anexo II COLORAÇÃO ZN procedimento

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FACULDADE COSMOPOLITA 
PRÁTICA DE MICROBIOLOGIA 
PROFª MSC. EDINA RAQUEL 
 
MÉTODO DE COLORAÇÃO ZIEHL-NEELSEN 
A parede celular das micobactérias, responsável pela morfologia bacilar, tem em sua 
constituição química diversos lipídios, entre eles os ácidos micólicos. A ligação de alguns 
desses lipídios com o corante fucsina gera complexos que são responsáveis pela característica 
tintorial de resistência à descoloração por soluções álcool-ácidas (bacilos BAAR). 
 
1. FIXAÇÃO DO ESFREGAÇO 
 Retirar da bandeja cada lâmina de uma vez, com a pinça anatômica, com o esfregaço 
voltado para cima e passar rapidamente, por três vezes, sobre a chama do bico de Bunsen. 
 Devolver a lâmina, com o esfregaço fixado, para a bandeja de metal. Repetir os 
procedimentos 1 e 2 até fixar todos os esfregaços. 
 Transportar a bandeja de metal para a bancada onde as lâminas serão coradas. 
Observação: depois de fixados, os esfregaços ficam aderidos às lâminas e estão prontos 
para a coloração. 
 
2. PROCEDIMENTO DE COLORAÇÃO 
Reagentes: » solução de álcool a 70%; » álcool etílico comercial; » fucsina fenicada a 0,3%; » 
solução descorante de álcool-ácido a 3%; » azul de metileno a 0,3%. 
 
1. Colocar as lâminas (no máximo 12 de cada vez) no suporte para corar com o esfregaço 
voltado para cima, sem encostar umas nas outras, e de acordo com o número de ordem de 
registro. 
2. Forrar um funil de vidro com papel de filtro e filtrar a fucsina fenicada a 0,3% para dentro do 
frasco conta-gotas. Filtrar apenas o volume suficiente para cobrir os esfregaços das lâminas 
que você vai corar. 
3. A fucsina também pode ser filtrada diretamente sobre as lâminas a serem coradas, sem o 
uso do frasco conta-gotas. 
4. Cobrir com a fucsina filtrada todo o esfregaço de cada uma das lâminas. 
Observação: é fundamental filtrar a fucsina, na hora do uso, para retirar os cristais que 
se formam quando ela está em repouso. 
5. Enrolar um chumaço de algodão na ponta de uma haste de metal com proteção contra 
aquecimento em uma das extremidades. 
6. Umedecer o algodão com álcool etílico, cuidando para não escorrer na haste. 
7. Colocar fogo no algodão umedecido com álcool etílico. 
 8. Passar a chama lentamente por debaixo das lâminas até que ocorra a emissão de vapores 
visíveis. Retirar imediatamente a chama para evitar que a fucsina ferva. 
ATENÇÃO: também pode ser usado o bico de Bunsen para realizar o aquecimento das lâminas 
com fucsina, substituindo o algodão com álcool. 
9. Marcar o tempo de cinco minutos assim que ocorrer a primeira emissão de vapores, e repetir 
o passo 8 mais duas vezes. Isso significa que, ao todo, deve-se passar três vezes a chama 
lentamente até a emissão de vapores e essa operação deve durar cinco minutos a contar da 
primeira emissão de vapor. 10. Inclinar cada uma das lâminas e derramar a fucsina na pia. 
11. Abrir devagar a torneira até obter um filete de água corrente para lavar as lâminas. 
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12. Deixar o filete de água cair em cima do número de cada lâmina, para que escorra 
suavemente sobre o esfregaço até eliminar todo o corante. 
 
13. Lavar também o lado oposto ao esfregaço de cada lâmina para eliminar a fucsina ali 
depositada, e, se necessário, passar uma gaze para retirar a fuligem do fogo aderida ao lado de 
baixo da lâmina. 
14. Colocar cada lâmina novamente no suporte com o esfregaço voltado para cima. 
15. Repetir os itens de 10 a 12 para todas as lâminas que estão com fucsina. 
 
Descoloração do esfregaço pelo Método de Ziehl-Neelsen: 
1. Cobrir completamente cada lâmina com a solução descorante de álcool-ácido a 3% e esperar 
um minuto. 
2. Segurar cada lâmina pela borda numerada, inclinar e derramar a solução descorante na pia. 
3. Deixar o filete de água corrente cair em cima do número de cada lâmina para que escorra 
suavemente sobre o esfregaço e eliminar o álcool-ácido. 
ATENÇÃO: os procedimentos de 1 a 3 não devem ultrapassar três minutos, considerando os 
esfregaços de todas as lâminas que estão sendo descoradas. 
4. Verificar se os esfregaços foram descorados. Considera-se descorado o esfregaço que 
apresentar coloração esbranquiçada ou levemente rosada. Observação: repetir o passo de 1 a 
3 se a lâmina não se apresentar descorada adequadamente. 
 5. Repetir os itens de 2 a 4 para todas as lâminas que estão com a solução descorante de 
álcool-ácido a 3%. 
 
Coloração de fundo pelo método de Ziehl-Neelsen: 
1. Forrar um funil de vidro com papel de filtro e filtrar o azul de metileno a 0,3% em um frasco 
conta-gotas. Filtrar apenas o volume suficiente para cobrir o esfregaço das lâminas que vão ser 
coradas. O azul de metileno também pode ser filtrado diretamente sobre as lâminas a serem 
coradas, sem o uso do frasco conta-gotas. 
2. Cobrir o esfregaço de cada uma das lâminas com o azul de metileno já filtrado. 
3. Esperar um minuto. 
4. Segurar, com uma pinça anatômica e pela borda numerada, e inclinar cada lâmina para 
derramar o azul de metileno na pia. 
5. Deixar cair um filete de água corrente em cima do número da lâmina, para que escorra 
suavemente sobre o esfregaço até eliminar todo o azul de metileno. 
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6. Girar cada lâmina e lavar também o lado oposto ao esfregaço para eliminar o azul de 
metileno depositado ali. Passar uma gaze para retirar corantes aderidos ao lado de baixo da 
lâmina. 
7. Colocar cada uma das lâminas em pé, para secar em uma estante de tubos. Essa estante 
deve estar forrada com papel-absorvente, de preferência papel de filtro. 
ATENÇÃO: a estante com as lâminas deve ficar ao abrigo da luz solar. Quando as lâminas 
estiverem secas, proceder a leitura microscópica e a interpretação dos resultados. 
 
3. REFERÊNCIAS 
Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Doenças 
de Condições Crônicas e Infecções Sexualmente Transmissíveis. Manual de 
Recomendações para o Diagnóstico Laboratorial de Tuberculose e Micobactérias 
não Tuberculosas de Interesse em Saúde Pública no Brasil. – Brasília: Ministério da 
Saúde, 2022. 492 p.: il. ISBN 978-65-5993-146-0.