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27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 1/49 Técnicas complementares na reprodução assistida Profª. Vanessa Nayane Pino Perez Descrição Técnicas complementares da reprodução humana assistida. Técnicas e indicações de criopreservação da fertilidade. Tipos de diagnósticos pré-implantacionais e suas indicações. Propósito É importante compreender que, na reprodução assistida, existem técnicas complementares às técnicas convencionais. Com elas, é possível preservar os gametas, embriões, tecidos ovarianos e óvulos, detectar alguns problemas específicos que possam ser a causa da infertilidade e alcançar maior probabilidade de uma gravidez bem-sucedida. Objetivos 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 2/49 Módulo 1 Diagnóstico genético pré-implantacional Reconhecer os tipos de diagnóstico pré-implantacionais. Módulo 2 Criopreservação Descrever as técnicas de preservação da fertilidade. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 3/49 A fertilização in vitro (FIV) representa uma revolução no tratamento de casais com problemas de infertilidade. Durante a realização da FIV, é possível utilizar técnicas complementares que têm como objetivo superar problemas específicos que possam ser a causa da infertilidade. Essas técnicas surgiram como modo de aumentar as possibilidades de uma gravidez bem-sucedida e são procedimentos realizados de acordo com as necessidades particulares de cada paciente. Consistem em exames ou tratamentos que visam analisar, identificar e tratar problemas específicos que possam causar a infertilidade ou a transmissão de doenças, especialmente aquelas de origem genética. Assim, ao longo deste conteúdo vamos conhecer as principais técnicas complementares empregadas em reprodução assistida, são elas: o teste genético pré-implantacional (PGT) e a criopreservação de gametas e embriões. Orientação sobre unidade de medida Em nosso material, unidades de medida e números são escritos juntos (ex.: 25km) por questões de tecnologia e didáticas. No entanto, o Inmetro estabelece que deve existir um espaço entre o número e a unidade (ex.: 25 km). Logo, os relatórios técnicos e demais materiais escritos por você devem seguir o padrão internacional de separação dos números e das unidades. Introdução 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 4/49 1 - Diagnóstico genético pré-implantacional Ao �nal deste módulo, você será capaz de reconhecer os tipos de diagnósticos pré-implantacionais. Introdução ao diagnóstico genético pré- implantacional O diagnóstico genético pré-implantacional (preimplantation genetic testing, PGT) é um teste que foi inicialmente idealizado para detecção de mutações gênicas a fim de evitar a transmissão de doenças hereditárias aos filhos. O primeiro relato de sucesso com esta técnica ocorreu em 1990, com a detecção de uma doença de herança recessiva ligada ao cromossomo X, a adrenoleucodistrofia. Para isso, foi realizada biópsia embrionária em estágio de clivagem, a técnica de PCR (do inglês, polymerase chain reaction), verificada a sexagem embrionária e foram excluídos os embriões do sexo masculino, possivelmente portadores do X alterado e candidatos a ter a doença. Em 1992, o mesmo grupo reportou o uso do PGT de forma ainda mais específica – para evitar fibrose cística. Portanto, o PGT poderia evitar inúmeros casos de doenças geneticamente transmissíveis e 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 5/49 incuráveis. Além disso, eles viram que alterações estruturais, como as translocações robertsonianas e as translocações recíprocas, poderiam ser indicações para análise dos embriões. Cariótipo apresentando translocação robertsoniana. Translocações robertsonianas Forma comum de rearranjo cromossômico que pode ocorrer nos cinco pares de cromossomos acrocêntricos, ou seja, quando o centrômero está mais próximo das extremidades do que do centro, são eles os cromossomos 13, 14, 15, 21 e 22. Translocações recíprocas Quando existe uma troca de partes de informações entre cromossomos diferentes. A genotipagem do antígeno leucocitário humano (do inglês, Human Leukocyte Antigen) é outra aplicação do PGT que, além de auxiliar na detecção de embriões afetados, pode contribuir para o tratamento de irmãos que necessitam transplante de medula óssea compatível. A aplicação inicial do PGT evoluiu para uma visão mais ampla do embrião, o rastreamento das aneuploidias, principal causa do insucesso reprodutivo. Logo, a identificação dos embriões euploides compreende atualmente a imensa aplicação da biópsia embrionária como forma de melhorar a eficácia da fertilização in vitro. Diferentes tipos de testes genéticos pré- implantacionais No PGT, o conteúdo cromossômico total de uma ou poucas células é analisado com alta sensibilidade e especificidade. No entanto, as células são obtidas a partir de um método invasivo e é necessário um alto investimento para o laboratório com equipamentos especializados para a biópsia, como o laser. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 6/49 Além disso, esse procedimento deve ser conduzido por embriologistas altamente treinados para evitar viés dependente do operador nos resultados e para garantir o mínimo impacto na viabilidade do embrião. As denominações para os testes genéticos pré-implantacionais foram sofrendo alterações ao longo dos anos. De acordo com a classificação mais recente da Sociedade Internacional de Diagnóstico Genético Pré- implantacional (Preimplantation Genetic Diagnosis International Society - PGDIS), as siglas utilizadas nos diferentes testes genéticos pré-implantacionais são: PGT-A (Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidies) O PGT-A (teste pré-implantacional de aneuploidias) é o mais comumente solicitado nos tratamentos de FIV e tem como objetivo fazer um screening genético para identificar alterações quantitativas nos 23 pares de cromossomos, apontando monossomias que podem ser parciais ou totais, trissomias, nulissomias etc. Dentre as trissomias mais comuns e compatíveis com a vida estão: Síndrome de Down Trissomia do cromossomo 21. Síndrome de Edwards Trissomia do cromossomo 18. Síndrome de Patau Trissomia do cromossomo 13. Alterações quantitativas ligadas aos cromossomos sexuais também podem ser compatíveis com a vida, podendo aparecer na forma de trissomia (XXY - Síndrome de Klinefelter) ou monossomia (X0 - Síndrome de Turner). 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 7/49 Monossomia do cromossomo X. Trissomia do cromossomo sexual. As demais monossomias e trissomias diversas que são frequentemente encontradas nos laudos de PGT-A durante a rotina laboratorial são consideradas incompatíveis com a vida, seja por não permitirem o processo de implantação, seja por desencadearem uma implantação seguida de aborto precoce. Atenção! Apesar das causas da aneuploidia ainda não serem bem compreendidas, sabemos que o mecanismo cromossômico mais comum é a não disjunção meiótica pela falha da separação correta de um par de cromossomos durante uma das duas divisões meióticas – geralmente durante a meiose I. Os critérios de indicação para a realização do PGT-A, mais comumente empregados, são a idade materna avançada (>38anos), falhas repetidas de implantação, abortos recorrentes e fator masculino grave. Além disso, o uso do PGT auxilia no aumento de transferência de um único embrião, diminuindo o risco degestações múltiplas. PGT-M (Preimplantation Genetic Testing for Monogenic disorders) O PGT-M (teste pré-implantacional para identificação de doenças monogênicas) é o teste indicado para casais com alto risco pessoal ou familiar para doenças monogênicas. Para casais com risco aumentado de 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 8/49 gerarem filhos com doenças genéticas, o PGT-M pode ser realizado para selecionar embriões que não tenham a mutação. Acompanhe a seguir: Doenças monogênicas Doenças monogênicas são um grupo de doenças genéticas causadas por uma mutação ou alteração na sequência de DNA de um gene específico e transmitidas de forma hereditária. Como você deve ter percebido, o critério para indicação do PGT-M é o histórico familiar. Atualmente, o PGT- M é realizado para mais de 400 desordens gênicas, incluindo aquelas manifestadas desde o momento do nascimento, até as manifestações tardias, na vida adulta. PGT-HLA (Preimplantation Genetic Testing for Human Leukocyte Antigen) Neste caso, não se trata de evitar a transmissão de uma doença pré-existente ao futuro filho, como no PGT- M, ou evitar aneuploidias, como no PGT-A. O objetivo do PGT-HLA (teste pré-implantacional para a tipagem do HLA) é gerar uma gravidez a partir da seleção de um embrião com HLA compatível ao de uma criança afetada por um distúrbio genético que necessite de transplante de células-tronco hematopoiéticas (como nos casos de talassemia, leucemia etc.), para que tenha chance de cura ou expectativa de vida prolongada. Padronização para Doença Monogênica Em geral, é necessário fazer um estudo genético prévio da família, chamado de Padronização para Doença Monogênica. Detecção do histórico familiar O PGT-M, portanto, é a técnica indicada para evitar a transmissão de doenças hereditárias pré- existentes, como Fibrose Cística, Síndrome do X-Frágil, Distrofia Muscular, Doença de Huntington, Anemia Falciforme entre outras. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 9/49 Após a seleção por PGT-HLA e o nascimento desse bebê, as células tronco hematopoiéticas são coletadas do sangue do cordão umbilical ou da medula óssea do irmão doador compatível, ou de uma combinação de ambas as fontes, e utilizadas para transplante no irmão afetado. O PGT-HLA consiste na determinação indireta do HLA para identificar haplótipos compatíveis entre os embriões testados e a criança afetada. Haplótipos Haplótipo corresponde à combinação de um grupo de alelos de loci adjacentes, que fazem parte do mesmo cromossomo, geralmente herdados como uma unidade. Um haplótipo pode ser formado por um ou vários alelos, ou até pelo cromossomo inteiro. PGT-SR (Preimplantation Genetic Testing for Structural Chromosomal rearrangements) PGT-SR (teste pré-implantacional para a detecção de alterações cromossômicas) é o teste genético que identifica alterações cromossômicas envolvendo rearranjos estruturais nos embriões. Vamos entender melhor? Indivíduos com rearranjo estrutural balanceado Nos casos em que um dos parceiros é portador de um rearranjo estrutural balanceado, como uma translocação ou inversão, esse rearranjo resulta de uma quebra, recombinação ou troca cromossômica, seguida de reconstituição em uma combinação diferente da normalidade e geralmente não causa fenótipo no portador (um dos parceiros). 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 10/49 Embriões com possíveis rearranjos estruturais desbalanceados Porém, os embriões gerados por esse indivíduo podem apresentar rearranjos estruturais desbalanceados (ganho ou perda de um segmento cromossômico), que podem levar a falha de implantação, aborto espontâneo ou síndromes genéticas. Como exemplo, podemos citar as translocações robertsonianas como as mais comumente encontradas. Rearranjo estrutural balanceado Alterações estruturais sem a perda ou acréscimo do material genético. PGT-P (Preimplantation Genetic Testing for Polygenic disorders) O PGT-P (teste pré-implantacional para doenças poligênicas) é a técnica mais recente de todas e ainda pouco difundida. As doenças poligênicas são influenciadas por variantes genéticas em mais de um gene. A combinação das variantes nesses genes afeta a probabilidade de desenvolver condições poligênicas durante o curso da vida de um indivíduo. Durante a classificação dos embriões por esta técnica, cada embrião recebe uma pontuação chamada "Índice Genômico". Esse índice é calculado a partir da combinação de pontuações poligênicas de diferentes preditores de doenças e pode ser usado para comparar o risco geral de doença entre embriões e consequentemente auxiliar na decisão de qual embrião selecionar para fazer a transferência. Esse índice é utilizado para o cálculo do risco proporcional do desenvolvimento futuro da doença em comparação com o risco médio dessa mesma doença na população em geral. Diferentemente do que vemos no PGT-A, no qual os embriões são classificados como “normal” ou “alterado”, ou no PGT-M, em que recebemos o laudo de cada embrião como “portador” ou “afetado”, no PGT-P cada embrião recebe uma “razão de risco” de desenvolvimento futuro de cada uma das doenças disponíveis para teste. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 11/49 Saiba mais As doenças poligênicas avaliadas pelo PGT-P são: diabetes tipo 1 e tipo 2; câncer de mama, de testículo, de próstata; melanoma maligno; carcinoma basocelular; esquizofrenia; doença arterial coronariana; hipercolesterolemia; hipertensão; risco de ataque cardíaco. Por outro lado, o PGT-P é uma ferramenta de avaliação de risco e não um método de diagnóstico. Com o uso dessa metodologia, há risco de descartar embriões que poderiam ter um desfecho saudável em relação à doença poligênica testada. A maioria dessas doenças é influenciada também por fatores ambientais (estilo de vida, hábitos alimentares) e esses fatores não podem ser considerados na análise embrionária. NICS (Non-Invasive Preimplantation Aneuploidy Testing) NICS (teste genético pré-implantacional não invasivo para aneuploidias) é um método não invasivo de screening cromossômico baseado no sequenciamento do DNA genômico secretado no meio de cultura durante o desenvolvimento embrionário. Placa de cultivo embrionário individual. Recentemente, o NICS-PGT-A com a análise do cfDNA (DNA livre circulante) embrionário liberado para o meio de cultura foi proposto como uma alternativa para superar a biópsia embrionária para teste de aneuploidia. Para essa análise, é retirado o meio de cultura no qual o embrião se desenvolveu até o estágio de blastocisto e enviado para análise genética. No entanto, o NICS ainda apresenta certas limitações, entenda: Resultados falso negativos Estudos mostram resultados falso negativos, ou seja, quando a análise do DNA obtido a partir dos 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 12/49 meios de cultivo identificou alterações cromossômicas em embriões cromossomicamente normais. Possível contaminação Nesse caso, o erro foi atribuído pelos pesquisadores a uma possível contaminação por células foliculares maternas que rodeiam o óvulo, denominadas células da granulosa. Ainda é cedo para adotar o diagnóstico genético pré-implantacional não invasivo (NICS), pois outros estudos precisam ser realizados para garantir a efetividade da técnica que, quando estiver pronta para ser colocada em prática, representará um ponto de cisão entre o antes e o depois na medicina reprodutiva de precisão. Interpretação de resultados Antes de conhecermos as técnicas propriamente ditas, precisamos entender algumasdefinições e conceitos para compreender melhor o que estamos investigando e o que será encontrado no laudo do exame. Algumas dessas definições você já conhece, são elas: 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 13/49 Embrião euploide É um embrião geneticamente normal, com 46 cromossomos completos, incluindo 22 pares de autossomos e um par de cromossomos sexuais. Embrião aneuploide É um embrião geneticamente alterado. Ocorre quando há perdas ou ganhos de segmentos cromossômicos. Dessa forma, a falta de um cromossomo resultando em somente uma cópia de um cromossomo específico se caracteriza como monossomia; a presença de um cromossomo a mais, resultando em três cópias de determinado cromossomo, é caracterizada como trissomia. Mosaico O mosaicismo ocorre quando um embrião apresenta células euploides e aneuploides como resultado de erros na divisão celular (mitose) produzidos durante o desenvolvimento embrionário. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 14/49 Além desses conceitos precisamos conhecer outros, são eles: Quando o embrião apresenta genes da doença monogênica familiar estudada. Embrião que, após análise genética para doença monogênica, não apresenta a doença familiar estudada. O embrião não tem a informação cromossômica necessária para a análise, o que pode ser justificado por qualidade embrionária inadequada e/ou degradação do DNA obtido. Ainda durante a biópsia celular, tais células podem ser perdidas, o que pode contribuir para esse resultado. Quando o laudo aponta DNA não detectado ou inconclusivo, caso seja tomada a decisão de repetir a análise com uma rebiópsia, é preciso descongelar o embrião para refazer o procedimento de retirada das células e posterior recongelamento, para a espera do resultado da nova análise. Embrião afetado Embrião não afetado DNA não detectado ou inconclusivo Deleção/Duplicação Parcial 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 15/49 Indica que uma parte de um cromossomo está ausente ou adquirida. Deleções e duplicações diagnosticadas em um feto ou em nascidos vivos são geralmente associadas com anomalias físicas ou cognitivas. O relatório vai mostrar um “- / + p ou q” com a região do cromossomo que é deletada ou duplicada, respectivamente. Uma amostra embrionária será classificada como anormal complexa se houver uma combinação de cinco ou mais achados anormais, incluindo monossomia, trissomia e duplicação/deleção. Técnicas de biópsia embrionária Para realizar as técnicas de PGT, é recomendado que a paciente realize técnica de injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) e não a fertilização in vitro convencional a fim de evitar a contaminação de células remanescentes do cumulus ou células espermáticas residuais anexadas à zona pelúcida. Durante a formação do blastocisto, as células embrionárias se diferenciam nas linhagens de massa celular interna (MCI) e trofectoderma. Isso ocorre pela formação de uma cavidade (blastocele) preenchida com fluido, devido à bomba de sódio e potássio. Esquema representado o estágio de blastocisto. Para biópsia das células embrionárias, é necessário primeiramente fazer uma abertura da zona pelúcida (ZP). Para isso, podemos realizar três diferentes procedimentos, são eles: manipulação mecânica, perfuração química com ácido Tyrode ou perfuração a laser. A perfuração a laser é mais fácil, rápida, precisa e trata-se da metodologia mais utilizada mundialmente. Anormal Complexo 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 16/49 Existem diferentes tipos de técnicas para a retirada do material embrionário a ser analisado, vamos conhecê-las? Biópsia de blastômeros (embrião em estágio de clivagem) São removidos 1 ou 2 blastômeros (células) do embrião. Inicialmente, as biópsias embrionárias eram frequentemente realizadas no estágio de clivagem (embrião com 6 a 8 células). Essa técnica apresenta certa limitação, pois a quantidade de material genético analisado é pequena (menos representativa da totalidade do embrião) e é um estágio que, por ser inicial, pode apresentar maiores taxas de mosaicismo – é sabido que o embrião pode “corrigir" o mosaicismo ao longo do seu desenvolvimento, pela multiplicação de maior quantidade de células saudáveis que afetadas – podendo ocorrer em até 60% das análises. Biópsia de blastômero (retirada de célula no estágio de clivagem). Já no estágio de blastocisto, a incidência de mosaicismo cai drasticamente, pelo número de células analisadas ser maior e, portanto, uma amostra mais representativa do todo. Logo, a realização da biópsia na fase de clivagem pode indicar um alto índice de falso positivo para aneuploidia. A vantagem da biópsia nesse estágio de desenvolvimento (estágio de clivagem) é oferecer tempo suficiente para o resultado da análise ser liberado em 24 horas, possibilitando a transferência do embrião a fresco (embriões que são transferidos no mesmo ciclo de indução). Biópsia de trofectoderma (embrião em estágio de blastocisto) Essa técnica é a mais utilizada atualmente. É realizada uma abertura na ZP, no terceiro, quarto ou quinto dia de desenvolvimento embrionário. As células são aspiradas e excisadas com auxílio do laser para a quebra das ligações celulares, ou aspiradas e feita a dissecção mecânica das células biopsiadas. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 17/49 Excisão Remoção de parte de um órgão ou tecido com instrumento cortante – nesse procedimento o instrumento cortante que utilizamos é o laser. Devido à quantidade de células retiradas (de 6 a 8 células), esse método proporciona uma melhor precisão diagnóstica. O estágio de blastocisto demonstra ser menos sensível a possíveis danos durante a biópsia, pois as células que vão originar o feto (provenientes da massa celular interna) são deixadas intactas. A biopsia de trofectoderma apresenta uma maior acurácia e diminui a incidência de possíveis resultados errôneos para mosaicismo. No entanto, ela requer o cancelamento da transferência embrionária no mesmo ciclo, sendo necessária a criopreservação do embrião para transferência em ciclo posterior. Imagem ilustrativa da biópsia de trofectoderma (retirada de célula no estágio de blastocisto). Curiosidade O primeiro humano nascido vivo de uma transferência embrionária em estágio de blastocisto após biópsia de trofectoderma foi relatado em 2005. Biópsia de corpúsculo polar O primeiro corpúsculo polar é expelido nos oócitos maduros, enquanto o segundo corpúsculo polar é extruído após a fertilização. Eles não têm um papel aparente no desenvolvimento embrionário e não são parte integrante do embrião, mas ambos contêm material genético materno (o primeiro contém o conjunto de cromossomos duplicados resultante da primeira divisão meiótica e o segundo contém o conjunto de cromossomos simples resultante da segunda divisão meiótica). 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 18/49 Morfologia do primeiro corpúsculo polar. Morfologia do primeiro corpúsculo polar. A remoção de ambos os corpúsculos polares para fins de PGT é considerada menos invasiva do que as abordagens que envolvem a biópsia de células em estágios embrionários posteriores. Essa técnica envolve a remoção de ambos os corpúsculos polares com o intuito de obter uma melhor acurácia no diagnóstico do oócito. Essa análise pode ser usada para determinar aneuploidias relacionada a meiose materna, translocações cromossômicas balanceadas derivadas da mãe e para detecção dedoenças monogênicas do genoma materno, permitindo a transferência dos embriões a fresco. Os corpúsculos podem ser removidos juntos após a fertilização, para detecção de aneuploidias, ou separadamente para os casos de doenças monogênicas. Devido às informações desta técnica serem limitadas apenas ao material genético materno, ela não é amplamente utilizada, destinando-se mais para casos específicos. Saiba mais Estudos mostram que a biópsia de corpúsculo polar pode aumentar a taxa de fragmentação embrionária e a parada do desenvolvimento, sugerindo que mesmo essa manipulação aparentemente pouco invasiva pode impactar negativamente a viabilidade do embrião. Biópsia da blastocele A descoberta de DNA adequado para amplificação e teste genético na blastocele resultou em grande interesse sobre o potencial para uma nova era de testes genéticos pré-implantação minimamente invasivos. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 19/49 Para tal procedimento, uma micropipeta de ICSI perfura o trofectoderma no lado oposto da MCI e o fluido é cuidadosamente aspirado, deixando o embrião totalmente colapsado. Preparação do Tubing (tubo para armazenar as células para envio ao laboratório de genética). O colapso dinâmico e a re-expansão da cavidade é um fenômeno frequentemente observado durante o cultivo de blastocisto in vitro antes da eclosão. Embora a biópsia de blastocele seja um conceito atraente, esse tipo de procedimento não é comumente utilizado por apresentar dificuldades em obter uma amplificação consistente do DNA, o que consequentemente restringe a análise genética. A quantidade de DNA presente na blastocele varia consideravelmente e parece ser indetectável em alguns embriões (ou está presente em um estado que impossibilita a amplificação) e a principal causa da falha na detecção de DNA provavelmente deriva de sua natureza degradada. Técnicas de análise genética - plataformas de diagnóstico Inicialmente, a técnica de FISH (Hibridação in situ por fluorescência) foi utilizada para diagnóstico genético com blastômeros. O teste foi idealizado para detecção dos cromossomos 13, 18 e 21, mas expandiu para até 12 cromossomos. Para isso, uma ou duas células embrionárias (blastômeros) eram incubadas com sondas fluorescentes específicas e, em seguida, as alterações cromossômicas numéricas ou estruturais apenas em 12 cromossomos eram avaliadas. Porém, com o desenvolvimento de técnicas que permitem a análise de todos os 24 cromossomos (22 autossomos, X e Y), com amplificação do genoma completo em uma única célula, o CCS (do inglês, comprehensive chromossome screening), a técnica FISH praticamente caiu em desuso. Agora vamos conhecer as outras técnicas utilizadas para análise genética pré-implantacional. Você vai notar que essas técnicas são as mesmas empregadas na biologia molecular, no diagnóstico de doenças genéticas e em alguns diagnósticos laboratoriais: 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 20/49 Hibridização genômica comparativa (CGH) Essa foi a primeira técnica de CCS a ser disponibilizada em larga escala e envolve o isolamento e a marcação fluorescente de DNA obtido de biópsia de blastômero, comparando com o DNA do cariótipo de um indivíduo normal. O CGH convencional foi substituído pelo CGH-array (a-CGH), que envolve a hibridização do DNA a um microarranjo com cerca de 3 mil a 4 mil fragmentos do DNA humano. A limitação dessa técnica para PGT se dá pela pequena quantidade de DNA. Isso pode contribuir para uma taxa de erro de 2% a 5%. Essa metodologia tem sido aplicada desde 2010, e tem sensibilidade para detectar perda ou ganho em todos os cromossomos em um único procedimento. Polimor�smo de nucleotídeo único (SNP) O microarranjo de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP microarrays) detecta pares de nucleotídeos únicos do DNA genômico que são altamente variáveis dentro de uma espécie. O microarranjo geralmente avalia aproximadamente 300 mil SNPs ao longo do genoma de referência, sendo possível identificar aneuploidias de número de cromossomos. Algumas limitações do SNP incluem a não detecção das anomalias estruturais abaixo de 5Mb e de rearranjos cromossômicos balanceados. De forma geral, a técnica de SNP para PGT é considerada demorada, de alto custo e complexa. Reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) foi desenvolvida como um método para identificar aneupolidias nos 24 cromossomos. Neste método, ocorre uma etapa de pré-amplificação do DNA seguida de PCR multiplex na amostra. A vantagem do qPCR é o curto tempo para análise (cerca de 4 horas). A taxa de erro para esta técnica é de 0,21% por embrião euploide. A técnica é realizada no trofectoderma, mas não pode ser realizada com blastômero, além de só permitir a leitura simultânea de um reduzido número de amostras. Também não é capaz de detectar aneuploidias segmentais. Por outro lado, a técnica de PCR é amplamente utilizada para o diagnóstico de doença monogênica (PGT-M). 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 21/49 Sequenciamento de nova geração (NGS) O sequenciamento de nova geração (NGS) para PGT ultimamente é a técnica mais utilizada no mundo para o diagnóstico de aneuploidias (PGT-A). Ela inclui amplificação completa do DNA genômico, seguida de preparação de uma base de dados comparativa padrão com marcação e fragmentação do DNA antes do PCR. O NGS permite a identificação de aneuploidias de cromossomos inteiros, mosaicismo, número de cópias de mitocôndrias; pode ser utilizada para rastreamento de desordem de um único gene e para translocações. A taxa de erro da técnica varia entre 0,8% a 1,71%. A sensibilidade e a especificidade do NGS para detecção de aneuploidias cromossômicas são de 100% e 99,98%, respectivamente. Aneuploidias segmentais As aneuploidias segmentais (parciais) afetam apenas uma parte do cromossomo. Do ponto de vista biológico, essas alterações são geradas principalmente por erros na divisão celular meiótica, que ocorrem durante a gametogênese, bem como erros mitóticos que acontecem durante desenvolvimento embrionário. Ilustração de um cariótipo apresentando translocação balanceada. Comparado com o a-CGH, o NGS tem a vantagem de ser realizado com menores custos e o sequenciamento de várias amostras simultaneamente. Dentre as limitações da técnica encontram-se a impossibilidade de detecção de translocações balanceadas e a dificuldade de interpretação de aneuploidias segmentadas secundárias. Visão geral 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 22/49 As técnicas de avaliação do perfil genético dos embriões humanos obtidos via tratamentos de Reprodução Humana Assistida estão em constante e rápida evolução, com acurácia cada vez maior, o que, associado à alta proficiência do embriologista responsável pela biópsia, vitrificação e desvitrificação desses embriões, resulta em taxas crescentes de gestação associadas a menores taxas de abortamento. No entanto, devemos sempre levar em consideração que mesmo a melhora nas técnicas ainda não é suficiente para “compensar” a deficiência na amostra fornecida para análise. Nesse contexto, vamos analisar três fatores sobre a biópsia de trofectoderma (embrião em estágio de blastocisto), são eles: Vitri�cação Congelamento ultrarrápido no qual o material fica em estado vítreo. Desvitri�cação Descongelamento do material biológico que está em estado vítreo, restabelecendo o desenvolvimento celular. Biópsia de blastocisto X Biópsia de única célula Por mais que a biópsia de blastocisto forneça múltiplas células em comparação à biópsia de uma única célula (que ocorria no estágiode clivagem), essa amostra não é “homogênea” e, portanto, o conceito base das análises clínicas de que “a parte representa o todo” não é perfeitamente aplicável aqui. Células removidas para biópsia Na biópsia de blastocisto, as células removidas pertencem a uma pequena parte do trofectoderma que, por sua vez, é um agrupamento celular já diferenciado dentro do embrião e pode não obrigatoriamente representar o embrião como um todo e as células da massa celular interna, responsável pela formação do embrião propriamente dito. Prova disso são os conhecidos casos de mosaicismo. Capacidade de autocorreção S i h i t i d t b l id d d 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 23/49 Por esse conjunto de fatores, é fundamental e obrigatório um correto aconselhamento genético realizado por um geneticista, bem como um perfeito esclarecimento dos prós e contras da técnica, esclarecendo para o paciente as limitações que a envolvem. Considerando todos os pontos listados acima, a genética da reprodução, quando corretamente indicada e realizada, permite resultados fantásticos, evitando doenças e aumentando o sucesso dos tratamentos. Atenção! O diagnóstico genético para seleção de sexo é proibido no Brasil, mas pode ser indicado para casais que apresentem alguma doença ligada aos cromossomos sexuais X ou Y, como, por exemplo, o X-frágil (doença que gera uma deficiência mental e, embora aconteça em ambos os sexos, é mais grave nos homens). Passo a passo do tratamento de fertilização in vitro com biópsia embrionária. Epigenética Neste vídeo, a especialista Vanessa Amil define o que é epigenética e correlaciona epigenética e reprodução humana assistida. Soma-se a isso o pouco conhecimento que ainda temos sobre a real capacidade de autocorreção que esses embriões possam ter para corrigir essas aneuploidias observadas nesse estágio de desenvolvimento, e ainda o impacto negativo que a biópsia pode causar em blastocistos de prognóstico ruim. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 24/49 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 25/49 Falta pouco para atingir seus objetivos. Vamos praticar alguns conceitos? Questão 1 O diagnóstico genético pré-implantacional (PGT) é uma técnica complementar na Reprodução Assistida. Ele permite o estudo de alterações genéticas e cromossômicas no embrião antes de sua implantação no útero. Inicialmente, esse teste foi desenvolvido para detectar que tipo de alteração genética? Parabéns! A alternativa A está correta. Incialmente, a técnica de PGT foi implementada para avaliar as mutações gênicas que eram transmitidas hereditariamente. O primeiro relato de sucesso com o PGT foi para a detecção de uma doença de herança recessiva ligada ao cromossomo X, a adrenoleucodistrofia. A Para detecção de mutações gênicas. B Para detecção de desordens numéricas. C Para detecção de mutações poligênicas. D Para detecção de rearranjos estruturais desbalanceados. E Para seleção de um embrião com HLA compatível ao de uma criança afetada. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 26/49 Questão 2 Para a realização da análise genética pré-implantacional existem diferentes tipos de materiais que podem ser analisados. Qual o material que apresenta maior acurácia dos resultados e diminui a incidência de possíveis resultados errôneos para mosaicismo? Parabéns! A alternativa B está correta. A biópsia de trofectoderma (embrião em estágio de blastocisto) atualmente é a técnica mais utilizada. Nessa técnica, são retiradas de 6 a 8 células do embrião e enviadas para análise, proporcionando melhor precisão diagnóstica. A Blastômero. B Trofectoderma. C Corpúsculo polar. D Blastocele. E Células da granulosa. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 27/49 2 - Criopreservação Ao �nal deste módulo, você será capaz de descrever as técnicas de preservação da fertilidade. Criopreservação de oócitos e embriões A partir do primeiro relato de nascimento após fertilização in vitro (FIV) em 1978 e do rápido progresso nas técnicas de reprodução assistida, surgiu a necessidade de um programa de criopreservação eficaz. Inicialmente, devido às baixas taxas de sucesso, todos os embriões provenientes de ciclos de FIV eram transferidos. Entretanto, o enorme avanço nas técnicas laboratoriais levou não apenas ao aumento das taxas de gestação, mas também ao aumento de gestação múltipla. Uma maneira de diminuir o número de embriões a serem transferidos e a incidência de gestações múltiplas seria armazenar os embriões excedentes para um potencial uso futuro, por meio da criopreservação. Falando em criopreservação, você sabe o que é isso? A criopreservação envolve o armazenamento de células e tecidos por longos períodos em temperatura muito baixa (-196°C). 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 28/49 Criopreservação. Antigamente, transferências de embriões criopreservados apresentavam menor taxa de gestação quando comparadas à transferência de embriões a fresco. Porém, com a introdução da técnica de vitrificação em 1999, houve completa revolução no campo da criopreservação, resultando em melhores taxas de sobrevivência à criopreservação e resultados clínicos. Além disso, a criopreservação de embriões tornou-se essencial para a melhoria da segurança e eficácia dos tratamentos de reprodução assistida, e atualmente é um processo bem estabelecido. Saiba mais Em 1984 foi relatado o primeiro nascimento de uma criança proveniente de embrião descongelado. Apenas mais recentemente, com a introdução da criopreservação de oócitos, a técnica tornou-se disponível como uma opção adicional de preservação de fertilidade em mulheres, visto que não necessita do material genético masculino, reservando à mulher a capacidade de procriar com um parceiro escolhido no futuro. Curiosidade A primeira publicação relatando o nascimento de uma criança oriunda de oócitos criopreservados ocorreu em 1986, pelo protocolo de congelamento lento. Duas técnicas básicas são aplicadas à criopreservação: o congelamento lento controlado, muito utilizado nos primórdios da reprodução assistida, e o resfriamento ultrarrápido por vitrificação, que atualmente é a técnica mais utilizada e muito bem estabelecida. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 29/49 Vamos conhecer um pouco mais sobre essas técnicas. Mas antes vamos entender como ocorre a criopreservação. Princípios �siológicos da criopreservação Os princípios fisiológicos da criopreservação e suas restrições são de grande importância para compreender o sucesso (ou insucesso) da técnica. A principal causa de morte celular no processo da criopreservação é a criolesão (lesão pelo frio). Mas o que é criolesão? Sua ocorrência é explicada por diversas teorias, como formação de cristais de gelo intracelular, volume celular mínimo e transição de fases da membrana, danos à membrana celular e alterações no funcionamento do metabolismo, tanto celular quanto mitocondrial. O que é feito para evitar a criolesão? Vamos entender? Princípio da criopreservação Consiste em solidificar a solução por meio de um aumento extremo de sua viscosidade em temperatura extremamente baixa (-196°C, temperatura do nitrogênio líquido). Com intuito de preservação celular durante essa exposição a temperaturas não fisiológicas, é necessário a adição dos chamados crioprotetores. Crioprotetores O objetivo da adiçãode crioprotetor é causar efluxo da água celular que, ao ser resfriada, pode formar os cristais de gelo, lesionando a célula. Crioprotetores são substâncias que atuarão no espaço intracelular ou extracelular dependendo do seu tipo: permeáveis à membrana plasmática (etilenoglicol, glicerol, dimetilsulfóxido, propanediol, acetamida) ou não permeáveis à membrana plasmática (sacarose, trealose). 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 30/49 Crioprotetores não permeáveis à membrana plasmática Atuam por meio de um efeito osmótico, induzindo a desidratação celular durante o resfriamento e regulando sua hidratação no aquecimento, prevenindo a formação dos cristais de gelo. Crioprotetores permeáveis à membrana Atuam de forma dupla: atingem o meio intracelular, por difusão passiva, com a função de substituir a água intracelular e reduzir o seu ponto de congelamento. Além disso, por permanecerem em altas concentrações no meio extracelular, auxiliam a desidratação celular, evitando a formação dos cristais de gelo. Os meios utilizados para a criopreservação contêm os dois tipos de crioprotetores, uma vez que essa combinação permite preservar o equilíbrio osmótico entre os meios intra e extracelular. Técnica de criopreservação de embrião e oócitos Para o sucesso da técnica, as condições devem ser otimizadas para minimizar a incidência de lesões e manter alta a taxa de sobrevivência. Existem duas técnicas que podem ser aplicadas à criopreservação: Congelamento Lento Como o próprio nome diz, o congelamento lento é uma técnica mais demorada, e tem a necessidade de utilizar equipamentos especiais e caros. Essa técnica consiste na adição de crioprotetores ao material e seu posterior resfriamento em rampas de temperaturas lentas, ou seja, na diminuição gradual e constante da temperatura. Em 1971 foi registrada sua primeira utilização com sucesso, quando o congelamento ainda ocorreu de forma rudimentar e com rampas de temperatura pouco controladas. Com esse registro e aumento do alcance do procedimento, vários equipamentos para controlar a rampa (variação) de temperatura de resfriamento surgiram no mercado. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 31/49 Cryobath fechado (foto superior) e aberto (foto inferior). Em um protocolo de congelamento lento clássico, estabelecido e utilizado desde meados dos anos 1980, as células são expostas a baixas concentrações de crioprotetores, e a temperatura é gradativamente diminuída de 0,3°C a 0,5°C por minuto, até alcançar a temperatura entre -30°C e -65°C, e então é adicionado o nitrogênio líquido (-196°C), no qual ocorrerá o armazenamento. Durante esse processo, um delicado equilíbrio é mantido pela indução de cristais de gelo extracelulares. Ainda que algumas alterações nos protocolos de congelamento lento tenham contribuído para maiores taxas de sucesso, a eficiência clínica desta técnica ainda é questionável. Acima, verificamos uma foto de um modelo de equipamento utilizado para o congelamento lento (embriões e oócitos). Na imagem, vemos que o equipamento está conectado a um aparelho que controla a rampa de resfriamento. Vitri�cação Tem como foco evitar a formação de cristais de gelo, tanto nas soluções extra quanto nas intracelulares. Os embriões e os oócitos são expostos a taxas extremamente rápidas de resfriamento, antes da submersão em nitrogênio líquido e em soluções com altas concentrações de crioprotetores em volumes muito baixos (<1µL), criando o que é conhecido como estado vítreo. Atualmente, a técnica de escolha para o congelamento de oócitos e embriões é a vitrificação, devido à menor chance de ocorrer dano celular, sendo importante ressaltar que o uso dos crioprotetores representou um grande avanço na criogenia. A vitrificação tem somado qualidade ao tratamento de reprodução assistida, com melhores taxas de sobrevivência e desenvolvimento embrionário pós descongelamento, o que permite a programação da transferência embrionária para um momento mais adequado, social e fisiologicamente. Existem diferentes tipos de meios de cultura comercializados, no entanto, todos são muito similiares, visto que contêm duas soluções base utilizadas em duas etapas distintas: equilibration solution (ES) e vitrification 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 32/49 solution (VS). O oócito ou embrião é colocado no meio ES, no qual, inicialmente, tem a saída de água, sendo, depois, reidratado com a entrada dos meios crioprotetores. Após essa fase, o oócito ou embrião é submerso no meio VS com posterior inserção na palheta de vitrificação, onde sofrerá mais desidratação para posterior imersão no nitrogênio líquido. Placa, soluções e palhetas utilizados durante a técnica de vitrificação. Existem dois sistemas de vitrificação: aberto e fechado. No sistema aberto, a amostra entra em contato direto com o nitrogênio líquido no momento da imersão. No sistema fechado, a amostra é contida em um invólucro selado (uma capa de plástico semelhante a um canudo, com as extremidades fechadas) que impede o contato direto com o nitrogênio líquido. Palheta com sistema aberto. Sistema fechado. O “canudo” amarelo (invólucro) com amostra. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 33/49 Estudos mostram que o sistema aberto consegue fazer a rampa de resfriamento mais rapidamente que o sistema fechado, no qual há primeiro o resfriamento do invólucro para posterior resfriamento da amostra. Isso torna o sistema aberto mais seguro no que se refere à formação dos cristais de gelo. Palheta aberta submersa no nitrogênio líquido. Saiba mais Para o congelamento de oócitos e embriões a concentração do agente crioprotetor utilizada deve seguir a indicada pelo fornecedor. Além disso, estudos mostram que a vitrificação tem melhor taxa de sobrevida, fazendo com que, atualmente, poucas clínicas no mundo utilizem o congelamento lento. No Brasil, somente uma clínica ainda utiliza essa metodologia. Descongelamento de oócitos e embriões O descongelamento ou aquecimento é o processo inverso da criopreservação. Nesse caso, retiramos os crioprotetores em três etapas: thawing solution (TS) - solução de descongelamento -, diluent solution (DS) - diluente - e washing solution (WS) - solução de lavagem - para a reidratação do embrião. Placa de descongelamento. Palheta submersa na primeira etapa do descongelamento (TS). Após a finalização desse processo, o embrião e o oócito ainda necessitam de tempo para a completa reidratação até retomar o tamanho normal. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 34/49 Blastocisto após descongelamento. Blastocisto 3 horas após descongelamento. Criopreservação de embrião e oócitos Neste vídeo, a especialista Vanessa Amil mostra as técnicas de congelamento e descongelamento de oócitos e embriões e pontua as suas principais diferenças. Indicações da criopreservação de embriões Em algumas situações clínicas, a paciente poderá ter indicação de congelamento total dos embriões produzidos naquele ciclo de FIV, seja devido a alguma doença, alteração ou risco clínico, seja por não desejar a transferência a fresco naquele momento. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 35/49 As indicações que justificam o congelamento embrionário são: baixa reserva ovariana, teste genético pré- implantacional, cavidade uterina inadequada, progesterona elevada, risco de síndrome do hiperestímulo ovariano e embriões excedentes. Agora, vamos conhecer melhor cada uma dessas indicações.Baixa reserva ovariana Esse diagnóstico advém dos testes de reserva ovariana basal realizados (dosagem de FSH, LH, estradiol, progesterona e AMH – hormônio antimülleriano). A opção para esse casal é a realização da FIV (fertilização in vitro) e o congelamento dos embriões para que possa ter um número maior de embriões (acúmulo de embriões), permitindo que, no futuro, tenham embriões que possibilitem o aumento da prole. Teste genético pré-implantacional Após o cultivo dos embriões, os blastocistos biopsiados podem ser transferidos no mesmo dia, caso o estudo genético seja feito imediatamente (esse procedimento só é possível se a clínica estiver localizada na mesma cidade do laboratório de análise genética). Na maioria dos centros, pela indisponibilidade desse imediatismo, é necessário o congelamento destes embriões para que haja tempo do resultado ser disponibilizado. Nesses casos, o blastocisto euploide será transferido em outro ciclo. Cavidade uterina inadequada O congelamento embrionário pode ser indicado em alguns casos, devido a doenças que diminuem as chances de implantação. Doenças como adenomiose, miomatose e endometriose podem tornar inadequada a cavidade uterina e assim reduzir o sucesso do tratamento. Progesterona elevada D t FIV tí l h l á l l t t f li l d lt 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 36/49 Indicações da criopreservação de oócitos A indicação da criopreservação de oócitos são as seguintes: Baixa reserva ovariana Nesses casos, podem ser realizados vários ciclos com criopreservação de oócitos, e quando for alcançado o número desejado de oócitos, realiza-se o descongelamento e prossegue-se com a FIV. Durante a FIV, o estímulo hormonal responsável pelo recrutamento folicular pode alterar o endométrio, fator importante para o processo do tratamento. Caso ocorra aumento da progesterona plasmática acima de 1.500pg/mL no dia do gatilho com o HCG (gonadotrofina coriônica humana), o ideal é o congelamento embrionário total, visto que essa situação está associada à baixa taxa de gravidez. Risco de síndrome do hiperestímulo ovariano A Síndrome da Hiperestimulação Ovariana (SHO) é uma complicação decorrente do estímulo ovariano com indutores de ovulação, podendo levar a quadros graves. Geralmente ocorre devido a uma resposta exacerbada dos ovários ao estímulo hormonal e resulta em um número grande de oócitos. Assim, quando ocorrer esta síndrome, a criopreservação de embriões é indicada por ser uma tática importante para minimizar o risco de hiperestimulação em pacientes suscetíveis, visto que a transferência a fresco desencadeia um novo pico de HCG. Embriões excedentes Segundo a resolução do Conselho Federal de Medicina (CFM) n° 2.294, de 27 de maio de 2021, não é permitido o descarte de embriões viáveis e a quantidade de embriões a serem transferidos é limitada (< 37 anos até 2 embriões,> 37 anos até 3 embriões). Sendo assim, após a transferência dos embriões, os excedentes viáveis devem ser criopreservados. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 37/49 Preservação social Consiste naqueles casos em que as pacientes desejam adiar a gravidez devido a diversas razões pessoais. Pacientes oncológicas Visto que uma das grandes complicações do tratamento para o câncer é a esterilidade ou perda da função gonadal, faz-se necessária a criopreservação dos gametas femininos para preservação da fertilidade. Doação de oócitos Os gametas são criopreservados nesses casos quando não há sincronização entre o ciclo da doadora e o preparo endometrial da receptora. Criopreservação de sêmen e espermatozoides obtidos por biópsia O congelamento de espermatozoides humanos começou a ser introduzido na prática clínica e laboratorial a partir de 1960, e desde então é considerado uma parte fundamental dentro das técnicas de reprodução humana assistida (TRA). Apesar de não ser possível recuperar a motilidade de todos os espermatozoides que eram inicialmente móveis, a técnica passou a ganhar importância especialmente em casos de pacientes ainda sem filhos que seriam submetidos a tratamento de quimioterapia ou radioterapia, que os deixariam inférteis, subférteis ou com prognóstico desconhecido. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 38/49 Para que a amostra de sêmen fosse criopreservada de maneira segura, foram desenvolvidos industrialmente inúmeros crioprotetores para serem adicionados aos espermatozoides. O mecanismo de ação deles deve garantir a proteção das estruturas intracelulares. Como já sabemos, a função dos crioprotetores é retirar água dos gametas, evitando a formação de cristais de gelo. Quanto mais permeável a membrana plasmática do gameta, melhor será a resposta do espermatozoide ao processo de criopreservação. Aspectos laboratoriais da criopreservação de espermatozoides O sucesso da criopreservação dos espermatozoides é afetado pela taxa de resfriamento durante o congelamento. No congelamento rápido, a água presente no meio intracelular congela, causando danos às organelas pela formação de cristais de gelo. Se a taxa de congelamento for baixa, as células serão danificadas em razão da formação lenta de gelo no meio extracelular, aumentando a concentração de solutos extracelulares e, por causa dessa diferença de osmolaridade, a água sai das células, resultando em desidratação. Atenção! Para evitar uma lesão ao espermatozoide, é realizado o rígido controle das taxas de congelamento e são adicionados à amostra de sêmen os crioprotetores e diluentes. O crioprotetor mais utilizado é o glicerol, que foi descoberto em 1949. As concentrações de glicerol no volume final mais adequadas para a proteção durante o congelamento são de 6% e 7%. Quando combinados aos diluentes, a sobrevivência espermática é maior do que com uso exclusivo do glicerol. Atualmente, os diluentes que contêm gema de ovo, tampões, citrato e sacarose são os mais indicados. Técnica para criopreservação de espermatozoides 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 39/49 obtidos por biópsia e sêmen A adição e a remoção do crioprotetor em concentração proporcional provoca estresse momentâneo na membrana plasmática dos espermatozoides. Vamos entender melhor: Adição do crioprotetor Quando a adição do crioprotetor é feita na mesma concentração de uma só vez, o estresse na membrana plasmática dos espermatozoides é muito alto. Redução do dano Esse dano pode ser diminuído e a sobrevivência dos espermatozoides aumentada se a adição do crioprotetor for de forma lenta (em gotas), em velocidade de cerca de 1mL por minuto. Após a adição total do crioprotetor, o material é armazenado em recipiente criogênico (criotubo) e submetido ao vapor de nitrogênio e em seguida submerso em nitrogênio líquido (-196°C). Recipientes criogênicos (Criotubos) que armazenam o sêmen na criopreservação. Saiba mais Antes do congelamento, avaliamos os parâmetros seminais (concentração, motilidade e vitalidade). A baixa qualidade seminal pode ser devido a varicocele, fator hormonal, genético, traumas etc. Quando o paciente apresenta uma amostra com alteração significativa, mas é possível selecionar espermatozoide para realizar a FIV, conversamos com ele e explicamos qual seria a recuperação da amostra e orientamos quantas amostras ele precisará criopreservar para um tratamento. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 40/49 Os parâmetros seminais devem ser avaliados antes do congelamento. Essa análise é realizada no laboratório de andrologia. Para o descongelamento, a maneira mais comum é retirar o materialcongelado do nitrogênio líquido e deixá-lo à temperatura ambiente até sua total liquefação. Após o descongelamento, é feito o processo de capacitação espermática, que consiste em separar os melhores espermatozoides do líquido seminal, pelas técnicas laboratoriais que eliminam da amostra os espermatozoides imóveis, os detritos celulares, os leucócitos e as células imaturas. Recomendação Os espermatozoides obtidos a partir de biópsia de testículo devem ser criopreservados da mesma maneira que aqueles provenientes do sêmen. Apesar dos inúmeros avanços na área da criopreservação, ainda há muitos vieses da técnica a serem aprimorados. Durante essa avaliação, é fundamental avaliar alguns indicadores após o descongelamento da amostra, como a qualidade seminal. Vamos entender o porquê? Qualidade seminal A diminuição da qualidade do sêmen, principalmente da sua motilidade, e o aumento da fragmentação de DNA são fatores esperados após o descongelamento da amostra e, por essa razão, são também exemplos de indicadores de que a técnica precisa ser refinada. Além disso, as taxas de recuperação em geral dependem da qualidade da amostra antes da criopreservação. Amostras de sêmen de baixa qualidade são mais propensas a sofrer danos ao DNA e apoptose do que aquelas de boa qualidade. Motilidade dos espermatozoides A motilidade dos espermatozoides é o aspecto mais afetado pelo processo de criopreservação, pois lesiona algumas estruturas celulares dos gametas. As mitocôndrias são t t l l l i t diá i d t id i d 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 41/49 Indicações da criopreservação do sêmen e dos espermatozoides obtidos por biópsia A criopreservação de sêmen deve ser considerada como procedimento preventivo diante das seguintes situações: antes de quimioterapia e radioterapia; antes de cirurgia de testículo ou próstata; em caso de dificuldade de coleta ou ausência do companheiro no dia do tratamento de reprodução assistida; em indivíduos que vão realizar cirurgia de vasectomia e desejam preservar a fertilidade futura; em indivíduos que trabalham em profissões de alto risco para fertilidade (indústrias químicas, exposição aos agrotóxicos e pesticidas e exposição a radiações ionizantes); em amostras obtidas por técnicas cirúrgicas, do epidídimo e/ou testículo. Dentre as técnicas de recuperação cirúrgicas estão: as estruturas celulares que envolvem a peça intermediária dos espermatozoides, agindo como fornecedoras de energia para a cauda e promovendo o movimento flagelar característico dos espermatozoides. Aparentemente o que provoca a diminuição da atividade mitocondrial nos espermatozoides após seu descongelamento é o aumento dos níveis de apoptose celular. Diminuição da atividade mitocondrial As mitocôndrias são as estruturas celulares que envolvem a peça intermediária dos espermatozoides, agindo como fornecedoras de energia para a cauda e promovendo o movimento flagelar característico dos espermatozoides. Aparentemente o que provoca a diminuição da atividade mitocondrial nos espermatozoides após seu descongelamento é o aumento dos níveis de apoptose celular. Taxas de recuperação As taxas de recuperação em geral dependem da qualidade da amostra seminal antes da criopreservação. Amostras de sêmen de baixa qualidade são mais propensas a sofrer danos ao DNA e apoptose do que aquelas de boa qualidade. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 42/49 PESA (do inglês, Aspiração Percutânea de Espermatozoides do Epidídimo); MESA (do inglês, Aspiração Microcirúrgica de Espermatozoides do Epidídimo); TESA (do inglês, Aspiração de Espermatozoides do Testículo); TESE (do inglês, Extração de Espermatozoides do Testículo); Micro-TESE (do inglês, Extração de Espermatozoides do Testículo por Microdissecção). Congelamento de tecido ovariano e ovário A criopreservação de tecido ovariano é atualmente o método de escolha para preservar a fertilidade de pacientes jovens com diagnóstico de câncer. O primeiro país a relatar o nascimento de uma criança após a criopreservação de tecido ovariano com autotransplante ortotópico (implante do fragmento de tecido ovariano retirado do próprio ovário da paciente) foi a Bélgica, em 2004. A técnica aplicada foi baseada em experimentos que demonstraram, pela primeira vez, a possibilidade de êxito em transplantes ortotópicos (transplantar o órgão na posição anatômica original). Nos anos seguintes, com o aprimoramento das técnicas, outros nascimentos esporádicos provenientes tanto de gestação espontânea quanto de fertilização in vitro, foram reportados. Exemplo Em 2009, um grupo espanhol reportou o nascimento de gêmeos após tratamento quimioterápico e criopreservação de tecido ovariano, seguido de transplante, estimulação ovariana induzida e vitrificação dos oócitos. As dificuldades de se criopreservar o ovário e o tecido ovariano humano se devem à hipóxia dos tecidos, à não revascularização, à permeabilidade ineficaz do crioprotetor e à complexidade da foliculogênese, além 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 43/49 do risco de se transplantar células malignas, principalmente na vigência de neoplasias. Técnica de criopreservação de tecido ovariano e ovário A partir de um procedimento cirúrgico, realizado por videolaparoscopia (com visualização utilizando câmeras de vídeo especializadas), é retirada uma parte ou todo o ovário, de acordo com a indicação. O tecido ovariano é cortado em fatias finas da região cortical, onde estão presentes os folículos primordiais, e incubado por 5 minutos em meio de cultura suplementado e tamponado, antes da criopreservação. A desidratação acontece em duas fases: Primeira fase Na primeira, o tecido é imerso no meio de cultivo, ao qual são adicionados dimetilsulfóxido (DMSO) e sacarose em concentrações de 2,0mol/L e 0,1mol/L, respectivamente, por 5 minutos. Segunda fase Na segunda fase, o tecido é adicionado ao meio suplementado com DMSO (dimetilsulfóxido), PROH (1,2- propanodiol) e sacarose, em concentrações de 2,0mol/L, 2,0mol/L e 0,2mol/L, respectivamente, também por 5 minutos. Imediatamente após a segunda fase, as tiras desidratadas devem ser aspiradas com pipeta Pasteur e vagarosamente liberadas diretamente no nitrogênio líquido. Após estarem congelados, os fragmentos de tecido ovariano podem permanecer armazenados por tempo indeterminado. Por exemplo, após o tratamento de quimioterapia ou radioterapia, há uma chance considerável de a mulher entrar na menopausa precocemente. Caso isso aconteça, os fragmentos do ovário criopreservados poderão ser descongelados e reimplantados no organismo da paciente de forma a proporcionar a chance de uma gravidez futura. A seguir vemos um esquema mostrando o passo a passo da técnica do congelamento de tecido e ovário. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 44/49 Passo a passo da técnica do congelamento de tecido e ovário. Descongelamento do tecido ovariano e ovário O processo de descongelamento consiste em expor o recipiente ou a palheta em que o tecido está armazenado, a uma temperatura de 37°C por um minuto, e submergir o material em um gradiente decrescente de sacarose, cuja função é regular a troca de crioprotetor por meio de cultura essencial. Atenção! Após o descongelamento do tecido ovariano, ele deve ser reimplantado no sítio ortotópico ou heterotópico (transplantar o órgão em outra posição anatômica diferente da orignal), dependendo da técnica e do objetivo do reimplante. Indicação para a criopreservação de tecido ovariano e ovário Pacientes que, após o diagnóstico do câncer, não têm tempo suficiente para congelamento de oócitos/embriões ou contraindicaçãopara receberem estimulação ovariana com hormônios são candidatas à técnica. Além disso, essa é a única opção para preservação de fertilidade em meninas antes da puberdade. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 45/49 Falta pouco para atingir seus objetivos. Vamos praticar alguns conceitos? Questão 1 Vimos alguns métodos de criopreservação de embriões e oócitos. Sobre esses métodos, analise as afirmativas a seguir. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 46/49 I. A vitrificação consiste na adição de crioprotetores ao material e seu posterior resfriamento em rampas de temperaturas lentas. II. A eficiência da técnica de criopreservação pelo método lento ainda é questionável. III. No congelamento lento, os embriões e os oócitos são expostos a taxas extremamente rápidas de resfriamento, antes da submersão em nitrogênio líquido. IV. Existem dois tipos de palhetas de vitrificação (sistema aberto e sistema fechado). É correto o que se afirma em: Parabéns! A alternativa E está correta. O congelamento lento é uma técnica que tem eficiência questionável, pois consiste na adição de crioprotetores ao material e seu posterior resfriamento em rampas de temperaturas lentas. A vitrificação é uma técnica de criopreservação ultrarrápida. Os oócitos e os embriões são armazenados em palhetas que podem ser abertas ou fechadas, e expostos a taxas extremamente rápidas de resfriamento, antes da submersão em nitrogênio líquido. Questão 2 Aprendemos que a criopreservação de sêmen e espermatozoides obtidos por biópsia é realizada por uma técnica diferente da empregada para a criopreservação de oócitos e dos embriões. Sobre a A I e II. B I e III. C I e IV. D II e III. E II e IV. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 47/49 criopreservação dos espermatozoides obtidos pelo sêmen ou por biópsia, analise as afirmativas a seguir e assinale a alternativa correta: Parabéns! A alternativa C está correta. Os espermatozoides devem ser criopreservados pela mesma técnica, independentemente se foram obtidos pelo sêmen ou por biópsia testicular. O sucesso da criopreservação dos espermatozoides é afetado pela taxa de resfriamento durante o congelamento. O crioprotetor mais utilizado é o glicerol e, para aumentar a sobrevivência espermática, devemos utilizar diluentes. O descongelamento dos espermatozoides após a criopreservação deve ser realizado a temperatura ambiente. Considerações �nais A O congelamento dos espermatozoides e do sêmen não é afetado pela taxa de resfriamento. B O crioprotetor mais empregado durante o congelamento do sêmen é o dimetilsulfóxido. C A criopreservação de espermatozoides provenientes da biópsia testicular é igual à criopreservação do sêmen. D Na criopreservação dos espermatozoides, não são empregados os diluentes, pois eles diminuem a sobrevivência espermática. E Após a criopreservação, o descongelamento deve ser realizado em uma rampa de temperatura, com declínio lento da temperatura. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 48/49 Ao longo deste conteúdo, estudamos algumas técnicas complementares realizadas durante a reprodução assistida auxiliando na identificação de causas de infertilidade e aumentando o sucesso dos tratamentos. Vimos que o PGT é um teste realizado a partir da análise de células embrionárias, retiradas do embrião por biópsia e posteriormente analisadas em laboratório especializado, de acordo com a doença a ser identificada. Esse procedimento é indicado para casais que tenham alto risco de transmissão de doenças genéticas para seus filhos. Este teste é dividido em, PGT-A, PGT-M PGT-HLA, PGT-SR, PGT-P e NICS e pode ser realizado em embriões no estágio de clivagem ou de blastocisto. Entretanto, estudos mostram que, quando realizada no estágio de blastocisto, a técnica demonstra ser menos prejudicial ao embrião, pois as células que vão originar o feto (provenientes da massa celular interna) são deixadas intactas. Aprendemos também que a criopreservação de gametas e embriões é uma técnica complementar que visa preservar a fertilidade tanto masculina quanto feminina. Essa técnica consiste na conservação de gametas ou embriões em baixas temperaturas para que sejam utilizados em tratamentos futuros de reprodução assistida (transferência embrionária ou fertilização in vitro). Podcast Neste podcast, a especialista Vanessa Nayane Pino Perez falará sobre como entrou para a reprodução assistida, a rotina, os procedimentos e os cuidados que devem ser tomados em diferentes procedimentos e muito mais. Vamos lá? Referências ALMODIN, C. G.; COSTA, R. R. Criopreservação em Reprodução. Dental Press, 2014. 27/02/2023 18:55 Técnicas complementares na reprodução assistida https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/03007/index.html# 49/49 AZAMBUJA, R. et al. Reprodução assistida: Técnicas de Laboratório. Porto Alegre: Age, 2017. BORGES, E.; CORTEZZI, S. S.; FARAH, S. Reprodução humana assistida. Rio de Janeiro: Atheneu, 2011. BORGES JUNIOR, E.; BRAGA, D. P. A. F.; SETTI, A. S. Reprodução humana assistida: Associação estudo Sapientiae. 2. ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 2020. DZIK, A. et al. Tratado de reprodução assistida. Segmento Farma, 2011. MARINHO, R. M. Preservação da fertilidade: uma nova fronteira em medicina reprodutiva e oncologia. 1. ed. Rio de Janeiro: MedBook, 2015. TREFF, N. R. et al. Preimplantation genetic testing for polygenic disease relative risk reduction: evaluation of genomic index performance in 11,883 adult sibling pairs. Genes. 2020; 11, 648. Explore + Leia o livro Reprodução Assistida, disponível na página da internet da REDLARA.
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