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qPCR ou RTQ-PCR
qPCR ou RTQ-PCR
A PCR em tempo real
 PCR quantitativa ou
 PCR em tempo real quantitativa 
simplesmente qPCR ou RTQ-PCR
A PCR em tempo real, também conhecida como PCR quantitativa ou PCR em
tempo real quantitativa ou simplesmente qPCR ou RTQ-PCR
Este mecanismo permite detectar o aumento da fluorescência durante a reação, devido à ligação do brometo de etídio às moléculas de DNA de dupla cadeia recém-sintetizadas
Neste método, as fases de amplificação, detecção e quantificação são totalmente automatizadas, ocorrendo em simultâneo e em tempo real (Heid et al., 1996).
composta por um termociclador, com sistema óptico para a excitação e recolha da emissão da fluorescência e um computador com software próprio para a aquisição de dados e análise final da reação.
qPCR ou RTQ-PCR
PCR em tempo real segue o princípio geral da PCR convencional. 
Três fases características da PCR: 
Crescimento exponencial, crescimento linear e estacionária
A primeira fase é bastante específica e precisa. 
Na fase de crescimento linear os produtos da reação são consumidos
 A fase estacionária corresponde ao final da análise
Os compostos fluorescentes adicionados ao DNA geram um sinal de fluorescência que é diretamente proporcional à quantidade de produto amplificado.
A interpretação dos resultados obtidos pelos equipamentos obriga a que se
definam conceitos específicos, como baseline, ponto CT e threshold. A baseline
corresponde ao limiar mínimo de detecção de fluorescência do instrumento sendo
considerado „ruído de fundo‟ do equipamento. O ponto CT, denominado na literatura como
cycle threshold, corresponde ao número de ciclos necessários para que a fluorescência da
reacção seja detectável.
Representação gráfica das fases da PCR em tempo real.
A eficiência da amplificação 
comprimento do amplificação
Existência de estruturas secundárias na amostra
Qualidade dos primers usados
Procedimentos laboratoriais incorretos
Presença ou utilização de inibidores da PCR (hemoglobina, ureia, heparina, glicogénio, gorduras, iões cálcio, etc.),
Presença ou utilização de promotores da PCR (glicerol, DMSO, BSA)
Tecnologias e métodos de detecção
A análise in vitro dos produtos da amplificação por PCR em tempo real é
concretizada através da utilização de compostos fluorescentes. 
Todos os protocolos requerem o uso de um termociclador de PCR em tempo real específico, bem como capilares de vidro onde se desenvolve a reação em cadeia da polimerase.
sistema óptico, uma fonte deiluminação ultra-violeta e um detector de fluorescência.
Os métodos químicos de fluorescência podem ser agrupados em dois grandes grupos.
Agrupados de acordo com o tipo do composto fluorescente e respectivo comportamento durante o processo.
Corantes intercalantes 
Sondas de sequência específica
Corantes intercalantes
Os corantes intercalantes são fluorocromos sem especificidade para uma sequência particular de DNA, que se intercalam na dupla cadeia de qualquer produto da PCR permitindo a sua detecção.
Probes®, Inc - 	SYBR® Green. 
Idaho Technology - 	LCGreen® Plus 
Biotium Inc -		 EvaGreen® 
SYBR® Green
A tecnologia SYBR® Green baseia-se num conjunto de moléculas com a capacidade de se ligar de forma covalente à dupla cadeia de DNA e quando excitadas emitem uma fluorescência verde que é medida e convertida numa quantidade de DNA. 
Vantagens; 
Não interferirem com a atividade da maioria das nucleases e das DNA polimerases.
SYBR®Green livres não estão ligadas ao DNA de dupla cadeia e como tal, o sinal produzido é mínimo.
vantagens a grande sensibilidade, o reduzido custo e a facilidade de manuseamento. 
Corantes intercalantes
Desvantagens
Possibilidade de ligação a todo o DNA em cadeia dupla, durante a reação de polimerização, incluindo os dímeros de iniciadores e outros Subestimação da concentração do fragmento alvo.
LCGreen® Plus
O corante LCGreen® Plus exibe uma elevada sensibilidade para produtos da PCR com temperaturas de melting reduzidas. 
Promove um aumento da temperatura de fusão do DNA, cerca de 1-3ºC. 
Beneficia da capacidade de detecção de heteroduplexes formados durante a PCR. 
Otimizado para detecção de variantes da sequência de DNA (SNP´s, inserções/deleções)
Corantes intercalantes
EvaGreen®
Vantagens; 
Destacam-se a intensidade da fluorescência resultante da ligação do EvaGreen® ao DNA que é várias vezes superior ao de SYBR® Green 
Menor inibição para o processo de PCR e a extrema robustez e estabilidade, tanto termicamente como hidroliticamente, sob condições alcalinas ou ácidas
Corantes intercalantes
Sondas de sequência específica
As sondas, lineares ou em alça, são oligonucleótidos que requerem um fluorocromo, que é adicionado a uma sonda com especificidade para uma dada sequência DNA.
Fluorescence resonance energy transfer (FRET). 
	(FRET)- Interação molecular entre dois fluorocromos 	(molécula repórter e molécula quencher) 
Nucleotídeos específicos do produto da PCR
Representação de um oligonucleótido com estrutura terciária tipo hairpin-loop
utilizado como molecular beacons (
Tipos de molecular beacons
	Primers “Scorpion‟ 
	Primers “Sunrise‟
	Sondas 	TaqMan®
Os primers „Scorpion‟ não requerem a extensão da cadeia complementar, é apenas quebrada durante a hibridização específica. 
o primer „Scorpion‟ é extendido no DNA alvo, seguindo-se a sua desnaturação e respectiva dissociação.
Durante a reação da PCR, a sonda „Scorpion‟, na presença da sequência alvo, provoca a separação do fluoróforo e do quencher
Já os primers „Sunrise‟ requerem a duplicação da cadeia oposta para
que a estrutura hairpin possa ser desfeita. Este fenómeno separa os marcadores eliminando
o quenching de uma maneira similar às sondas hairpin