2 artigo - Proteínas da membrana do glóbulo vermelho

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Proteinas da Membrana do Globulo
Vermelho - Metodos de Estudo
·TEREZA MARIA D. DE MEDEIROS
··ORLANDO CESAR DE O. BARREDa
1. INTRODU~Ao
A vida media do eritr6cito e
de 120 dias. Durante esse periodo,
a fim de poder circular livremente
na corrente sangiiinea, a gl6bulo
vermelho apresenta considenivel
resistencia e flexibilidade que the e
conferida par uma rede de protein as
situadas na face interna da
membrana logo abaixo da bicamada
lipidica (Figura A).
A membrana do gl6bulo
vermelho e constituida par 49% de
proteinas, 43% de lipidios e 8% de
carboidratos, cuja organiza«;ao
destes componentes e essencial para
a fun«;ao celular normal e
sobrevivencia, alem de determinar
as propriedades antigenicas da
membrana (11).
As proteinas da membrana se
associam atraves de liga«;6es bem
estabelecidas, configurando uma
rede que confere a capacidade do
eritr6cito em manter a sua forma e
as suas propriedades. Dependendo
de sua localiza«;ao em rela«;ao a
bicamada lipidica, as proteinas
presentes na membrana do gl6bulo
, ,.om)
c"'" 1
as glicoforinas (A, B e C), as quais
transportam receptores de membra-
na e antigenos (14).
As proteinas perifericas sao
as que estao localizadas na face
citos6lica au intema da membrana,
formando uma rede subjacente a
membrana e interagem com protei-
nas au por«;ao polar dos lipidios da
superficie da membrana, porem mio
penetram na camada lipidica.
Assim, estas proteinas constituem
a citoesqueleto da membrana e sao
representadas pela espectrina,
anquirina, actina. proteina 4.1. e
proteina 4.9. alem da enzima
gliceraldeido-3-fosfato desidro-
genase (proteina 6) (1, 11).
Portanto. as proteinas inte-
grais sao aquelas que atravessam
au penetram a membrana e as
perifericas tern importancia na
manuten«;ao da estrutura da mem-
brana, formando a seu citoesqueleto.
2. PROTEiNAS PERIFERICAS
ESPEQTRINA
E a mais importante e a mais
abundante do esqueleto da
Figura A - Representayao esquematica da membrana
eritrocitaria, mostrando a bicamada lipidica com as
proteinas integrais imersas, e algumas proteinas
perifericas do citoesqueleto (modificado de Singer e
Nicholson, 1972).
vermelho sao classificadas como
proteinas integrais e perifericas (1).
Sao chamadas proteinas
integrais aquelas que possuem urn
segmento hidrof6bico que interage
com as lipidios da dupla camada
lipidica e, muito freqiientemente
assumem uma orienta«;ao trans-
membrana com urn segmento polar
glicosilado que se estende para fora
do gl6bulo vermelho e urn outro
segmento em cantata com a face
citos6lica da membrana. Estas
protein as incluem a protein a 3
(proteina transportadora de ions) e
·Prof. Adjunto do Universidode Federal do Rio Grande do Norte
··Prof. Associodo do Foculdode de Medicino do USP Pesquisodor 1-A do CNPq.
membrana eritrocitana. correspon-
dendo cerca de 25 a 30% do total
proteicoda membrana. Consiste de
duas subunidades estruturalmente
semelhantes.poremfuncionalmente
distintas: alfa-espectrina (proteina
1) e beta-espectrina (proteina 2).
com pesos moleculares de 240 e
220 kDa respectivamente (10, 12,
14).Decada uma dessas cadeias ha
cerca de 200.000 moleculas par
celula. As duas subunidades se
associamdemaneira caracteristica:
uma molecula de alfa-espectrina se
liga par sua extremidade-NH2 a
extremidade-COOH de uma
mole cuI a de beta-espectrina
formando-se a heterodimero. Cada
heterodimero se associa lateral-
mente a outro heterodimero, porem
demodoinverso (anti-paralelo)para
formar tetnlmeros e tambem
oligomeros (Figura B). A forma
GliCOFORINA C
I
BANDA 3
I
eritr6ides), sendo intensa nos pr6-
eritroblastos e prossegue ate a
estagio de reticu16cito. A alfa-
espectrina e produzida em quan-
tidade quatro vezes maior que a
beta-espectrina. No entanto, sao
incorporadas a membrana em
quantidades semelhantes, e a
excesso de alfa-espectrina e
catabolizado (12, 15).
ANQUIRINA
E a principal protein a da
membrana envolvidana liga(,;aodo
esqueleto da membrana a mem-
brana. E uma proteina globular,
embora assimetrica. com tres
segmentos: urn deles com sitio de
liga(,;aopara a proteina 3, outro com
grande afinidade a beta-espectrina
e urn segmento regulador das
liga(,;oescom espectrina e banda 3
(1).Portanto, a anquirina permite a
intera(,;ao entre a espectrina e a
GUCOFORINA C
I
~ ?-ESPECTRINA
COMPLEXb
JUNCIONAL
j3-ESPECTRINA ~
COMPLEXO
JUNCIONAL
Figura B . Esquema mostrando a organiza9ao das espectrinas em heterodimeros (alfa espectrina . beta
espectrina) e entre os heterodimeros, formando 0 tetramero de espectrina.
tetramerica e a mais estavel e
constitui a base do citoesqueleto.
Ostetrfuneros sao, portanto. a prin-
cipal forma de espectrina na
membrana do g16bulovermelho (2).
Ogeneda alfa-espectrina esta
localizado no cromossomo 1
(segmento q22 e q25) enquanto a
gene da beta-espectrina esta
localizado no cromossomo 14 (10).
Asintese de alfa e beta espectrinas
se inicia no estagio de CFU-E
(unidade formadora de colonias
82·lAES&HAES
proteina 3. exercendo papel funda-
mental na manuten(,;ao da estabi-
lidade da membrana. Esta presente
na quantidade de 100.000 mole-
culas par cHula, na propor(,;aode
uma molecula de anquirina para
cada tetrfunero de espectrina (12).
A anquirina do eritr6cito
humano e atualmente considerada
uma mistura de proteinas de
tamanhos diferentes. A principal
forma (proteina 2.1) e uma proteina
de peso molecular de 210 kDa.
Outras formas mais rapidas
(proteinas 2.2, 2.3 e 2.6) sao
facilmentedetectadas par colora(,;oes
proteicas pradronizadas e sao
varia(,;oesp6s-translacionais doRNA
mensageiro (13).
PROTEINA 4.1
A proteina 4.1 esta presente
na quantidade de 200.000 c6pias
par celula. e eresponsavel par cerca
de 6% da proteina total da
membrana (2,15).E importante na
manuten(,;ao da estabilidade da
membrana.
E uma proteina com fun(,;ao
marcadamente facilitadora de
intera(,;oes; refor(,;a a liga(,;ao da
espectrina aactina, eaintermediaria
da liga(,;aoentre a espectrina e a
glicoforina C, liga-se a banda 3 e
estabelece liga(,;oescom as lipides
carregados negativamente da
superficie interna da bicamada
lipidica (1).
Na eletroforese em gel de
poliacrilamida, pelo metoda de
Laemmli,aparece sob duas formas,
4.1a e 4.1b com pesos moleculares
de 80 e 78 kDa respectivamente (7).
A forma 4.1 b predomina nos
reticu16citos enquanto a proteina
4.1 a e a principal forma nos
eritr6citos (2).
PROTEINA 4.2
E responsavel par aproxima-
damente 5% da proteina total da
membrana e esta presente na
quantidade de 200.000 moleculas
par celula. Apresenta peso molecu-
lar de 72 kDa e sua fun(,;aoparece
ser importante em manter as
liga(,;oesentre banda 3, anquirina e
proteina 4.1 (16).
PROTEINA 4.9 OU DEMATINA
Tern peso molecular de 48
kDa e faz parte das proteinas do
citoesqueleto do g16bulovermelho,
juntamente comaespectrina, actina
e proteina 4.1 (10).
ACTINA (PROTEINA 5)
Tern peso molecular de 43
kDa. A actina do gl6bulo vermelho
encontra-se aproximadamente em
cerca de 400.000 a 500.000 mole-
culas por cHula. estando a maior
parte associada ao citoesqueleto
participando do complexojuncional
constituido pelas protein as 4.1 e
4.9. glicoforina C, tropomiosina e
aducina 0,2).
PROTEINA 6 OU GLICERAL-
DEIDO-3-FOSFATO DESIDRO-
GENASE (GAPD)
It uma enzima monomerica
de peso molecular 35 kOa. Em
condil;oes fisiol6gicas. dois ter.;:os
da GAPOencontram-se ligados ao
segmento citos6lico da proteina 3
na forma inativa; a forma ativa e a
citos6lica livre (1).
TROPOMIOSINA (PROTEINA 7)
Atropomiosina eritrocitaria e
constituida de dois polipeptideos de
pesos moleculares 29 e 27 kOa
respectivamente, estando presentes
comodimeros em cerca de 70.000 a
80.000 moleculas por cHula, que
corresponde a mais ou menos 1%
do total de proteina da membrana
eritrocitaria (2,12).Terna fun.;:aode
estabilizar os filamentos de actina
que se dispoem longitudinalmente
ao longo da tropomiosina (1).
ADUCINA
A aducina e uma proteina
associada ao citoesqueleto da
membrana que contem duas subu-
nidades alfa ebeta compesos mole-
culares 103 e 97 kDa respectiva-
mente. formando urn heterodimero
presente na propor.;:aode 30.000
moleculas por celula. Promove a
liga.;:ao da espectrina a actin a
associando-se a actin a e complexos
espectrina-actina (2).
3. PROTEINAS INTEGRAlS
PROTEINA3
84·LAES&HAES
Tambem denominada protei-
na transportadora de ions, e a
proteina integral mais freqiiente na
membrana dogl6bulovermelhocom
cerca de 1.000.000demoleculaspor
cHula, eeresponsavelporaproxima-
damente 25% da quantidade total
deproteinadamembrana. Ternpeso
molecular de 90 a 100 kOa e
provavelmente se encontra na
membrana na forma de tetramero
(8.10,12).
A proteina 3 cataliza a troca
de ions inorganicos atraves da
bicamada lipidica. alem de facilitar
o transporte de agua. Contem ainda
determinantes antigenicos impor-
tantes para especificidade dos
grupos sangiiineos e reconhe-
cimento de celulas senescentes.
Finalmente. serve para ancorar 0
citoesqueleto a membrana atraves
das proteinas anquirina e 4.1 (8).
A por.;:ao citoplasmatica da
proteina 3 e urn importante sitio de
liga.;:ao para varias enzimas
glicoliticas como a gliceraldeido-3-
fosfato desidrogenase e aldolase, a
hemoglobina e hemicromos (1).
GLICOFORINAS
As glicoforinas (sialoglico-
proteinas) san urn grupo de pro-
teinas transmembrana que consti-
tuem os principais sialoglicopep-
tideos da membrana do eritr6cito
humano. Sao constituidas por 60%
de carboidratos, com acido sialico
comocarboidrato terminal (14).Sua
por.;:aoextema contem grupos com
cargas eletricas ou receptores.
mantidos a uma distancia apro-
priadadamembrana. Emsua por.;:ao
citos6lica ajudam a ancorar e
estabilizar 0 citoesqueleto atraves
de suas liga.;:oescoma proteina 4.1.
Sao identificadas atraves da
colora.;:ao pelo acido peri6dico
(base de Schiff-PAS), ap6s
eletroforese em gel de poliacri-
lamida e denominadas glicoforinas
A. B e C (5).
PROTEINA 4.5
It uma proteina integral
envolvida no transporte da glicose
nos eritr6citos O. 14).
4. METODOS DE ESTUDO
a estudo das proteinas da
membrana foi dificil inicialmente,
em vista de sua insolubilidade em
meio aquoso de for.;:a ionica
fisiol6gica (5).
Para estudar as proteinas da
membrana. houve urn longo
processo de desenvolvimento
tecnol6gico.emque 0primeiropasso
foiobter. ap6s hem6lise.membranas
com pouca hemoglobina ligada, 0
que foi possivel gra.;:as a lavagem
repetida dessas membranas com
tampoes de baixa for.;:aionica. As
prepara.;:oes resultantes. quase
isentas de hemoglobina. puderam
ser estudadas atraves de sua
desnatura.;:ao e posterior eletro-
forese em gel de poliacrilamida (1).
Todas as proteinas da
membrana dogl6bulovermelho san
solubilizadas em SOS (sulfato de
dodecil s6dico) e separadas por
eletroforeseemgeldepoliacrilamida
de acordo com0seu peso molecular
(5).Amigra.;:aodas proteinas se faz
do p610negativo para opositivo, e a
separa.;:ao ocorre basicamente em
fun.;:ao dos pesos moleculares,
podendo ser identificadas as
"bandas" ou proteinas 1, 2, 2.1, 3,
4.1.4.2.4.5.4.9.5.6 e 7 em ordem
decrescente do seu peso molecular
(Figura C).
A analise das proteinas da
membrana por eletroforeseemSOS-
gel de poliacrilamida (SOS-PAGE)
requer urn numero de precau.;:oes.
Emvirtude da membrana dogl6bulo
vermelho exibir atividade de varias
enzimas proteoliticas e recomen-
davel 0 uso de inibidores de protea-
ses no tampao utilizadopara a hem6-
lise e 0 preparo das membranas.
as metodos de eletroforese
emSOS-geldepoliacrilamida (SOS-
~i'11-·ET'-ESI'ECTR'N'
-2:3 ANQUIRINAS
-2.6
-4.' DEMATINA
-5 ACTIN"
GLICERAlOEIOO - ;)-
- FOSFATO DESIOROGENASE
1+1
Figura C - Representa98.0 esquematica das posi96es
adotadas pelas proteinas da membrana eritrocitaria
ap6s eletroforese em gel de poliacrilamida (SOS-
PAGE).
PAGE)utilizados para separac;;ao
das proteinas da membrana sao a
sistema de Laemmli (6) de tampao
descontinuo e a sistema de
Fairbanks (5) atraves de urn
gradiente de gel de poliacrilamida.
As proteinas sao analisadas ap6s
colorac;;aocom azul de Coomassie e
quantificadas par densitometria.
Atraves desses metod as podem ser
detectados disturbios protei cas da
membrana que levam ao apare-
cimentode anemias hemoliticas, tais
como esferocitose e eliptocitose
heredit<'i.ria.
4.1. PREPARO DO "GHOST"
(membrana eritrocitaria)
a sangue colhido em ACD e
filtrado em coluna de algodao para
remoc;;aodos leuc6citos segundo a
tecnica de Beutler (3).as eritr6citos
sao entao lavados tres vezes em
soluc;;aode NaCl O,154M a 4°C, e
em seguida feito a isolamento das
membranas pelometoda deDodge e
colaboradores (4).as eritr6citos sao
lisados na proporc;;aode 1:40 a 4°C
em tampao fosfato 5mMpH 8.0 com
PMSF(fluoretode fenilmetil sulfonil)
O,2mMcomo inibidor de proteases.
Sao feitas sucessivas lavagens das
membranas eritrocit<'i.riasno mesmo
tampao de lise par centrifugac;;aoa
25.000gpor lOminutosa4°Catese
obter "ghosts" brancos (isentos de
hemoglobina). Devem ser conser-
vadas a -70°Cquando nao utilizados
logo em seguida.
4.2. ELETROFORESE EM GEL DE
POLIACRILAMIDAEMPRESENCA
DE SDS (SDS-PAGE)
Reagentes necessarios:
eAcrilamida30%e Bisacrilamida0,8%
eTampaoTris-HCll,5MpH8.8
eTampaoTris-HClO,5MpH6.8
eSoluc;aodeSDS10%
eSolu¢odePersulfatodeAm6nia10%(APS)
eTEMED(Tetrametiletilenodiamina)
eTampaoTris-GlicinapH8.3comIOml/
LdeSDS 10%
A eletroforese e realizada
utilizando-se duas placas de vidro
(l6xI4. 5xO.4cm).ondeepreparado
a gel, sendo a gel de corrida au
separac;;ao(running gel)com 10%de
acrilamida e a gel de alinhamento
(stacking gel) com concentrac;;aode
3% onde se faz a molde para
aplicac;;aodas amostras.
Preparo do gel
"Running" gel" Stacking" gel
Agua bidestilada (mil 10,9 5,04
Tris-HClpH8.8 (ml) 6,75
Tris-HClpH6.8 (ml) 2,0
SDS10%(microlitroj 270 80
Acrilamida 300f0/BlS0,8% (ml) 9,0 1,0
APS 100mg/ml (microlitro) 89 130
TEMED (microlitro) 6,7 5,0
A acrilamida e polimerizada
atraves do persulfato de am6nia,
tendo como catalizador a TEMED.
Para promover a ligac;;aoentre as
filamentos de poliacrilamida, e
adicionado N,N'-metileno-bisacri-
lamida (BIS) e, como detergente
solubilizante, sulfato de dodecil
s6dico (SDS).
Asolubilizac;;aodas proteinas
do "ghost" e feita par adic;;aode
soluc;;ao solubilizante contendo
O,15Mde tampao Tris-HCl pH 6.8,
glicerol 30%, SDS 3%, O,37M de
ditiotreitol (DTDe a corante azul de
bromofenol 0, 05% na proporc;;aode
1:2, e incubac;;ao em banho-maria
fervente, durante 5 minutos.
As amostras sao aplicadas no
gel, em volumes contend a 80
microgramas de proteina determi-
nadas pelo metoda de Lowry e
colaboradores (9).
A corrida eletroforetica e
realizada a 25volts durante 18horas
utilizando tampao Tris-glicina
O,05MpH 8.3 comSDS. Acolorac;;ao
e feita em soluc;;ao de azul de
Coomassie 0,05% e a descolorac;;ao
em acido acetico a 10%. As faixas
reveladas sao lidas emdensit6metro,
calculando-se as valores percentuais
de cada banda protei ca.
4.2.2. Sistema de Fairbanks (5)
It utilizado quando se quer
obter alta resoluc;;aona separac;;ao
das proteinas de alto peso molecu-
lar (alfa e beta-espectrinas, anqui-
rinas).
A eletroforese e efetuada em
gel de corrida com gradiente de
concentrac;;ao de acrilamida de 3 a
17%distribuido com auxilio de uma
bomba peristaItica. Acorrida eletro-
foretica e feita em tampao Tris pH
7.4 com acetato de s6dio, EDTAe
SDS. A quantidade de proteina
aplicada na cavidade do gel e de 100
microgramas e a tempo de corrida
24 horas.
Alem dos metodos de eletro-
forese citados, as protein as podem
ser extraidas da membrana. As
proteinas integrais, que estao
emaranhadas na bicamada lipidica,
sao extraidas atraves de detergentes
fortes como a Triton X-I00; ja as
proteinas perifericas sao extraidas
par intermedio de tamp6es de
concentrac;;ao e pH variaveis (1).
agem de drogas de abuso:
rio em um painel
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IATM)
com proceclirnjnto de detec~aopatenteado
• Rapido:
7/8 Resultados em 10 mi-
nutos
• Seguro:
Os Resultados dos testes
soo garantidos pela leitu-
ra dos controles integra-
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• Especifico:
21 anticorpos mono-
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