bImobilização e aplicações industriais de enzimas Imobilização enzimática conceito, vantagens e limitações

Prévia do material em texto

WBA1114_v1.0
Enzimologia
Enzimas: propriedades gerais e 
cinética enzimática
Histórico, conceito e principais 
características
Bloco 1
Rayza Morganna Farias Cavalcanti
Introdução
• Você sabia? 
• Mais de 99% das reações relevantes para sistemas 
biológicos são catalisadas por enzimas.
• Mercado de enzimas movimentou US$ 9 bilhões em 
2019 (BBC, 2020).
Breve histórico:
• 7500 anos atrás: enzima na fabricação de queijo.
• 7000 a.C.: bebida alcoólica.
• 7.000 a 3.300 a.C.: processamento do couro.
(ALBERTS et al., 2017; ARIAS, 2013)
Histórico
• 1835 – Berzelius propôs o termo 
“catálise”.
• 1862 – Louis Pasteur concluiu a presença 
de uma “força vital” na fermentação.
• 1873 – Christian Hansen abriu a 
1º fábrica de enzimas.
• 1876 – Edward Buchner cunhou 
o termo enzima.
Em (em ou dentro) e zymos (leveduras).
6 12 6 3 2 2 
enzimaC H O CH CH OH CO⎯⎯⎯→ +
Fonte: ilbusca/iStock.com. 
Figura 1 – Louis Pasteur
(ARIAS, 2013)
Toda enzima é uma proteína?
Figura 2 – Estrutura de uma proteína com atividade catalítica
Fonte: adaptada de https://commons.wikimedia.org/wiki/File:225_Peptide_Bond-01_labeled.jpg Acesso em: 30 
mar. 2022.
Figura 3 – RNA com atividade catalítica
Fonte: adaptada de https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ribozyme.jpg. Acesso em: 30 mar. 2022.
Conformação nativa
Ribozima.
RNA mensageiro. Clivagem no RNA mensageiro 
mediado por ribozima.
.
RNA mensageiro clivado.
Propriedades gerais
• Enzimas
• Esteroespecíficas.
• Versatéis.
• Termodinamicamente favoráveis.
Cada enzima catalisa um tipo de reação, os produtos 
fornecidos dessa catálise podem ser o substrato seguinte da 
próxima reação catalisada por outra enzima. Esse mecanismo 
garante a existência da vida (NELSON; COX, 2014; VOET; 
VOET; PRATT, 2014).
Importante:
Catalisadores biológicos que 
aceleram reações químicas 
específicas sem a formação de 
produtos colaterais.
Nomenclatura e classificações - Enzyme Comission
Classe (EC) Nome Reação
1 Óxido-redutases
2 Transferases
3 Hidrolases
4 Liases
5 Isomerases
6 Ligases
 
2 2AH B A BH
⎯⎯→+ +⎯⎯
A 2B H O A
⎯⎯→+ ⎯⎯ H B+ OH
A X B A B⎯⎯→+ +⎯⎯ X
A B A B⎯⎯→+ −⎯⎯
A B A B⎯⎯→− −⎯⎯
X Y Y X
A B X Y A⎯⎯→= + − ⎯⎯ B
X Y−
Quadro 1 – Classificação das enzimas e suas respectivas reações
Fonte: elaborado pelo autor.
Enzimas: propriedades gerais e 
cinética enzimática
Especificidade, ajuste induzido e reações 
enzimáticas.
Bloco 2
Rayza Morganna Farias Cavalcanti
Especificidade enzimática
Região da enzima 
onde ocorre a 
reação: sítio ativo.
Fonte: 
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:1NFB_
IMPDH_Active_Site.png. Acesso em: 2 abr. 2022.
Figura 5 – Modelo chave fechadura proposto por Emil Fischer em 1894
Figura 4 - Sítio ativo da enzima
Fonte: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Enzymes_Lock_and_Key.png. Acesso em: 2 abr. 2022.
Ajuste induzido 
• Daniel Koshland (1958) - E e S se ajustam para otimizar o 
encaixe.
Fonte: Wiki/iStock.com. Fonte: 
https://commons.wikimedia.org/wiki/F
ile:Hexokinase_induced_fit.svg. Acesso 
em: 2 abr. 2022.
Figura 6 – Modelo ajuste induzido
Figura 7 – Enzima hexoquinase
Molécula de substrato Produto
Enzima original
Estágio 3
Estágio 2
Estágio 1
Sítio ativo muda a 
forma.
Sítio ativo.
Ligação do substrato.
Como as enzimas atuam?
Equação geral de uma 
reação enzimática. 
Barreira energética:
quantidade de energia 
necessária aos 
reagentes para a 
reação. 
Enzimas reduzem a 
∆G‡.
Não alteram o 
equilíbrio da reação.
Como as enzimas 
reduzem ∆G‡?
(NELSON; COX, 2014)
Figura 8 – Energia de ativação de uma 
reação na presença de enzima e sem 
enzima
31
2
KK
K
E S ES E P⎯⎯→ ⎯⎯→+ +⎯⎯ ⎯⎯
Fonte: 
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Catal
isis_enzimatica1.svg. Acesso em: 2 abr. 2022.
Sem enzima.
Energia de 
ativação 
com a 
presença 
de 
enzima.
Energia total 
liberada durante a 
reação.
Energia de ativação 
sem a presença de 
enzima.
Com enzima.
Avanço da reação.
Como as enzimas reduzem ∆G‡?
• Substrato na posição adequada.
• Estrutura enzimática. 
• Estado de transição.
Ligações iônicas.
Ligações de hidrogênio.
Interações hidrofóbicas.
Figura 9 – Etapas de uma reação química e o estado de transição ES
Fonte: adaptada de 
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Enzyme_catalysis_energy_levels.png. Acesso 
em: 1 abr. 2022.
Produtos.
Estado de 
transição.
Substratos.
Ligação. Catálise.
Quadro 2 – Mecanismos de catálise enzimática
Fonte: elaborado pela autora.
Mecanismos de catálise
Enzimas podem usar os três mecanismos em conjunto.
Catálise Mecanismo Exemplo
Ácido-base. Transferência de prótons.
RNase A pancreática 
bovina.
Covalente.
Formação transitória de uma ligação 
covalente entre a E e o S
Coenzimas com piridoxal
fosfato.
Íons metálicos.
Interações iônicas entre metais 
ligados a E e S auxiliam a estabilizar 
estados de transição.
Anidrase carbônica. 
Metaloenzimas.
Catalisadores químicos Catalisadores biológicos 
Enzimas: propriedades gerais e 
cinética enzimática
Estudo da velocidade das reações 
enzimáticas e a influência de diferentes 
fatores nos parâmetros cinéticos
Bloco 3
Rayza Morganna Farias Cavalcanti
Fatores que afetam a atividade enzimática
• Temperatura e pH.
• [] de Substrato.
• Demais compostos.
Desnaturação:
reversível ou 
irreversível.
Figura 10 – Influência do pH 
na atividade
Fonte: adaptada de 
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:
Effect_of_temperature_on_enzymes.svg. 
Acesso em: 17 maio 2022.
Figura 11 – Influência da 
temperatura na atividade
Fonte: adaptada de 
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:E
ffect_of_pH_on_enzymes.svg. Acesso em: 
17 maio 2022.
Ta
xa
 d
e 
re
aç
ão
.
Ta
xa
 d
e 
re
aç
ão
.
Figura 12 - Influência da [S] sobre a velocidade 
inicial de uma reação enzimática
Fonte: adaptada de 
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Michaelis-Menten-
bildlich.svg. Acesso em: 17 maio 2022.
Michaelis-Menten (1913)
1
2 3
1: V aumenta 
proporcionalmente 
com aumentos de S.
1 º ordem.
2: V aumenta, 
porém, não é 
proporcional ao 
aumentos de S.
3: V não aumenta –
saturação.
Cinética de ordem 
zero.
Km: Constante de 
Michaelis-Menten.
Usando catalisadores 
químicos não é possível 
observar Vmax.
Enzimas com 
dois substratos
- Michaelianas.
0
[ ]
[ ]
máx
m
V S
V
K S
=
+
Curva hiperbólica
(NELSON; COX, 2014)
Quadro 3 – Exemplos de parâmetros cinéticos relatados para algumas enzimas
Fonte: elaborado pela autora. 
Parâmetros cinéticos
Enzima Substrato Km (mM) Kcat (s
-1) Kcat/Km (s
−1 mM−1)
Invertase sacarose 2,50 818 1,7
Quitinase 4-nitrofenil-β 4,28 1,7 0,40
Tanase Ácido tânico 6,38 362,24 56,78
Lipase p-NPP 0,072 3,57 49,58
β-Galactosidase pNP-glicosídeo 2,70 6,00 2,22
Km
Grau de afinidade de uma 
enzima pelo substrato. 
Kcat
Número de “turnover”. 
Importante: massa molecular da 
enzima.
Kcat / Km
Eficiência catalítica.
[ ] 1 [ ]
[ ] 2[ ]
2 [ ] 2 [ ]
máx máx
m
m m
V V S S
K S S
K S K S
= ⎯⎯→ = ⎯⎯→ + =
+ +
[ ]mK S=
 
[ ]
máx
cat
V
K
Et
=
Modelo linear
• Equação de Lineweaver - Burk ou duplo - recíproco.
• Método de Hanes
Coeficiente 
angular.
Coeficiente linear.
 
0
1 1
[ ]
m
máx máx
K
V V S V
= +
Y = ax + b
1 m
máx máx
KS
S
v V V
= +
Fonte: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Lineweaver-Burke_plot.svg. Acesso 
em: 17 maio 2022.
Figura 13 – Gráfico duplo-recíproco de Lineweaver - Burk
Figura 15 - Curva sigmoide devido 
a presença do modulador
Fonte: adaptada de 
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:R
eaktionskinetik_ATCase.png. Acesso em: 17 
maio 2022.
Enzimas alostéricas
• Sítio regulador + sítio ativo = mudança conformacional.
• Cooperatividade – Coeficiente de Hill (n).
• Não obedecem a Cinética de Michaelis-Menten.
n>1: positiva; n<1: negativa
Figura 14 - Ligação do substrato e 
do modulador na enzima
Fonte: 
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Allosterischer_Modulator.svg. Acesso em: 17 maio 
2022.
R - Forma
Concentração de substrato [S]
V
e
lo
ci
d
ad
e 
d
e 
re
aç
ão
 [
V
]
T - Forma
Teoria em Prática
Bloco 4
Rayza Morganna Farias Cavalcanti
Situação problema
Uma enzima modificada demonstrou alto potencial para síntese de 
etanol a partir de cana-de-açúcar. A β-glicosidase libera glicose 
como produto da reação para, em seguida, fermentação e 
transformação em etanol.
O diretor do instituto onde a β-glicosidase modificada foi 
desenvolvida solicitou aos pesquisadores que traçassem um perfil 
de temperatura e do pH da atividade enzimática da β-glicosidase
modificada e não modificada, e determinassem os parâmetros 
cinéticos.
Você, como especialista em biotecnologia, deverá analisar os 
gráficos apresentados e formalizar um relatório com a escolha da 
melhor enzima para aplicação industrial.
Analisando os dados
3 4 5 6 7 8 9
0
2
4
6
8
10
A
ti
v
id
a
d
e
 e
n
z
im
á
ti
c
a
 (
U
/m
L
)
pH
 Não modificada
 Modificada
B)
30 40 50 60 70 80 90 100
0
2
4
6
8
10
A
ti
v
id
a
d
e
 e
n
z
im
á
ti
c
a
 (
U
/m
L
)
Temperatura (ºC)
 Não modificada
 Modificada
A)
Figura 16 – Influência da temperatura (A) e do pH (B) na atividade enzimática de 
β-glicosidase não modificada e modificada
• Não esqueça: relatar a importância dos perfis de temperatura e pH 
para analisar as potenciais aplicações das enzimas.
Fonte: elaborada pela autora.
Analisando os dados
Parâmetros 
cinéticos
Β - glicosidase não
modificada
β-glicosidase modificada 
Km (mM) 3,61 6,38
Vmáx 111,30 360,2
Kcat 111,93 362,24
Kcat/Km 31,00 56,78
Quadro 4 – Parâmetros cinéticos da β-glicosidase
Fonte: elaborado pela autora.
Kcat- número de renovação.
Kcat/Km – eficiência catalítica.
Resolução
• Enzima modificada pode ter sofrido desnaturação a 100 
°C, diferentemente da β-glicosidase não modificada.
• A temperatura e o pH ótimo foram a 50 °C e pH 5,0 em 
ambas as enzimas, porém, a β-glicosidase modificada 
exibiu maiores atividades.
• Maior afinidade ao substrato β-glicosidase não 
modificada.
• Maior Vmáx e eficiência catalítica β-glicosidase
modificada.
• Adicionar outros fatores podem afetar a atividade 
enzimática durante a sua aplicação.
Dicas do(a) Professor(a)
Bloco 5
Rayza Morganna Farias Cavalcanti
Prezado aluno, as indicações a seguir podem estar disponíveis 
em algum dos parceiros da nossa Biblioteca Virtual (faça o login
através do seu AVA). Algumas indicações também podem estar 
disponíveis em sites acadêmicos como o Scielo, repositórios de 
instituições públicas, órgãos públicos, anais de eventos 
científicos ou periódicos científicos, acessíveis pela internet.
Isso não significa que o protagonismo da sua jornada de 
autodesenvolvimento deva mudar de foco. Reconhecemos que 
você é a autoridade máxima da sua própria vida e deve, 
portanto, assumir uma postura autônoma nos estudos e na 
construção da sua carreira profissional. 
Por isso, te convidamos a explorar todas as possibilidades da 
nossa Biblioteca Virtual e além! Sucesso!
Leitura Fundamental
Indicação de leitura 1
O trabalho apresenta uma discussão sobre as diferentes 
equações lineares que podem ser utilizadas para calcular os 
parâmetros cinéticos Km e Vmáx e compara os valores obtidos 
empregando cada modelo matemático. 
Referência:
CARVALHO, N. M. F. et al. Uso de equações lineares na 
determinação dos parâmetros de Michaelis-Menten. Química 
Nova, v. 33, n. 7, p .1607-1611, 2010.
Indicação de leitura 2
Esta tese aborda a produção e caracterização da atividade 
enzimática da enzima quitinase sintetizada por Aspergillus
niveus e os experimentos para determinação dos parâmetros 
cinéticos Km, Vmáx, Kcat, Kcat/Km e coeficiente de Hill. 
Referência:
ALVES, T. B. Prospecção de proteínas bioativas secretadas por 
fungos filamentosos do gênero Aspergillus. 2017. 172 f. Tese 
(Doutorado em Biotecnologia) – Instituto de Química, 
Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2017.
Dica do(a) Professor(a)
O aplicativo “Enzimas” fornece uma lista de inúmeras enzimas 
encontradas no corpo humano, em animais e plantas. Você 
encontra imagens da molécula, propriedades gerais e 
informações sobre as reações catalisadas. 
O aplicativo “IMolview Lite” possibilita visualizar estruturas de 
enzimas em 3D cadastradas no Protein Data Bank. É possível 
observar a molécula de diferentes formas e selecionar regiões 
específicas.
Aproveite!
Referências
ALBERTS, B. et al. Fundamentos da biologia celular: uma introdução à biologia molecular da célula. 6. ed. 
Porto Alegre: Artmed, 2017. 
ARIAS, E. B. Compendio de enzimología. Espanha: Ediciones Universidad de Salamanca, 2013.
BUSINESS COMMUNICATION COMPANY (BCC) RESEARCH. Enzyme market size, share
& trends analysis report by application (industrial enzymes, specialty enzymes), by 
product (carbohydrase, proteases, lipases), by source, by region, and segment 
forecasts, 2020 -2027.
CAVALCANTI, R. M. F.; JORGE, J. A.; GUIMARÃES, L. H. S. Characterization of Aspergillus fumigatus CAS21 
tannase with potential for propyl gallate synthesis and treatment of tannery effluent from leather industry. 
3 Biotech, v. 8, 2018. 
GIRALDO, M. A. et al. Thermostable invertases from Paecylomyces variotii produced under submerged and 
solid-state fermentation using agroindustrial residues. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 
v. 28, p. 463–472, 2012.
MARZZOCO, A.; TORRES, B. B. Bioquímica básica. 4. ed. São Paulo: Guanabara Koogan, 2015.
NELSON, D. L; COX, M. M. Lehninger princípios de bioquímica. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. 
SMITH, W. S.; HALE, J. R.; NEYLON, C. Applying neutral drift to the directed molecular evolution of a β-
glucuronidase into a β-galactosidase: Two different evolutionary pathways lead to the same variant. BMC 
Research Notes, v. 4, n. 138, 2011.
THOMPSON, S. E. et al. Identification and Characterization of a Chitinase Antigen from Pseudomonas 
aeruginosa Strain 385. Applied and Environmental Microbiology, v. 67, n. 9, 2001.
ZHANG, X. et al. Chemical modification for improving catalytic performance of lipase B from Candida
antarctica with hydrophobic proline ionic liquid. Bioprocess and Biosystems Engineering, v. 45, p. 749-759, 
2022.
Bons estudos!