da cultura em fase estacionária (10⁻³). 
Usa-se uma pipeta pra cada mudança de diluição, a fim de evitar a contaminação 
afetando o resultado final do procedimento. 
3. Uma água potável apresentou uma contagem de bactérias termotolerantes na 
ordem de 10⁸NMP/mL. Essa água pode ser consumida? Justifique sua resposta. 
(1,0) 
A água potável deve apresentar ausência de Coliformes termotolerantes ou Escherichia 
coli em 100 mL de amostra e ausência de bactéria do grupo coliformes totais em 100 
m, seguindo o ministério da saúde e a resolução do CONAMA N° 357, DE 17 DE 
MARÇO DE 2005. 
4. Fale sobre o objetivo da técnica de Gram, especificando os procedimentos dessa 
técnica, como identifica-se essas bactérias. (2,0) 
A coloração de Gram é um passo muito importante na caracterização e classificação 
inicial das bactérias. Afinal, esse método de coloração permite que as bactérias sejam 
visualizadas no microscópio óptico, uma vez que sem a coloração é impossível 
observá-las ou identificar sua estrutura. 
Em suma, o procedimento de coloração de Gram permite que as bactérias retenham a 
cor com base nas diferenças nas propriedades químicas e físicas da parede celular. De 
fato, o uso dos corantes permite aumentar o contraste e evidenciar a estrutura 
bacteriana. 
 
A coloração envolve 3 etapas principais: 
• Coloração com violeta de cristal (um corante solúvel em água, roxo); 
• A descoloração (utilizando etanol / acetona); 
• A contra-coloração (utilizando corante Safranina, vermelho). 
PASSO A PASSO DA METODOLOGIA DE GRAM 
1. Cubra o esfregaço com violeta-de-metila e logo após deixe por aproximadamente 
15 segundos; 
2. Adicione igual quantidade de água sobre a lâmina coberta com violeta-de-metila 
e então deixe agir por mais 45 segundos; 
3. Escorra o corante e lave em um filete de água corrente; Cubra a lâmina com lugol 
diluído (1/20) e deixe agir por aproximadamente 1 minuto; 
4. Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente; 
5. Adicione álcool etílico sobre a lâmina; descorando-a, até que não desprenda mais 
corante; 
6. Lave em um filete de água corrente; 
7. Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos; 
8. Lave em um filete de água corrente; 
9. Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente com o auxílio de um papel de filtro 
limpo; 
10. Visualize no microscópio. 
 
A princípio, há diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos 
Gram-positivos e Gram-negativos. 
As bactérias Gram-positivas retêm o cristal violeta devido à presença de uma espessa 
camada de peptidoglicano (polímero constituído por açúcares e aminoácidos que 
originam uma espécie de malha na região exterior à membrana celular das bactérias) 
em suas paredes celulares, apresentando-se na cor roxa. 
Já as bactérias Gram-negativas possuem uma parede de peptidoglicano mais fina que 
não retém o cristal violeta durante o processo de descoloração e recebem a cor 
vermelha no processo de coloração final. 
5. Responda as questões abaixo. (3,0) 
a) Qual a importância do Bico de Bunsem em bacteriologia? 
Em um laboratório de microbiologia, são necessárias técnicas assépticas, uma vez que 
deve ser mantida a esterilidade dos materiais e do local, a fim de diminuir os riscos de 
contaminação. Para garantir essa condição no momento da análise, é importante que 
todo o material esteja esterilizado e não haja contaminação no momento do manuseio 
durante os procedimentos de análise laboratorial. Aí é que entra o bico de Bunsen. Ao 
trabalharmos na área de segurança ao redor da chama do bico de Bunsen, estamos 
garantindo que todo nosso procedimento seja feito em condições assépticas, ou seja, 
sem risco de contaminação por microrganismos do ambiente. Ao usarmos a chama 
azul, além desta atingir altas temperaturas, estamos garantindo um fluxo de ar que 
impede a entrada dos microrganismos do ambiente ao seu redor. Nessa área de 
segurança é que devemos fazer toda a manipulação, como por exemplo, abrir a placa 
de Petri com meio de cultura ou abrir as tampas dos tubos de cultura, diminuindo o 
risco de contaminação da superfície e da área de manipulação. 
b) Como deve ser realizada a coleta das amostras em torneira? 
Em poços e fontes onde a retirada d'água é feita através de torneira ou bica, a coleta daamostra de água deverá ser realizada observando-se a assepsia da torneira com 
hipoclorito ou álcool 70%, deixando a água escoar por cerca de 1 ou 2 minutos. 
c) Por que se deve inverter as placas de Petri quando coloca para incubar? 
As placas de Petri devem ser incubadas e armazenadas em posição invertida de forma 
que o ágar fique para cima, assim a condensação não cairá sobre a amostra 
interrompendo a superfície de crescimento ou permitir a multiplicação de organismos 
indesejados.