Aula 8 - Nutrição e Crescimento microbiano

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Aula 8 
 Nutrição e Crescimento microbiano
Microbiologia Geral
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Profª Cristina Ferreira Silva e Batista
Cronograma da aula
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Química e nutrição celular
Classificação nutricional dos microrganismos
Fatores que afetam o crescimento microbiano
Meios de cultura e cultivo em laboratório
Crescimento microbiano
Mensurando crescimento populacional
Introdução
Alguns são tão exigentes quanto o homem e outros animais.
Todos os organismos vivos compartilham algumas necessidades nutricionais em comum:
carbono
nitrogênio
água
De todos os organismos vivos, os microrganismos são os mais versáteis e diversificados em suas exigências nutricionais.
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Introdução
Em algumas situações os microrganismos são estudados em seu hábitat natural.
	Ex.: Fendas termais, sistemas de tratamento de resíduos, solo
Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e bioquímicas) é necessário o cultivo em laboratório.
Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais 
Cultivo in vivo: quando exigências nutricionais específicas são desconhecidas.
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Química e Nutrição Celular
Composição de elementos químicos 
de uma célula bacteriana
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Todos os nutrientes microbianos são originados dos elementos químicos. Contudo, somente alguns poucos elementos dominam os sistemas vivos e são essenciais: hidrogênio (H), oxigênio (O), carbono (C), nitrogênio (N), fósforo (P), enxofre (S) e selênio (Se). Adicionalmente a estes, pelo menos 50 outros elementos químicos, embora não sejam requisitados, são metabolizados de alguma forma pelos microrganismos.
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Composição de elementos químicos 
de uma célula bacteriana
Contribuição dos elementos essenciais para o peso seco da célula.
Composição macromolecular de uma célula
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Além da água, que corresponde a 70 a 80% do peso seco de uma célula microbiana (uma única célula de Escherichia coli pesa apenas 10–12 g), as células consistem principalmente de macromoléculas – proteínas, ácidos nucleicos, lipídeos e polissacarídeos; os blocos de construção (monômeros) dessas macromoléculas são os aminoácidos, nucleotídeos, ácidos graxos e açúcares, respectivamente. As proteínas dominam a composição molecular de uma célula, correspondendo a 55% do peso seco total celular. Além disso, a diversidade de proteínas excede aquela de todas as macromoléculas combinadas. 
Em qualquer célula microbiana, carbono e nitrogênio são macronutrientes importantes, por isso, inicia-se o estudo sobre nutrição microbiana com esses elementos essenciais.
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Porcentagem 	
Proteína	Lipídeo	Polissacarídeo	Lipopolissacarídeo	DNA	RNA	55	9.1	5	3.4	3.1	20.	5	
Elementos químicos como nutrientes
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Macronutriente
Necessários em grande quantidade. Tem papel importante na estrutura e metabolismo.
Micronutriente
Quantidades mínimas. Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas.
Macronutrientes
Os elementos químicos principais para o crescimento das células incluem C, N, H, O, S e P 
Tem papel na estrutura e metabolism.
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Carbono
Fontes: 
Compostos orgânicos: aminoácidos, ácidos graxos, açucares, bases nitrogenadas.
Inorgânico: dióxido de carbono – CO2 – autotróficos.
Os compostos orgânicos são os que contém carbono.
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O carbono é um dos elementos mais importantes para o crescimento microbiano – todos requerem carbono.
O carbono é o esqueleto estrutural da matéria viva; é necessário para todos os compostos orgânicos que constituem uma célula viva. Metade do peso seco de uma típica célula bacteriana é composta de carbono. 
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Nitrogênio
É elemento mais abundante depois do C, cerca de 12%
DNA
RNA
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Fontes:
Compostos orgânicos: proteínas, aminoácidos, bases nitrogenadas	
Compostos inorgânicos: gás nitrogênio (N2), nitrato (NO3-), amônia (NH3)
Praticamente todos os procariotos são capazes de utilizar o NH3 como sua fonte de nitrogênio, embora outros possam também utilizar o NO3 –, e alguns conseguem ainda utilizar fontes orgânicas de nitrogênio, como os aminoácidos. O N2 só consegue ser utilizado como uma fonte de nitrogênio por procariotos fixadores de nitrogênio.
Os organismos utilizam o nitrogênio essencialmente para formar o grupo amino dos aminoácidos das proteínas. Muitas bactérias obtêm esses compostos da decomposição de material contendo proteína e reincorporando os aminoácidos em novas proteínas sintetizadas e outros compostos nitrogenados. Outras bactérias utilizam o nitrogênio dos íons amônio (NH4), que já estão na forma reduzida e, em geral, são encontrados no material celular orgânico. Outras bactérias são capazes de derivar o nitrogênio dos nitratos (compostos que se dissociam para produzir o íon nitrato NO3 em solução).
Algumas bactérias importantes, incluindo muitas das cianobactérias fotossintéticas , utilizam o nitrogênio gasoso (N2) diretamente da atmosfera. Esse processo é chamado de fixação de nitrogênio. Alguns organismos que podem utilizar esse método são de vida livre, a maioria no solo, mas outros vivem cooperativamente em simbiose com as raízes de leguminosas, como trevo, soja, alfafa, feijões e ervilhas. O nitrogênio fixado na simbiose é utilizado tanto pela planta quanto pelas bactérias
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Hidrogênio
Função do H:
Manutenção do pH
Formação de ligações de H entre moléculas 
Serve como uma fonte de energia nas reações de oxi-redução da respiração
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Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos (água, sais e gases) 
H2, H2O
Oxigênio
Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos, glicerídeos)
O2
H2O
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É obtido a partir das proteínas e gorduras.
Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os processos de geração de energia.	
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Fósforo (P)
Enxofre (S)
Potássio (K)
Sínese de ácidos nucléicos e fosfolipídeos, ATP
Estabilidade de aminoácidos (cisteína e metionina), componente de vitaminas (biotina, tiamina)
Atividade de enzimas
Fosfato (PO42-)
Sulfato (SO42-) 
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Magnésio (Mg)
Cálcio (Ca)
Sódio (Na)
Estabilidade dos ribossomos, membranas e ácidos nucléicos.
Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos
Requerido por microrganismos marinhos
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Resumo MACROnutrientes
Micronutrientes
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Geralmente não é preciso adicionar: presentes na água; 
se água desmineralizada: adicionar solução elementos traços.
Nem todos os nutrientes listados são requeridos por todas as células
	Elemento	Função Celular
	Cobalto	Vitamina B12; transcarboxilase (bactérias que metabolizam ácido propiônico)
	Cobre	Respiração; citocromo c oxidase; fotossíntese; plastocianina e algumas superóxido dismutases.
	Manganês	Ativador de muitas enzimas; presente em certa superóxido dismutases e na enzima que cliva a água em fototróficos oxigênicos (Fotossistema II)
	Molibidênio	Certas enzimas contendo flavina; nitrogenase, nitrato redutase
	Niquel	Maioria das hidrogenases; Coenzima F430 de metanogênicos, monóxido de carbono desidrogenase; urease
	Selênio	Formato desidrogenase; algumas hidrogenases; no aminoácido selenocisteína
	Tungstênio	Algumas formato desidrogenases; oxotransferases de hipertermófilo
	Zinco	Vanádio nitrogenase; bromoperoxidase
	Ferro	Citrocromos; catalases; peroxidases; proteínas contendo ferro e enxofre; todas as nitrogenases
Micronutrientes
Exercem função estrutural em várias enzimas
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Fatores de Crescimento
São micronutrientes orgânicos que alguns microrganismos necessitam em pequenas quantidades.
Vitaminas, aminoácidos, purinas e pirimidinas.
A maioria dos microrganismos conseguem sintetizá-los
Porém, alguns requerem um ou mais desses fatores, pré-formados no meio 
Vitaminas – Mais comumente requerido
Atuam como coenzimas
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Streptococcus, Lactobacillus e Leuconostoc – várias necessidades vitamínicas
Fatores de crescimento e suas Funções
Água e outros aditivos
Água
Componente absolutamente indispensável 
Laboratório: destilada, filtrada, deionizada
Outros aditivos
Funções: aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma, provocar inibição,estabilizar o pH. 
Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos
Ex.: EDTA, ácido cítrico, polifosfatos
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Classificação Nutricional dos Microrganismos
	Fonte de Carbono	Grupo nutricional
	CO2	Autotróficos
	Compostos Orgânicos	Heterotróficos
	Fonte de Energia	Grupo nutricional
	Compostos orgânicos/ inorgânicos	Quimiotróficos
	Luz	Fototróficos
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	Fonte de Carbono	Grupo nutricional
	CO2	Autotróficos
	Compostos Orgânicos	Heterotróficos
	Fonte de Energia	Grupo nutricional
	Compostos orgânicos/ inorgânicos	Quimiotróficos
	Luz	Fototróficos
	Fonte de Energia	Fonte de Carbono
	C. orgânicos/ inorgânicos	CO2
	C. orgânicos/ inorgânicos	Compostos Orgânicos
	Luz	CO2
	Luz	Compostos Orgânicos
	Grupo nutricional
	Quimioautotróficos
	Fotoautotróficos
	Quimioheterotróficos
	Fotoheterotróficos
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Fatores que afetam o crescimento microbiano
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 Oxigênio
 Temperatura
 pH
 Pressão osmótica
Oxigênio
(A) Aeróbios estritos ou obrigatórios
(B) Anaeróbios estritos ou obrigatórios
(C) Anaeróbios facultativos 
(D) Microaerófilos
(E) Anaeróbios aerotolerantes
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Estamos acostumados a pensar no oxigênio molecular (O2) como elemento necessário à vida, mas em algumas circunstâncias esse elemento pode se tornar um gás venenoso. Houve pouco oxigênio molecular na atmosfera durante a maior parte da história da Terra – na verdade, é possível que a vida não tivesse surgido se houvesse oxigênio. Contudo, muitas formas comuns de vida têm sistemas metabólicos que requerem oxigênio para a respiração aeróbia. Os átomos de hidrogênio que foram removidos dos compostos orgânicos se combinam com o oxigênio para formar água, como mostrado na Figura 5.14 (p. 125). Esse processo fornece uma grande quantidade de energia e ao mesmo tempo neutraliza um gás potencialmente tóxico – uma solução realmente genial.
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Mas por que o oxigênio é tóxico?
Por que os microrganismos anaeróbios são inibidos em seu crescimento ou mesmo mortos pelo oxigênio?
Oxigênio molecular (O2) não é tóxico, mas O2 pode ser convertido em subprodutos tóxicos de oxigênio, e são eles que podem danificar ou matar as células que não são capazes de lidar com eles. Estes incluem o ânion superóxido (O2–), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxila (OH).
Todos são subprodutos da redução de O2 a H2O na respiração.
 Flavoproteínas, quinonas e proteínas de ferro-enxofre, transportadores de elétrons encontrados em praticamente todas as células, também catalisam algumas dessas reduções. 
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Independentemente de se ele pode respirar O2, um organismo exposto ao O2 vai experimentar formas tóxicas de oxigênio, e se não forem destruídas, essas moléculas podem causar danos nas células.
Mas por que o oxigênio é tóxico?
Redução de quatro elétrons de O2 a H2O2 pela adição sequencial de elétrons. Todos os intermediários formados são reativos e tóxicos às células; exceto água.
Mecanismos de desintoxicação
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Enzimas que destroem espécies tóxicas de oxigênio.
Catalases
Peroxidases são proteínas contendo porfirina.
Superóxido dismutases são proteínas contendo metal, como, cobre e zinco, manganês ou ferro.
Reação combinada de superóxido dismutase e catalase.
Superóxido redutase catalisa a redução de um elétron de O2- a H2O2.
Alguns procariotos anaeróbios obrigatórios não possuem superóxido dismutase, havendo uma enzima exclusiva a superóxido redutase, que remove o superóxido sem a produção de O2
Temperatura
A maioria dos microrganismos cresce bem nas temperaturas ideais para os seres humanos. 
Contudo, certas bactérias são capazes de crescer em extremos de temperatura que certamente impediriam a sobrevivência de quase todos os organismos eucarióticos.
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Classificação dos microrganismos quanto à temperatura de crescimento
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Temperaturas de preservação de alimentos
As baixas temperaturas reduzem as velocidades de reprodução microbiana, sendo esse o princípio básico da refrigeração. Mas sempre existem exceções.
Extremófilos
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Vida microbiana em BAIXAS temperaturas
Os oceanos apresentam temperatura média de 5°C, ao passo que as profundidades dos oceanos abertos apresentam temperaturas constantes, de cerca de 1 a 3°C.
Vastas áreas terrestres do Ártico e da Antártida
Geleiras
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Habitats microbianos e microrganismos da Antártida
Um bloco de água do mar congelada, na Antártida. 
Microrganismos são diatomáceas ou algas verde (ambos eucariotos fototróficos).
Polaromonas, uma bactéria contendo vesículas de gás, que vive no gelo oceânico, com temperatura ótima de 4 °C.
Lago Bonney, Antártida, contém arranjo diverso de procariotos e eucariotos microbianos
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Coloque seu suéter!!
Faz frio e não somos psicrófilas!!!
Os psicrófilos são encontrados em ambientes constantemente frios, podendo ser rapidamente mortos pelo aquecimento, mesmo que somente até 20°C. 
	Temperatura	Ótima	Máxima	Mínima
	Psicrófilo	15 °C	Abaixo de 20°C	0°C ou inferior
	Psicrotolerantes 	20-40°C		0°C
Uma espécie da bactéria de mares gelados, Psychromonas, cresce a –12°C, a temperatura mais baixa para qualquer bactéria conhecida!!
Psicrófilos
Embora os psicrotolerantes cresçam a 0°C, a maioria não cresce bem, e muitas vezes é preciso esperar várias semanas antes que o crescimento visível seja observado em culturas de laboratório.
Bactérias, arqueias e eucariotos microbianos. 
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Os psicrotolerantes apresentam distribuição muito mais ampla na natureza, podendo ser isolados de solos e águas de climas temperados, assim como de carnes, leite e outros laticínios, cidras, vegetais e frutas, armazenados em temperaturas de refrigeração (4°C).
Psicrotolerantes
Adaptações à baixas temperaturas
ENZIMAS
Enzimas que atuam no frio, podendo ser desnaturadas ou inativadas de outra forma em temperaturas bastante moderadas. 
Apresentam alto conteúdo de α-hélices e um baixo conteúdo de folhas β-pregueadas em suas estruturas secundárias .
α-hélices são menos rígidas o que confere a essas proteínas grande flexibilidade para suas reações catalisadoras em temperaturas frias. 
Maior número de aminoácidos polares.
Menor quantidade de aminoácidos hidrofóbicos.
Menores números de ligações fracas, como ligações iônicas e de hidrogênio, quando comparadas a suas equivalentes de mesófilos.
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Membranas citoplasmáticas 
contem um teor mais elevado de ácidos graxos de cadeia mais curta e insaturados, e isso ajuda na manutenção de um estado semifluido da membrana.
Proteínas
Proteínas “cold-chock” - Manutenção de outras proteínas em uma forma ativa sob condições de frio ou a ligação a RNAm específicos, facilitando a sua tradução. 
Crioprotetores - Proteínas anticongelantes ou solutos específicos, como glicerol ou certos açúcares que são produzidos em grandes quantidades a temperaturas frias; esses agentes ajudam a evitar a formação de cristais de gelo que podem perfurar a membrana citoplasmática. 
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Adaptações à baixas temperaturas
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Vida microbiana em ALTAS temperaturas
Uffa!! 
Quanto calor está fazendo!!!
Bah! Estas mesofílicas não aguentam nada.
Sim, hahaha!
Voltamos ao nosso gêiser, pois já estou com frio!
Solos aquecidos pelo sol (temperaturas acima de 50°C);
Piscinas de água a fontes termais ferventes;
Materiais em fermentação, como pilhas de esterco e silagem, também podem atingir temperaturas de 70°C;
Fontes termais e hidrotermais (fundo oceânico) - 350 °C;
Aquecedores de água domésticos e industriais.
Termófilos
Mais termofílico conhecido até agora, a arqueia produtora de metano Methanopyrus, capaz de um crescer até 122°C.
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Temperatura ótima de crescimento é superior a 45°C 
Hipertermófilos
Temperatura ótima é superior a 80°C 
Adaptações à altas temperaturas
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Proteínas e enzimas - maior termoestabilidade.
Maior número de ligações iônicas entre aminoácidos básicos e ácidos.
Di-inositol fosfato, diglicerol fosfato e manosilglicerato.
Taq polimerase – Thermus aquaticus.
Membranas citoplasmáticas: maior conteúdo de ácidos graxos saturados (fortemente hidrofóbico ) de cadeia longa (pontode fusão mais alto). Monocamada lipídica.
Ácidos nucléicos por exemplo com maior concentração de bases C≡G
pH
pH = Acidez ou alcalinidade de uma solução.
A maioria dos microrganismos cresce melhor perto da neutralidade (5,5-7,5). 
Poucas bactérias são capazes de crescer em pH ácido (como pH 4,0). 
Bactérias: faixa entre pH 7,0. 
Exceções: Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com ótimo entre 2 e 3,5), Bactérias alcalifílicas: (Bacillus e Archaea) (pH 10 – 11).
Fungos tendem a ser mais acidófilos que as bactérias (pH <5).
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Efeito do pH no crescimento microbiano
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Relações dos microrganismos e pH
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Picrophilus shimae (Archaea)
Disponibilidade de água
Atividade de água (aw): quantidade de água livre, disponível para o uso por parte dos microrganismos. 
Pode variar de 0 a 1. 
Microrganismos marinhos tem necessidades especificas de íon sódio sendo denominados halófilos. 
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Os microrganismos obtêm a maioria dos seus nutrientes em solução da água presente no seu meio ambiente. Portanto, eles requerem água para seu crescimento, sendo que sua composição é de 80 a 90% de água. A disponibilidade de água não depende somente de se o ambiente é úmido ou seco, mas também da concentração de solutos (sais, açúcares ou outras substâncias) dissolvidos na água presente. Os solutos se ligam à água, tornando-a menos disponível aos organismos. Assim, para que os organismos contornem os ambientes com altas concentrações de solutos, ajustes fisiológicos são necessários.
Pressões osmóticas elevadas têm como efeito remover a água necessária para a célula. 
A disponibilidade de água é expressa em termos de atividade de água (aw), a razão entre a pressão de vapor do ar em equilíbrio com uma substância ou solução, em relação à pressão de vapor da água pura. Valores de aw podem variar entre 0 a 1
A água difunde-se a partir de regiões de alta concentração aquosa (baixa concentração de solutos) para regiões de menor concentração aquosa (maior concentração de soluto), OSMOSE.
Pressão osmótica
Se concentrações bem mais altas são utilizadas, a pressão osmótica aumentada pode inibir o crescimento.
Hipertônico
Hipotônico
Alguns microrganismos que têm uma parede celular relativamente frágil podem ser lisados com esse tratamento.
A membrana plasmática se afasta da parede celular.
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Quando uma célula microbiana está em uma solução cuja concentração de solutos é mais elevada que dentro da célula (ambiente hipertônico), a água atravessa a membrana celular para o meio com a concentração mais elevada de soluto. Essa perda osmótica de água causa plasmólise, ou o encolhimento do citoplasma da célula.
O crescimento da célula é inibido à medida que a membrana plasmática se afasta da parede celular. Portanto, a adição de sais (ou outros solutos) em uma solução e o aumento resultante na pressão osmótica podem ser utilizados para preservar alimentos. Peixe salgado, mel e leite condensado são preservados por esse mecanismo; as concentrações elevadas de sal ou açúcar removem a água de qualquer célula microbiana presente e, consequentemente, impedem seu crescimento. Esses efeitos da pressão osmótica estão aproximadamente relacionados ao número de moléculas dissolvidas e íons em um volume de solução. 
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Concentração de NaCl
Não halofílicos – 0 a 1,5% 
Halofílicos discreto -1 a 6% 
Halofílicos moderado -6 a 15%
Halofílicos extremos ou obrigatórios -15 a 30%
Halotolerantes – podem tolerar algum grau de solutos dissolvidos, mas crescem melhor na ausência do soluto adicionado.
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Alguns organismos, chamados de halófilos extremos, se adaptaram tão bem às altas concentrações de sais, que eles, de fato, necessitam dos sais para o seu crescimento. Nesse caso, eles podem ser chamados de halófilos obrigatórios
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Halofílicos
Água do mar contém cerca de 3% de NaCl.
Organismos do Mar Morto, requerem frequentemente cerca de 30% de sal.
O requisito de NaCl pelos halófilos é absoluto e não pode ser substituído por outros sais, como cloreto de potássio (KCl), cloreto de cálcio (CaCl2) ou cloreto de magnésio (MgCl2). 
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Ambientes ricos em açúcar
Osmofílicos
Ambientes extremamente secos
Xerofílicos
Solutos compatíveis
Quando um organismo é transferido a partir de um meio de alta aw para um de baixa aw, ele mantém o equilíbrio positivo de água por meio do aumento da concentração interna de solutos. 
Isso é possível pelo bombeamento de íons inorgânicos do ambiente ao interior da célula ou pela síntese de um soluto citoplasmático.
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Meios de cultura e cultivo em laboratório
Meios de cultura ou cultivo
Soluções nutrientes utilizadas para promover o crescimento de microrganismos em laboratório.
Fornece os nutrientes indispensáveis ao crescimento do microrganismo fora do seu habitat natural.
São preparados em laboratório com água destilada ou deionizada. 
Podem também ser adquiridos prontos para uso. 
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Meio de Cultura - Conceitos
Inóculo - microrganismos introduzidos em um meio de cultura para iniciar o crescimento.
Cultura - microrganismos que crescem e se multiplicam dentro ou sobre um meio de cultura.
Ágar - agente solidificante usado para o crescimento das bactérias em meio solido. É polissacarídeo complexo derivado de uma alga marinha.
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Meio líquido: nutrientes são dissolvidos em água e esterilizados. 
	
Usados em estudos de crescimento, cultivo em fermentação e na produção de biomassa
Consistência ou estado físico dos meios de cultivo
Meio sólido: são preparados a partir da adição de um agente solidificante, antes da esterilização do meio. 
	
Usados para contagem e isolamento de microrganismos (1,5% Agar)
Consistência ou estado físico dos meios de cultivo
Usados para a detecção de placas de lise em culturas bacterianas infectadas por vírus e microrganismos microaerofílicos ou móveis.
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Meio semi-sólido: são preparados pela adição de uma quantidade menor do agente solidificante (0,7% Agar). 	
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Meio Mínimo (MM): é sintético e fornece somente nutrientes essenciais ao desenvolvimento da célula. 
Meio Completo (MC): é sintético e fornece todos nutrientes para o desenvolvimento da célula.
Definidos: são preparados pela adição de quantidades precisas de compostos químicos inorgânicos ou orgânicos altamente purificados a uma determinada quantidade de água destilada.
	- A composição química exata é conhecida.
Indefinidos ou Complexos: A composição exata de cada nutriente não é conhecida. 
	
	-Ex: peptona, extrato de levedura, soja, carne, entre outros 
Meios de cultivo - Composição
Nos meios complexos geralmente emprega-se digestos de proteínas animais ou vegetais
Tais produtos de digestão encontram-se disponíveis comercialmente na forma de pós, podendo ser prontamente pesados e dissolvidos em água destilada
Meios quimicamente definidos
- Possuem quantidade definidas compostos orgânicos e inorgânicos.
Para seu uso, necessidade conhecimento necessidades nutricionais Microrganismos
 Vantagem: Retirando / adicionando constituinte – saber se é essencial para crescimento microrganismo estudado.
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Meio quimicamente definido
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Meio complexo
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Extrato de Carne: extrato aquoso de tecido muscular, concentrado sob a forma de pasta, contém carboidratos, N orgânico, vitaminas hidrossolúveis e sais.
Peptona: produto da digestão da carne (enzimática ou ácida), fonte de nitrogenio orgânico e vitaminas.
Triptona: hidrolisado pancreático de carne , rica em nitrogênio-amínico; destinado ao isolamento de organismos de difícil crescimento.
Extrato de Levedura: extrato aquoso de células de leveduras lisadas, fonte excelente de substâncias estimulantes do crescimento como vitamina complexo B; contém compostos orgânicos de N e C.
Extrato de malte: extrato aquoso de cevada malteada. Rica em carboidratos, contém material nitrogenado, vitaminas e sais minerais.
Tripticase: peptona derivada da caseína por digestão pancreática,fonte rica em nitrogênio de aminoácidos
Substratos para meios complexos
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Meios formulados para objetivos específicos, utilizados principalmentenos trabalhos de identificação de microrganismos. 
Enriquecimento: Favorece o crescimento de determinada população. Multiplicação dos microrganismos de interesse quando estes estão em pequeno número. 
	Ex: Meio contendo celulose como fonte de carbono ou meio com fenol para microrganismos que degradam essa fonte. 
Meios especiais
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Meios Especiais
Diferencial: contém substâncias químicas mais complexas e permite diferenciar os microrganismos quanto ao seu crescimento e morfologia. 
BEM: Colônia de E. coli verde escuro e Salmonela incolor. 
Meio agar-sangue: identificação de bactérias patogênicas produtoras de hemolisinas. Streptococcus e Staphylococcus (anel claro em torno da colônia). 
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Meios Especiais
Seletivo: Favorece um microrganismo e inibe o crescimento de outros.
Adição de um antibiótico específico
pH específico para determinados microrganismo 
Ágar Sabouraud: pH 5,6 e alta concentração de glicose (seletivo para fungos).
Ágar verde brilhante: seletivo para enterobactérias Gram - (Salmonella) o corante verde brilhante adicionado ao meio inibe as bactérias Gram (+).
Ágar MacConkey 
Contém sais biliares e corante cristal violeta, que inibem o crescimento de Gram + e permitem o desenvolvimento de Gram -.
Lactose (diferenciar bactérias que utilizem este carboidrato). 
Colônias bacterianas que fermentam lactose tornam o meio rosa choque.
Colônias bacterianas que NÃO fermentam lactose tornam o meio amarelo claro.
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Meios Especiais
Seletivo/diferencial: diagnóstico de patogênicos (coliformes fecais). 
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RESUMÃO
Cultivo em anaerobiose
Jarra de anaerobiose
Câmara de anaerobiose
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Cultivo de Microrganismos
Isolamento dos Microrganismos
Para se caracterizar um microrganismo ele deve estar em cultura pura, ou seja, ele precisa ser isolado dos demais microrganismos do meio onde se encontra
Cultura pura: quando uma colônia ou cultura é originada de uma única célula.
Cultura mista: se a colônia ou cultura é originada de mais de uma célula.
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Obtenção de culturas puras 
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Obtenção de culturas puras 
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Obtenção de culturas puras 
Preservação de culturas
Ultracongelamento: processo no qual uma cultura pura de microrganismos é colocada em um líquido em suspensão e submetida a um rápido congelamento em temperaturas variando entre - 50 a - 95°C e liofilização
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Liofilização (criodessecação): uma suspensão de micróbios é rapidamente congelada em temperaturas variando entre - 54 a - 72°C, e a água é removida por um alto vácuo (sublimação). Ainda sob vácuo, o recipiente é selado, derretendo o vidro com uma chama de alta temperatura.
Crescimento Microbiano
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Divisão bacteriana
O crescimento é o resultado da divisão celular. 
Refere-se ao aumento do número de bactérias, e não a um aumento no tamanho das células individuais.
Uma espécie é mantida apenas como resultado do crescimento contínuo de sua população.
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Formas de multiplicação
Fissão binária:
As células alongam-se até aproximadamente duas vezes o seu tamanho original e, então, formam uma partição que divide a célula em duas células-filhas 
Ex: Escherichia coli
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Brotamento:
Formam uma pequena região inicial de crescimento (o broto), que vai se alargando até atingir um tamanho similar ao da célula parental, e, então, separa-se dela.
 Ex: Rhodopseudomonas
Exosporulação: 
Bactérias filamentosas (determinados actinomicetos) se reproduzem pela produção de cadeias de conidiósporos (um esporo assexuado) carreados externamente na ponta dos filamentos.
Ex: Streptomyces
Fragmentação de filamentos:
Os fragmentos iniciam o crescimento de novas células.
Ex: Nocardia
Fissão binária
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Esse processo é chamado de fissão binária (“binário” expressa o fato de duas células originarem-se a partir de uma). Essa partição é chamada de septo e resulta de uma invaginação da membrana citoplasmática e da parede celular de direções opostas; a formação do septo continua até a individualização das duas células-filhas. Há algumas variações no padrão geral da fissão binária.
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Multiplicação celular
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Tempo requerido para esse processo é chamado de tempo de geração.
Durante uma geração, todos os constituintes celulares aumentam proporcionalmente e as células estão em um crescimento balanceado. 
Cada célula-filha recebe um cromossomo e cópias suficientes de ribossomos e todos os outras macromoléculas para existir como uma célula independente. 
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Tempo de geração: é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique e sua população dobrar. 
É variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10, 20 minutos até dias. 
O tempo de geração não corresponde a um parâmetro absoluto, uma vez que é dependente de fatores genéticos e nutricionais, indicando o estado fisiológico da cultura. 
Taxa de crescimento (velocidade específica de crescimento): é a variação no número ou massa de microrganismos por unidade de tempo.
Cinética do crescimento microbiano
Representação logarítmica das populações bacterianas
É difícil representar graficamente variações de populações tão grandes utilizando números aritméticos. Por esse motivo, as escalas logarítmicas, em geral, são utilizadas para representar graficamente o crescimento bacteriano
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Curva de crescimento para uma população crescendo exponencialmente, representada logarítmica (linha pontilhada) e aritmeticamente (linha cheia).
83
Representação logarítmica das populações bacterianas
84
Cinética do crescimento microbiano
1 - 2 – 4 - 8 ... 2n
 n = número de gerações
N = número final de células
No = número inicial de células
O aumento no número de células de uma cultura bacteriana em crescimento exponencial pode ser expresso com matemática simples baseada em uma progressão geométrica de quociente 2. 
84
85
Cinética do crescimento microbiano
85
g = t
 n
Tempo de geração (g)
Taxa de crescimento exponencial
R = n
 t
t = duração do crescimento exponencial (dias, horas ou min);
n = número de gerações;
R = Taxa de crescimento exponencial (gerações/h).
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Cinética do crescimento microbiano
O tempo de geração (g) da população em crescimento exponencial corresponde a t/n, em que t refere-se à duração do crescimento exponencial, sendo expresso em dias, horas ou minutos. A partir do conhecimento dos números inicial e final de células em uma população em crescimento exponencial, é possível calcular n e, a partir de n e do conhecimento de t, o tempo de geração, g.
86
Nº de gerações de uma Cultura
Nº de gerações = nº log de cél. final – nº log de cél. inicial
 Log 2
Nº de gerações = nº log de cél. final – nº de log cél. inicial
 0, 301
Tempo de gerações de uma população
Tempo de gerações = 60 min x horas
 número de gerações
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Exemplo
Calcule o tempo de geração se 100 células crescendo por 5 horas produzissem 1.720.320 células
Nº de gerações = 1.720.320 – 100 = 14 gerações
 0, 301
Tempo de gerações = 60 min x 5 horas = 21 min./gerações
 14
88
89
Curva de crescimento
Quando algumas bactérias são inoculadas em um meio líquido de crescimento e a população é contada em intervalos regulares, é possível representar graficamente a curva de crescimento bacteriano, que mostra o crescimento das células em função do tempo
A fase lag
Durante certo tempo, o número de células muda pouco, pois elas não se reproduzem imediatamente em um novo meio. Esse período de pouca ou nenhuma divisão é chamado de fase lag, podendo durar de uma hora a vários dias. Durante esse tempo, contudo, as células não estão dormentes. A população microbiana passa por um período de intensa atividade metabólica, envolvendo principalmente a síntese de enzimas e várias moléculas. (A situação é análoga a uma fábrica sendo equipada para produzir automóveis, ou seja, há atividade de preparação, mas não há produção imediata de automóvel.)
A fase log
Por fim, as células começam a se dividir e entram em um períodode crescimento, ou aumento logarítmico, chamado de fase log, ou fase de crescimento exponencial. A reprodução celular é mais ativa durante esse período, e o tempo de geração (intervalo durante o qual a população dobra) atinge um mínimo constante. Como o tempo de geração é constante, uma representação logarítmica do crescimento durante a fase log gera uma linha reta. A fase log é o momento de maior atividade metabólica, sendo o preferido para fins industriais, pois o produto precisa ser produzido de maneira eficiente.
A fase estacionária
Se a fase de crescimento continua sem controle, ocorre a formação de um grande número de células. a velocidade de reprodução diminui, o número de mortes microbianas é equivalente ao número de células novas, e a população se estabiliza. Esse período de equilíbrio é chamado de fase estacionária. A causa da interrupção do crescimento exponencial não é sempre clara. O esgotamento dos nutrientes, o acúmulo de resíduos e mudanças no pH danosas à célula podem ser os motivos. 
A fase de morte celular
O número de mortes eventualmente excede o número de novas células, e a população entra em uma fase de morte, ou fase de declínio logarítmico. Essa fase continua até que a população tenha diminuído para uma pequena fração do número de células da fase anterior ou até que a população morra totalmente. Algumas espécies passam por toda a sequência de fases em somente poucos dias; outras mantêm algumas células sobreviventes indefinidamente. 
89
Curva de crescimento
90
91
Cultura contínua- Quimiostato
A densidade da população é controlada pela concentração de nutriente limitante no reservatório, enquanto a taxa de crescimento é controlada pela taxa de fluxo. Esses dois parâmetros podem ser ajustados pelo operador.
Mensurando Crescimento microbiano
1. N° CÉLULAS
2. MASSA
1.1 TOTAIS
1.2 VIÁVEIS
 2.1 DIRETA
2. 2 INDIRETA
LÂMINA
ELETRÔNICA
PLAQUEAMENTO
(diluições)
FILTRO
(concentrar)
MASSA SECA
DENSIDADE ÓTICA 
ATIVIDADE METABÓLICA 
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MEDIDAS
DE
CRESCIMENTO
Número de células 
PLAQUEAMENTO
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Contagem de colônias em placas diluição seriada de fungos filamentosos
UFC/mL= nº colônias x fator diluição / aliquota plaqueada
UFC=Unidades Formadoras de Colônias
95
Número de células 
PLAQUEAMENTO
96
Número de células 
PLAQUEAMENTO
97
Número de células 
PLAQUEAMENTO
98
Número de células 
PLAQUEAMENTO
99
Número de células 
FILTRAÇÃO
100
Número de células 
CONTAGEM MICROSCÓPICA
Contagem utilizando a câmara de Petroff-Hausser
101
Número de células 
CONTAGEM MICROSCÓPICA
Contagem direta de bactérias em câmara de Petroff-Hausser
Técnica estatística.
Usada quando os micro-organismos não crescem em um meio solido (como as bactérias quimioautotróficas nitrificantes). 
Também quando o crescimento de bactérias em um meio líquido diferencial é utilizado para identificar micro-organismos (como bactérias coliformes em água, que fermentam seletivamente lactose produzindo ácido. 
102
Medidas indiretas
NÚMERO MAIS PROVÁVEL
Tabela do NMP
103
Medidas indiretas
NÚMERO MAIS PROVÁVEL
Permite calcular para uma amostra os números microbianos que estatisticamente são os mais prováveis de terem levado aos resultados obtidos.
104
Medidas indiretas
TURBIDIMETRIA
A quantidade de luz que chega ao detector é inversamente proporcional ao número de bactérias sob condições padronizadas. 
Quanto menos luz é transmitida, mais bactérias estão presentes na amostra.
Podem ser usadas em representação gráfica.
105
Medidas indiretas
TURBIDIMETRIA
Peso seco
Uma das melhores maneiras de medir o crescimento de organismos filamentosos é pelo peso seco. Neste procedimento, os fungos são removidos do meio de crescimento, filtrados para a remoção de outros materiais e secos em um dessecador, sendo, então, pesados. Para bactérias, o mesmo procedimento básico é seguido.
106
Medidas indiretas
Atividade metabólica
Esse método assume que a quantidade de um produto metabólico determinado, como um ácido ou CO2, é diretamente proporcional ao número de bactérias presentes. 
Onde estudar?
Próxima aula: Controle do crescimento microbiano