Biologia Molecular (técnicas)

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BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA
CLONAGEM MOLECULAR
A clonagem molecular pode ser realizada
por meio de uma plasmídeo, para isso
necessita de:
+ vetor: molécula de DNA capaz de se
replicar de forma autônoma
(plasmídeo)
+ inserto: fragmento de DNA que
deseja replicar.
+ clone recombinante: resultado da
junção do vetor com o inserto.
O que deve ser analisado para a escolha
do material:
+ o organismo de interesse (o
mesmo define o material a ser
utilizado como vetor).
+ escolher o vetor.
+ escolher o inserto (DNA alvo).
+ realizar a ligação, construção do
clone recombinante (utiliza-se a
DNA ligase).
+ transformação (métodos para que
a bactéria capture o DNA).
+ propagação seletiva dos clones
(utiliza-se antibiótico para que seja
selecionadas as bactérias que
capturaram o plasmídeo).
Algumas informações sobre os itens
citados acima:
- a inserção do inserto é feita por
meio da clivagem do plasmídeo e
do fragmento de DNA alvo por
enzimas de restrição (utiliza-se
endonucleases do tipo II que
clivam sítios palindrômicos -
pode-se utilizar enzimas diferentes
no plasmídeo e no DNA alvo, o
importante é que seja gerado
extremidades compatíveis). A
ligação do inserto ao plasmídeo
necessita da DNA ligase.
Exemplo de um sítio palindrômico
- a transferência de material
genético para a bactéria pode ser
de diferentes tipos: conjugação
(por meio do Pilus), transformação
(utilizada no laboratório - a
bactéria capta o material genético
inerte no meio) e transdução (por
meio de um bacteriófago).
- a propagação seletiva de clones é
realizada por meio da modificação
do plasmídeo, adicionando não
somente o gene de interesse como
também um gene de resistência a
antibióticos que será responsável
por proporcionar as bactérias, que
capturaram o material genético,
inerte resistência.
Para que apresente eficiência na
replicação é necessário:
+ MSC (sítio múltiplo de clonagem):
local onde será inserido o inserto.
+ ser capaz de replicar na bactéria,
possuir origem de replicação
(sequência do DNA que possibilita o
início da replicação).
+ o plasmídeo necessita do gene de
resistência a antibiótico.
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Formas de se realizar a transdução:
● Eletroporação: a suspensão de
bactérias, postas em uma cubeta,
recebe choque elétrico/choque
térmico para que seja gerado poros
na membrana possibilitando a
passagem do clone recombinante.
● Cloreto de cálcio: primeiramente a
suspensão de bactérias é
submetida a uma temperatura de
40°C (torna a membrana mais
fluida), porém, a presença de
cargas negativas na membrana e
no plasmídeo geram repulsão por
isso, adiciona-se o cloreto de
cálcio que irá revestir os canais
com carga positiva permitindo a
passagem.
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Outra forma de realizar a seleção das
bactérias:
O gene LacZ tem seu início no MSC, isto é,
o mesmo será clivado da bactéria para
que seja realizada a inserção do DNA
alvo. Logo, uma forma de saber-se a
bactéria adquiriu o plasmídeo é por meio
da adição de bactérias em um meio com X
Gal; quando a bactéria não capturou o
clone recombinante, o gene LacZ está
presente e é induzido para a produção de
B-galactosidase, com isso, há a quebra do
X Gal gerando a molécula de Indol
(gera-se também galactose) que ao reagir
com outra molécula de Indol fará a
bactéria apresentar a cor azul. Dessa
forma, identifica-se com a cor azul as
bactérias que não são de interesse.
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As características para o plasmídeo já
citadas é condizente apenas com a
replicação. Para que seja expressas
proteínas, é necessário:
+ Promotor - forte: que o mRNA se
liga com alta afinidade - e
regulável: que apresenta um
operador para que a expressão seja
condizente com a necessidade.
+ Sequência Shine Dalgarno:
sequência à montante do promotor
que permite a ligação do
ribossomo.
+ Sequência do término da
transcrição.
+ Sequências de início e término da
tradução.
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Por que utiliza-se proteínas
recombinantes?
Possibilidade de maior controle da
atividade e qualidade da proteína
heteróloga e, ademais, um controle sobre
possíveis contaminações.
Um exemplo de proteína heteróloga: a
insulina comercializada.
O termo proteína heteróloga é devido a
impossibilidade que aquela expressão
ocorra naturalmente (ex: é impossível que
bactérias produzam insulina).
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CURIOSIDADE:
O produtor humano é o TATA box, porém, o
mesmo não é reconhecido pelas bactérias.
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O operon Lac - um exemplo de operador;
regula a expressão de 3 genes
responsáveis pela degradação de lactose;
em bactérias recombinantes, não utiliza-se
a lactose como indutor (a mesma
necessita de um transportador para que
ocorra seu transporte pela membrana
bacteriana), utiliza-se o IPTG - atravessa
facilmente a membrana, se liga de forma
estável ao repressor e não é degradado
pela B-galactosidase (permanece por mais
tempo ligado ao repressor possibilitando
que a transcrição ocorra por mais tempo).
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A leitura do código genético é realizada
em trincas (códons) e a mesma
apresentam correspondentes (anticódons)
do tRNA que adicionam aminoácidos
formando a proteína.
MATRIZ DE LEITURA
Quando o ribossomo não consegue
identificar a matriz de leitura para que haja
a produção de uma determinada proteína.
Logo, é necessário que o éxon de
interesse seja colocado em uma situação
em que seja possível a sua leitura.
Para isso, foram criados os plasmídeos de
expressão com características específicas;
os mesmos possuem todas as
características já descritas (códon de
início -ATG-, promotor, MSC, origem de
replicação,...) e, ademais, a clivagem
diferencial propicia 3 diferentes formas de
leitura que devem ser analisadas para a
escolha da que favorece a leitura do gene.
A bactéria apresenta várias modificações;
cromossomo recombinante - retira-se
alguns genes e adiciona-se genes como o
T7 RNA polimerase, o mesmo será
responsável pela RNA polimerase que
reconhece com alta afinidade o promotor
T7.
Essa bactéria produzirá uma grande
quantidade de RNA polimerase para que
reconheçam várias moléculas de DNA do
plasmídeo e produzir mRNA que será útil
para a produção de proteínas.
As proteínas heterólogas vão estar
misturadas às proteínas da própria
bactéria, logo, deve-se realizar a
purificação realizada por meio da
cromatografia.
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Cromatografia de troca iônica
Consiste na separação dos componentes
da uma dada mistura baseado na
interação dos mesmos com a fase
estacionária e com a fase móvel.
A cromatografia de troca iônica é uma das
técnicas usadas na separação e
purificação de proteínas. Depende do pI
da proteína e do pH da solução.
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Após a separação, as proteínas
recombinantes são incubadas com uma
enzima que quebra a junção entre a
sequência de interesse e a de não
interesse. Essas sequências apresentaram
diferença de tamanho e assim, pode-se
utilizar a cromatografia de exclusão
molecular ou a eletroforese para a
separação.
Essa técnica de DNA recombinante
possibilita a produção de:
+ anticoagulantes e fatores da
coagulação;
+ eritropoetina;
+ fatores de crescimento;
+ insulina humana;
+ interferons e interleucinas;
+ hormônio de crescimento;
+ antígenos recombinantes;
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ELETROFORESE EM CAMPO PULSÁTIL
A eletroforese convencional promove a
separação de DNA de acordo com seu
tamanho, porém, há como limitação
fragmentos maiores que 30 Kb que
migraram na mesma velocidade
independente do tamanho.
Utiliza-se da corrente elétrica gerada
devido a diferença de potencial gerada (o
DNA e proteínas apresentam cargas
negativas e por isso migram do polo
negativo para o positivo).
Pode-se utilizar o gel de agarose ou o gel
de poliacrilamida.
A eletroforese em campo pulsátil (PFGE)
separa fragmentos maiores.
A necessidade veio devido à necessidade
de separar fragmentos maiores que30.000
pb (o máximo no gel de agarose). Essa
técnica, PFGE, possibilita a separação de
fragmentos com até 10 Mb.
COMO FUNCIONA ?
São gerados pulsos elétricos alternados.
Em cada cuba de eletroforese haverá 6
eletrodos (3 + e 3 -).
Esses pulsos alternados forçam o DNA a se
reorientar (alterar a orientação da
migração).
OBS: quando o pulso de um eletrodo está
ligado o outro está desligado, por isso há a
alternância.
Para separar fragmentos menores, o tempo
de um pulso ligado ocorre em torno de
15-20 segundos, a alternância persiste por
um período de 18-24 horas.
+ Quanto maior o tempo de
alternância entre os pulsos maior o
fragmento separado.
Em casos de fragmentos maiores, há um
aumento do tempo entre os pulsos (1 - 1,5
minuto) por um período maior (quase por
1 semana); nesses casos, necessita-se de
um sistema de resfriamento para que os
sais do tampão não se superaqueça de
forma a derreter o gel.
Enquanto na eletroforese necessitava-se
de uma informação primária de qual parte
do genoma para investigar modificações
em bactérias, na eletroforese em campo
pulsátil é possível analisar diferentes
partes do genoma bacteriano.
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Bactérias indistinguíveis: perfil genético
semelhante.
0 mutações e 0 pb diferentes
Bactérias intimamente relacionadas: um
único evento mutacional as diferem.
1 mutação e de 1-3 pb diferentes
Bactérias possivelmente relacionadas: dois
eventos mutacionais.
2 mutações e de 4-6 pb diferentes
Bactérias diferentes: três ou mais eventos
mutacionais.
3 ou + mutações e 7 ou + pares de bases
diferentes.
As informações acima são de extrema
importância quando:
- investiga-se uma cepa bacteriana
que pode estar relacionada a um
surto epidemiológico.
- cepa bacteriana de um
determinado local geográfico.
- investigando o surgimento de
novas cepas bacterianas.
OBS: as análise são feitas por meio de
comparações com uma cepa de referência.
Para facilitar o trabalho, utiliza-se o
dendograma, gráfico que apresenta
bifurcações para cada divergência
encontrada entre as amostras analisadas.
Mais bifurcações = Maior diferença
genética.
Muitas vezes as técnicas usuais de
purificação ocasionam a fragmentação do
DNA (erro no manuseio ou erros na
pipetagem), com isso, foi estipulado um
protocolo de purificação.
Fragmentos de restrição
O tamanho do fragmento depende da
enzima de restrição utilizada.
Se a enzima confere a clivagem de 50% de
C-G e 50% de A-T, logo, o fragmento
apresenta 25% (¼) de cada base.
Em um fragmento ACGT = ¼ ^4 = 1/256
Ou seja, a cada 256 pb a enzima realizará 1
corte.
Depende do fragmento, exemplo:
AACGTT = ¼ ^6 = 1/4096= 1 corte a cada
4096 pb.
Eletroforese bidimensional
Devido as limitações da eletroforese
convencional. A eletroforese bidimensional
pode separar as proteínas com base a dois
fatores (ponto isoelétrico e tamanho).
1ª etapa: separação pela carga - solução
solubilizada que dissocia as cadeias
polipeptídicas mas mantém as cargas.
As cadeias são separadas em um gradiente
de pH, é denominado focalização
isoelétrica.
2ª etapa: separação por tamanho -
eletroforese com adição do detergente
SDS.
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PCR: FUNDAMENTOS E APLICAÇÕES
A PCR é baseada em: desnaturação da fita
inicial, associação dos priamers e
amplificação.
Elementos necessários:
- Mg²+ (cofator)
- primers
- DNA polimerase
- fita molde DNA
- dNTP
- tampão
● a ordem de colocar é do inorgânico
para o orgânico, sempre colocando
os de maiores volumes primeiro.
Primers
Os primers garantem a especificidade da
PCR, isto é, somente uma região será
amplificada.
Necessita-se de no mínimo 16
nucleotídeos, no máximo 22, para que a
associação seja apenas na região
específica.
O primer com a mesma direção que a fita
de referência - primer forward (direto). O
primer na outra direção é o primer reverso.
Com os primers anelados, já pode iniciar a
PCR; os produtos gerados serão analisados
em gel de agarose ou poliacrilamida.
Os primers reconhecem regiões
específicas, mas com tamanhos diferentes
em cada cromossomo.
Nesse exemplo, M possui 2 bandas. Isso
não está relacionado à falta de
especificidade do primer e sim com o
reconhecimento de duas regiões com
tamanhos diferentes em cromossomos
diferentes. Já o F apresenta apenas uma
banda pois, herdou dos pais sequências de
tamanhos iguais em cromossomos
diferentes.
A diferença não está relacionada a
sequência do primer e sim na região
amplificada.
PCR - RFLP
O resultado da amplificação da PCR é
clivada/digerida por enzimas.
É possível observar-se duas bandas nas
amostras 1, 2 e 3 - foram digeridas com
enzimas.
RT-PCR
É realizado uma PCR utilizando um DNA
advindo de um RNA, para isso utiliza-se a
transcriptase reversa.
- utilizada para a análise de
microrganismos que possuem o
material genético na forma de RNA.
- análise da expressão de um gene.
A transcriptase reversa é utilizada para que
seja formada a fita de cDNA que será
amplificada para análise.
Exemplo de uso: para analisar a expressão
de determinados genes em diferentes
células.
Para controle, utiliza-se o cDNA advindo de
um RNA expresso em diferentes células
(exemplo: actina).
PCR x PCR quantitativa
A PCR convencional é qualitativa; não é
possível inferir quantidade com relação à
intensidade da banda. Só permite
identificar a presença ou não de
determinada sequência na amostra.
Para superar essa limitação foi criado
equipamentos que permitem analisar a
quantidade.
qPCR - PCR em tempo real
Na qPCR a detecção dos produtos é
realizada em cada ciclo a partir de sondas
fluorescentes (fluoróforos) que se
acumulam a medida que a reação ocorre.
+ positiva: quando há amplificação
- negativa: quando não há
amplificação
Tipos de marcadores fluorescentes:
SYBRGreen - não se associa à fitas
simples; intercala com fitas duplas.
Vai intercalando durante a formação da
dupla fita liberando fluorescência.
Problemas: intercala com qualquer dupla
fita, logo, é difícil analisar mais de um
produto ao mesmo tempo na qPCR com
SYBRGreen (não é possível diferenciá-los)
- só emite uma cor.
Vantagens: mais barato e mais versátil -
quando é necessário a análise de apenas
um produto, sua aplicação é ótima.
TaqMan - sequência complementar a
região de interesse + sondas nas
extremidades (fluoróforo chamado de
repórter (R) e outro fluoróforo chamado
quencher (Q)).
O Q neutraliza a fluorescência do R.
A DNA polimerase quebra a relação do R
com o DNA fazendo com que fique longe
da influência do Q e, com isso, há emissão
de fluorescência que será detectada pelo
equipamento.
Vantagem: mais específico que o
SYBRGreen.
Permite que seja realizado a análise de
mais de um produto de uma única vez
pois, emitem mais de uma cor.
Desvantagem: mais caro.
O custo elevado se deve da compra dos
dois primers necessários e das sondas Q e
R para as extremidades.
Threshold - limiar de detecção (Ct)
É onde há o acúmulo de fluorescência de
amplificação - positiva.
Ct (ciclo limiar) = define se a amostra é
positiva ou negativa.
Cq (ciclo de quantificação) - utilizado para
comparação.
+ Quando mais cedo o Ct = maior
quantidade de ácidos nucleicos.
Para que seja analisado (comparado) as
duas curvas, usa-se que a análise está
próximo a 100%, logo, Cq= 2^Delta Ct.
Quantificação relativa, quando a
comparação analisa quantas vezes mais.
Quantificação absoluta, quando é indicado
exatamente o valor.
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NOVAS ABORDAGENS PARA
SEQUENCIAMENTO E ANÁLISE DE
GENOMAS
Genoma: conjunto de todas as regiões,
codificantes e não-codificantes, em um
indivíduo.
Transcriptoma: conjutno de sequências
transcritas - mRNA.
Proteoma: conjunto de proteínas expressos
em um determinado tipo celular.
+ as ômicas são referentes ao
conjunto.
FERRAMENTAS PARA O ESTUDO DO GENOMA:
+ enzimas de restrição
+ clonagem (plasmídeo)
+ método de Sanger (DNA alvo +
primer + dNTPs + tampão + DNA
polimerase +...)
+ sequenciamento automatizado
Na clonagem, pode-se utilizar um primer
compatível com o vetor e adicionar a DNA
polimerase e os dNTPs - assim,
descobre-sea sequência do inserto.
- criação de bibliotecas genômicas
- demora muito
REPRESENTAÇÃO EM GENOTECA:
Para que seja representado um genoma
com 36 Mb, é necessário 18.000 clone,
cada um com 2.000 pb = 18.000 x 2.000 =
36 Mb.
Para uma representação, é necessário 8x
maior que o genoma.
SEQUENCIAMENTO EM LARGA ESCALA:
Como a sequência completa do DNA é
longa, utiliza-se enzimas de restrição para
clivagem. Os fragmentos são inseridos nos
vetores para a clonagem.
Com a clonagem, descobre-se a sequência
e a cliva, separando da sequência do
plasmídeo.
Porém, não conhece a sequência correta.
Para resolver o problema, utiliza-se de
programas computacionais e a técnica de
fragmentação do DNA com extremidades
iguais. É uma técnica onde as
extremidades com extremidades iguais são
sobrepostas de forma que haja
redundância, gerando a ordem de encaixe
correta.
As redundâncias são denominadas
sequências contíguas; para que não haja
redundância, essa sequência será lida
apenas uma vez. A organização final (sem
redundância) é denominada sequência
consenso.
Na imagem, as pequenas sequências em
vermelho indicam as sequências contíguas.
Pode ocorrer a super representação de
sequências, porém, pode ser corrigida por
outras ferramentas de análise.
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NOVAS GERAÇÕES DE SEQUENCIAMENTO:
As novas gerações de sequenciamento não
necessitam de todo o processo de
clonagem citado acima. Não necessitam
de biblioteca genômica e nem de
plasmídeo; para substituir, são adicionados
adaptadores nas extremidades dos
fragmentos de interesse.
Permite o sequenciamento em larga escala
em menor tempo.
Baixo custo em relação ao seu alto
rendimento.
É possível realizar várias reações ao
mesmo tempo dentro do chip.
AGORA:
O DNA é fragmentado e na extremidade
dos fragmentos é adicionada uma
sequência conhecida e pequena para que
os primers possam ser ligados.
PASSO A PASSO:
1. Fragmentação do DNA genômico e
ligação dos adaptadores.
2. Hibridação para superfície sólida +
fragmentação para formação de
clusters.
3. Utiliza-se nucleotídeos marcados
com fluorescência que emitem luz
quando incorporados, a luz é
registrada.
Pode ser realizado em sequenciamento
genômico de novo ou, de uma genoma já
conhecido.
PIROSEQUENCIAMENTO
É possível sequenciar em poucas horas.
1. O DNA é fragmentado e às suas
extremidades são incorporados
adaptadores (A=verde e
B=vermelho) permitindo que os
DNAs possam ser separados.
2. Seleciona-se apenas os fragmentos
que adquiriram os adaptadores.
3. PCR emulsão: os fragmentos se
ligam à microesfera por meio do
adaptador B (o mesmo pareia com
sequências compatíveis presentes
na microesfera).
Há apenas um único tipo de
filamento de DNA que pareia por
complementaridade.
A microesfera é posto em emulsão
de óleo formando uma gotícula
(cada gotícula há uma
microesfera). É nesse momento
que ocorre a PCR emulsão.
4. Tira-se essas microesferas com os
fragmentos amplificados e inicia-se
o sequenciamento.
Uma microesfera em cada poço -
coloca-se os reagentes e a reação
ocorre liberando fosfato inorgânico,
o mesmo é pego pela sulfurilase e
transformado em ATP. O ATP é
transformado em oxiluciferina e luz
pela luciferase.
A luz emitida em todos os poços
são capturadas pelos sensores e
registradas.
Essa sequências serão
decodificadas por softwares.
OBS: Quando há um pico 2x maior que
outro, é indicativo que há 2 bases iguais na
sequência (ex; AA). Quando 3x maior (AAA)
APLICAÇÕES:
1) Pesquisa em saúde reprodutiva,
doenças hereditárias, microbiologia
e câncer.
2) Confirmação de edição genômica.
3) Genotipagem de HIV-1 para
detectar resistência a
medicamentos.
4) Sequenciamento de novo.
5) Identificação de amostras
humanas.