Relatório 5 - Enzimologia - Grupo 1 - P1 docx (4)

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Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências da Saúde
Departamento de Ciências Farmacêuticas
Enzimologia Industrial
Relatório
Determinação da atividade da invertase
Coordenador:
Discentes: Anaías Carine, Hugo Vítor, José Deiwson, Laerte José e Mariana Candeias.
Agosto/20
22
Recife-PE
1.Objetivo da Prática:
O objetivo da prática foi aplicar os conhecimentos adquiridos para fazer a determinação da
atividade da invertase, geralmente, feita pela e catalisação e hidrólise da molécula de sacarose em
α-D-glicose e β-D-frutose, utilizando o reativo 3,5-dinitrosalicílico (DNS). Este método tende a
promover a redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico e,
simultaneamente na oxidação do grupo aldeído ou cetônico a grupos carboxílicos, é possível ter o
desenvolvimento da cor laranja/marrom intensos, como marcadores. Dessa forma, esta técnica nos
permite analisar as características qualitativas das amostras pela mudança de coloração.
2.0 Materiais e Métodos
2.1 Materiais
- Pipetas graduadas de 1 mL
- 1 pêra;
- 1 Pipetador de volumes manual;
- Reagente DNS;
- Solução tamponada de sacarose;
- Solução com invertase
- Água destilada;
- Proveta de 10 mL;
- 5 tubos de ensaio;
- 1 Estante para tubo de ensaio.
2.2 Métodos
1 - Utilizou-se 3 tubos de ensaio, onde foram inseridos 0,5 mL do reagente
3,5-dinitrosalicílico (DNS) em cada tubo, com auxílio da pipeta graduada em 1 mL.
2 - Em seguida, adicionou-se 1mL de solução de amostra contendo a invertase e 1mL de
solução tamponada a 0,3 M com auxílio da pipeta graduada em 1 mL, em um tubo à parte.
3 - Após isso, esta solução foi colocada em um banho termostático a 37ºC por 10
minutos com início às 10:39 horas e saiu do banho às 10:49.
4 - Em seguida, pegou-se este tubo de ensaio com o material “Bruto” e foi realizada uma
diluição da solução, porém, antes, retirando-se 0,5 mL dessa solução é adicionado ao tubo de
ensaio 1 contendo 0,5 de DNS, para formar o “bruto” e no tubo anterior foi adicionado 9,5
mL de água a 1,5 da solução em questão, constatando a proporção final de 1:20.
5 - E depois, dessa diluição retirou-se 0,5 mL da solução diluída na proporção 1:20, e esse
volume foi adicionado no segundo tubo contendo 0,5 mL do reagente de DNS (padrão) e no
terceiro tudo foi colocado apenas 0,5 de água destilada para o controle.
6 - Após a etapa anterior, levou os três tubos para um segundo banho maria a 100°C por
mais 10 minutos às 10:52 horas.
7 - Logo depois do tempo do segundo banho maria, as amostras foram retiradas, resfriadas
em uma vasilha com água, e por fim, após o resfriamento os três tubos foram completados
com 3 mL de água destilada e partiu-se para a leitura qualitativa das amostras.
8 - Diante disso, os três tubos tiveram colorações distintas, o bruto se aproximou mais da
cor marrom escuro, o padrão para um marrom claro e o controle para um amarelo claro.
Fonte: Autoral
3. Resultados e discussão
Imagem 1
- .
Fonte: Autoral
Evidencia-se, portanto, que após o 2º banho a 100°C, realizado para inativar a enzima invertase,
a solução 1 apresentou uma coloração mais avermelhada isso ocorreu devido a uma grande
quantidade de açúcares redutores produzidos pela ação da invertase que converteu sacarose em
glicose e frutose as quais foram oxidadas pelo reagente DNS.O ácido 3,5-dinitrosalicílico (agente
oxidante presente no reativo DNS), sob condições alcalinas, reage com o carbono carbonílico de
açúcares redutores e se reduz a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, um composto corado cuja
absorção máxima de luz se dá a 540 nm (Santos, A. A. et al.)
O tubo 2 apresentou uma coloração mais alaranjada tendo em vista que foi diluído e diminui a
concentração de açúcares redutores presentes e consequentemente redução do DNS, segundo
Lambert-beer a coloração da solução está diretamente relacionada a sua concentração, como é o
caso do resultado obtido.
O tubo 3 foi o controle, por apresentar apenas DNS e água obteve-se uma coloração amarela,
caracteristica do reagente DNS.
Pode-se inferir que a invertase utilizada na reação apresenta atividade, em uma temperatura
ótima de 37°C em 10 minutos, a mesma conseguiu realizar a hidrólise efetiva da sacarose em
açúcares redutores, isso é importante ao se pensar em uma escala industrial a qual se é necessário
a utilização de enzimas pois esses carboidratos são dois (glicose e frutose) dos principais
monossacarídeos presentes em processos fermentativos, dentre os quais se destacam a produção
de vinho, cachaça e etanol combustível (Santos, A. A. et al.)
Durante a prática, foi realizado o método apenas qualitativo colorimétrico, não foi obtido a
concentração dos açúcares, apenas sua presença, apesar disso seria possível utilizando um
espectrofotômetro no comprimento de onda de 540 nm obtendo o valor de absorbância, o qual
com a presença de uma curva padrão de açúcares redutores pode ser transformado em
concentração
4. Conclusão:
Ao observar todos os tubos de ensaio e compará-los com o tubo controle, pode-se perceber
que o tom da coloração indica a fator de diluição da solução em questão, quanto maior a
diluição, mais próximo da coloração inicial do reagente DNS vai estar. Portanto, ao variar de
um marrom mais escuro(bruto) (tubo 1) para um amarelo mais claro (controle) (tubo 3), é
possível atestar a presença de glicose, em maior concentração no bruto do que no padrão,
justamente pela diluição que foi feita para o padrão. Além disso, não foi possível utilizar o
espectrofotômetro para leitura das absorbâncias das soluções no comprimento de onda de
595nm, em consequência, também não será possível comparar o valor da absorbância em uma
curva padrão e adicioná-las aos resultados.
5. Referências
● SANTOS, AA DOS et al. Dosagem de açúcares redutores com o DNS reativo em
microplaca. Revista Brasileira de Tecnologia de Alimentos , v. 20, n. 0, 2017.
● MOURA, C.L.A; PINTO, G.A.S; Rodrigues, S. 2007. Determinação da Atividade de
Invertase em Extratos Enzimáticos. 1º edição
● Conhecimentos abordados em sala de aula teórica e prática.