1 estudo dirigido - bioquímica experimental

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1º Estudo Dirigido 
 
 
 
 
 
Bioquímica Experimental 
 
 
 
 
 
 
 
Data: 06/08/2021 
 
 
 
 
 
 
 
1) Espectrofotometria 
 
a) A diferença de concentração entre as amostras da mesma substância mostra que para 
concentrações mais baixas o valor da absorvância também é menor. Apesar dessa alteração, os 
máximos das funções apresentam os mesmos valores de comprimento de onda, sendo apenas 
menos pronunciados. Além disso, essas substâncias não interagem, porque a absorvância é aditiva, 
então não formariam duas bandas distintas. 
 
b) A construção da curva analítica é importante, pois, dessa forma é possível verificar a Lei de 
Lambert-Beer, uma vez que a absorvância depende diretamente da concentração. A partir disso, 
uma aproximação possível é que a razão entre absorvância e a concentração num determinado 
ponto A deve ser igual a essa mesma razão num determinado ponto B. O comprimento de onda 
escolhido para o Azul de Bromofenol λ = 580 nm foi determinado observando o espectro de 
absorção, é a partir dele que geralmente se extrai a informação do melhor λ para uma avaliação 
quantitativa, esse λ se caracteriza pelo ponto em que ocorre a maior absorção, e nesse caso, sendo 
próxima a marca de 580 nm. 
 
2) Titulação de aminoácidos utilizando planilha de dados 
 
2.1) Inicialmente leva-se em consideração a equação de Henderson-Hasselbalch para que se tenha 
a razão do ácido desprotonado pelo ácido a partir do pH e dos pK’s. 
 
(A-)/(HA) = 10(pH-pK) 
 
Nesse caso: 
 
 pK1= 2,1 | (H2E)/(H3E
+) = 10(pH-2,1) 
pK2= 4,3 | (HE
-)/(H2E) = 10
(pH-4,3) 
pK3= 10,0 | (E
2-)/(HE-) = 10(pH-10,0) 
 
Considera a concentração total de ácido glutâmico sendo a soma das frações molares das diferentes 
espécies do ácido glutâmico. 
 
1 = [H3E
+] + [H2E] + [HE
-] + [E2-] 
 
Dividindo por [H3E
+] e colocando apenas em função de pH e pK: 
 
1/ [H3E
+] = 1 + 10(pH-2,1) + (10(pH-2,1) x 10(pH-4,3)) + (10(pH-2,1) x 10(pH-4,3) x 10(pH-10,0)) 
 
Usando as frações molares das espécies o cálculo da carga líquida pode ser calculado: 
 
Carga líquida = (+1 x [H3E
+]) + (0 × [H2E]) + (-1 x [HE
-]) + (-2 x [E2-]) 
 
Com tudo isso, podemos fazer o cálculo da carga líquida a partir do pH e pK’s. 
 
2.2 e 2.3) 
 
 
 
 
3) Técnicas de Fracionamento 
 
3.1) Separação de aminoácidos por cromatografia de troca iônica 
 
a) Neste caso, o aspartato (Asp) será eluido primeiro do que a lisina (Lys), visto que, em pH igual 
a 7,0, o Asp terá uma carga líquida igual a –1, enquanto a carga líquida da Lys será igual a +1. 
Portanto, como a lisina está carregada positivamente, ela vai interagir com a resina trocadora de 
cátions, consequentemente tornará a eluição deste aminoácido mais lenta e por isso o aspartato 
será eluido primeiramente. 
 
b) O aminoácido a ser eluido primeiro será a metionina (Met), porque ela possui uma carga líquida 
nula em pH igual a 7,0. Já a arginina (Arg), neste mesmo pH, possui carga líquida igual a +1. 
Ocorrerá uma interação da Arg com a resina trocadora de cátions devido a mesma estar carregada 
positivamente, portanto, fazendo com que a eluição deste aminoácido seja mais demorada do que 
a eluição da metionina. 
 
c) Apesar de nenhum dos dois aminoácidos estarem carregados positivamente em pH igual a 7,0 
e assim não havendo interação eletrostática com a resina trocadora de cátions, o aminoácido com 
carga líquida negativa se move mais rapidamente e elui primeiro. Diante disso, o glutamato (Glu) 
será eluido primeiro, pois possui uma carga líquida igual a –1 em pH igual a 7,0, enquanto a valina 
(Val) possui uma carga líquida nula. 
 
3.2) Separação de proteínas em função da força iônica 
 
Conforme aumenta-se a concentração do sal, aumenta-se também a força iônica da solução, assim 
a quantidade de água disponível para solvatar a proteína é reduzida, diminuindo as interações entre 
a água e as proteínas. Isso facilita a aglomeração, o que resulta na precipitação da proteína, então 
ocorre o fenômeno salting-out. Em consequência deste fato, a concentração de sulfato de magnésio 
(MgSO4) ideal para separar as proteínas A e B seria de aproximadamente igual a 3 M, onde têm-
se uma quantidade da proteína A precipitada, sendo possível separar este precipitado da solução 
rica em proteína B. É possível ainda precipitar a proteína B com o aumento da força iônica, ou 
seja, aumentando a concentração do sulfato de magnésio. 
 
3.3) Procedimentos experimentais para separação de proteínas 
 
a) Estimativa do pI e massa molecular (M.M.) da proteína alvo a partir da imagem resultante de 
uma eletroforese bidimensional: 
pI = 6,5 (aproximadamente) 
M.M. = 70 kDa (aproximadamente) 
 
b) O procedimento que melhor se adequa para purificação da proteína alvo é o procedimento 2. 
Considerando que o pI é igual a 6,5, a carga líquida da proteína será 1,5 unidades de pH acima do 
pI em pH = 8,0, sendo uma carga negativa elevada em comparação à carga líquida da proteína no 
procedimento 1 que utiliza pH = 5,5, onde a carga será apenas 1,0 unidade de pH abaixo do pI, ou 
seja, a carga final positiva não é tão elevada. Portanto, utilizando o procedimento 2, a proteína com 
uma carga negativa elevada estará bem fixada na resina trocadora de ânions do que uma proteína 
com uma carga negativa não tão elevada. Da mesma forma, no procedimento 1, a proteína com 
uma carga positiva seria eluida primeiramente do que uma proteína com carga positiva elevada e 
por isso não é um procedimento adequado.