Apostila de Protocolos

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1 
 
Departamento de Bioquímica 
Instituto de Química – USP 
 
Apostila de protocolos 
 
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL 
 
QBQ 0316N 
2013 
 
Professores 
 
Carlos Takeshi Hotta 
Guilherme Menegon Arantes 
 
 
 
 
Esta apostila foi desenvolvida originalmente por: 
Bayardo B. Torres 
Iolanda M, Cuccovia 
Maria Têresa Machini Miranda 
Pedro Soares de Araújo 
Remo Trigoni Jr. 
Sandro R. Marana 
 
2 
 
Prática 1 – Lise de células de levedura 
 
Objetivos – romper células de Saccharomyces cerevisiae. 
Reagentes Materiais Aparelhos 
• água destilada 
• células de levedura (fase log tardia) 
• etanol (EtOH) 
• 100 mM fluoreto de α-fenilmetilsulfonila 
(PMSF) em EtOH 
• hipoclorito de sódio 20 g/l (água 
sanitária) 
• tampão fosfato 100 mM pH 7,0 com 5 
mM EDTA (tampão de lise) 
• banho de gelo 
• pérolas de vidro 0,5 mm ø 
• pipetadores 
• pipetas 
• provetas 
• suporte para tubos 
• tubos de centrífuga 
• tubos de ensaio 
• tubos Falcon 
• centrífuga 
• estufa 
• freezer 
• vórtice 
 
Procedimento A – Fracionamento celular 
ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO 
1. Em um tubo de centrífuga com tampa colocar aproximadamente 1 g (peso úmido) de células de 
leveduras crescidas até a fase logarítmica tardia 
2. Adicionar 4 ml de tampão de lise 
3. Ressuspender as células usando um vórtice 
4. Adicionar 40 µL de PMSF (100 mM) em etanol 
5. Homogeneizar em vórtice 
6. Adicionar à suspensão 8 ml de pérolas de vidro lavadas e secas 
7. Agitar ininterruptamente em vórtice durante 1 min (processo de lise) 
8. Resfriar em banho de gelo por 1 min 
9. Repetir as operações 7 e 8 por mais 4 vezes 
10. Centrifugar a suspensão de células + pérolas de vidro a 850g por 2 min 
11. Remover cuidadosamente o sobrenadante– evitar coletar o material precipitado – passando-o para 
um tubo Falcon limpo e identificado como “LISADO” 
12. Manter o tubo “LISADO” em banho de gelo 
13. Ressuspender o precipitado + pérolas de vidro em 4 ml de tampão de lise 
14. Adicionar 40 µL de PMSF (100 mM) em etanol 
15. Homogeneizar em vórtice 
16. Repetir as etapas 10 a 15 por mais 2 vezes, reunindo os sobrenadantes no mesmo tubo “LISADO” 
17. Usando uma proveta, determinar o volume do “LISADO” 
18. Dividir o lisado em 3 alíquotas de igual volume e transferí-las para tubos Falcon 
19. Identificar os tubos com o número do grupo para armazenagem em freezer a –20oC 
 
Procedimento B – Lavagem das pérolas de vidro (executado pelas técnicas) 
1. Transferir as pérolas de vidro para um erlenmeyer 
2. Adicionar hipoclorito de sódio no erlenmeyer 
3. Agitar algumas vezes durante 15 min 
4. Descartar cuidadosamente o hipoclorito de sódio (2x) 
5. Adicionar água no erlenmeyer 
6. Lavar as pérolas 
7. Descartar cuidadosamente a água 
8. Repetir as etapas 6 a 8 por mais 5 vezes 
9. Adicionar etanol no erlenmeyer 
10. Colocar o erlenmeyer numa estufa e aguardar a secagem das pérolas 
3 
 
Prática 2 – Dosagem de proteína 
 
Objetivos – dosar colorimetricamente proteínas no lisado de Saccharomyces cerevisiae. 
Reagentes Materiais Aparelhos 
• água destilada 
• albumina 0,2 g/l 
• lisado de leveduras (P1) 
• reagente de Bradford (ácido fosfórico 
85%, Coomassie Blue G, metanol) 
 
• papel de filtro 
• cubetas para leitura 
• pipetadores 
• pipetas 
• ponteiras 
• suporte para tubos 
• tubos de ensaio 
• espectrofotômetro 
• vórtice 
 
Procedimento A – Curva-padrão de proteína 
1. Adicionar em cada tubo os volumes de albumina e água estipulados na Tabela 1 
2. Adicionar o reagente de Bradford 
3. Homogeneizar em vórtice 
4. Aguardar 5 minutos com os tubos em temperatura ambiente 
5. Usar o “branco” para calibrar (“zerar”) o espectrofotômetro 
6. Ler as absorbâncias a 595 nm 
7. Completar a Tabela 2 
8. Construir a curva-padrão para detecção de proteínas com reagente de Bradford 
 
Tabela 1 
tubos Albumina 
0,2 g/l (µl) 
Água 
(µl) 
Reagente de 
Bradford 
(ml) 
Branco 0 100 1,0 
1 10 90 1,0 
2 20 80 1,0 
3 30 70 1,0 
4 40 60 1,0 
5 50 50 1,0 
6 60 40 1,0 
7 70 30 1,0 
8 80 20 1,0 
 
Tabela 2 
tubos Massa de 
proteína (mg) 
A595 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
4 
 
Procedimento B – Dosagem de proteínas no lisado de Saccharomyces cerevisiae 
 
OBSERVAÇÃO: para esse procedimento é necessário que o lisado seja diluído. Para isso segue o 
procedimento para diluição 100x: 
1. Transferir 0,1 ml do lisado para um tubo de ensaio grande identificado como L100X 
2. Adicionar 9,9 ml de água destilada. 
3. Homogeneizar em vórtice. 
 
1. Adicionar em cada tubo os volumes de água e amostras do lisado diluído estipulados na Tabela 3 
2. Adicionar o reagente de Bradford 
3. Homogeneizar em vórtice 
4. Aguardar 5 minutos com os tubos em temperatura ambiente 
5. Usar o “branco” para calibrar (“zerar”) o espectrofotômetro 
6. Ler as absorbâncias a 595 nm 
7. Completar a Tabela 4 
 
OBSERVAÇÃO: Caso a absorbância das amostras experimentais esteja fora dos limites das absorbâncias 
obtidas na curva-padrão, discuta com o professor ou monitor um novo valor de diluição. 
 
Tabela 3 
tubos L100x 
(µl) 
Água 
(µl) 
Reagente de 
Bradford (ml) 
Branco 0 100 1,0 
A1 100 0 1,0 
A2 50 50 1,0 
A3 30 70 1,0 
A4 20 80 1,0 
 
Tabela 4 
tubos A595 
A1 
A2 
A3 
A4 
 
 
5 
 
Prática 3 – Determinação da atividade enzimática 
 
Objetivos – determinar a atividade da α-glicosidase no lisado de Saccharomyces cerevisiae. 
Reagentes Materiais Aparelhos 
• água destilada 
• lisado de leveduras (P1) 
• 8 mM p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) 
em água 
• tampão fosfato 200 mM (pH 7,0) 
• tampão carbonato-bicarbonato 250 mM 
(pH 11,0) 
 
• banho de gelo 
• microplacas de 96 poços 
• pipetadores 
• pipetas 
• ponteiras 
• suportes para tubos de ensaio 
• tubos de ensaio 
 
• banho a 30oC 
• espectrofotômetro de 
microplacas 
• vórtice 
 
Procedimento A – diluição do lisado de Saccharomyces cerevisiae 
ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO 
Abaixo segue o procedimento sugerido para a diluição da preparação do lisado de Saccharomyces 
cerevisiae. 
1. Transferir 0,2 ml do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado como L10X 
2. Adicionar 1,8 ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente 
3. Transferir 0,4 ml de L10X para um novo tubo identificado como L50X 
4. Adicionar 1,6 ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente 
5. Transferir 0,2 ml de L50X para um novo tubo identificado como L500X 
6. Adicionar 1,8 ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente 
7. Manter todos os tubos no gelo 
 
Procedimento B – determinação da atividade da α-glicosidase 
ATENÇÃO! Este procedimento deve ser feito para cada uma das diferentes diluições do lisado que foram 
preparadas. 
Todos estes ensaios podem ser montados simultaneamente, iniciando o procedimento sempre pela adição 
do substrato. 
Somente quando todos os tubos já tiverem recebido o substrato deverá ser iniciada a adição das diferentes 
diluições de lisado. 
1. Preparar os tubos em banho de gelo 
2. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc estipulados na Tabela 1 
3. Adicionar em cada tubo o lisado devidamente diluído 
4. Transferir simultaneamente todos os tubos para o banho a 30oC 
5. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 1 
6. Ao remover cada tubo, interromper a reação enzimática adicionando 2 ml de tampão carbonato-
bicarbonato pH 11,0 
7. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 
8. Colocar 100 µ l de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, não se esqueça de anotar 
a posição de cada tubo 
9. Uma vez que a placaesteja preparada, ler as absorbâncias a 420 nm no leitor de microplacas 
10. Completar as Tabelas 2 a 4 
 
 
6 
 
Tabela 1 
tubos 8 mM 
NPαGlc (ml) 
tampão 
fosfato pH 7,0 
(ml) 
lisado diluído 
(ml) 
tempo de 
incubação a 
30 oC (min) 
1 0,1 0,1 0,2 5 
2 0,1 0,1 0,2 10 
3 0,1 0,1 0,2 15 
4 0,1 0,1 0,2 20 
Branco de enzima - - 0,4 20 
Branco de substrato* 0,2 0,2 - - 
* preparar somente um tubo 
Tabela 2 – L10x 
tubos réplica 1 
(A420) 
réplica 2 
(A420) 
réplica 3 
(A420) 
média 
(A420) 
1 
2 
3 
4 
Branco de enzima 
Branco de substrato 
Tabela 3 – L50x 
tubos réplica 1 
(A420) 
réplica 2 
(A420) 
réplica 3 
(A420) 
média 
(A420) 
1 
2 
3 
4 
Branco de enzima 
Branco de substrato 
Tabela 4 – L500x 
tubos réplica 1 
(A420) 
réplica 2 
(A420) 
réplica 3 
(A420) 
média 
(A420) 
1 
2 
3 
4 
Branco de enzima 
Branco de substrato 
 
y = 0.0049x + 0.014
R² = 0.9974
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 50 100 150 200 250 300
Ab
s 
42
0 
n
m
NPαGlc (nmol)
Curva padrão do NPαGlc
7 
 
Prática 4 – Caracterização da enzima – pH ótimo 
 
Objetivos – Determinar o efeito do pH na atividade catalítica da α-glicosidase. 
Reagentes Materiais Aparelhos 
• água destilada 
• lisado de leveduras (P1) 
• 8 mM p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) 
em água 
• tampão borato 200 mM (pH 8,0) 
• tampão borato 200 mM (pH 9,0) 
• tampão citrato 200 mM (pH 4,0) 
• tampão citrato 200 mM (pH 5,0) 
• tampão citrato 200 mM (pH 6,0) 
• tampão carbonato-bicarbonato 250 mM 
(pH 11,0) 
 
• banho de gelo 
• microplacas de 96 poços 
• pipetadores 
• pipetas 
• ponteiras 
• suportes para tubos de ensaio 
• tubos de ensaio 
 
• banho a 30oC 
• espectrofotômetro de 
microplacas 
• vórtice 
 
Procedimento A – diluição do lisado de Saccharomyces cerevisiae 
Deve ser dada preferência para a diluição que gerou a melhor medida de atividade enzimática na prática 
anterior. 
Caso não seja possível utilizá-la, abaixo segue o procedimento sugerido para a diluição da preparação do 
lisado de Saccharomyces cerevisiae 
1. Transferir 0,2 ml do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado com L10X 
2. Adicionar 1,8 ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente 
3. Transferir 0,1 ml de L10X para um novo tubo identificado com L100X 
4. Adicionar 4,9 ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente 
5. Manter no gelo 
 
Procedimento B – Ensaio da atividade enzimática 
1. Realizar os ensaios de atividade enzimática sobre p-nitrofenil-α-glicosídeo (NP α Glc) em 6 diferentes 
valores de pH 
2. Preparar em banho de gelo, para todos os tampões diferentes, um conjunto de tubos para os ensaios de 
atividade de acordo com a Tabela 1 
3. Misturar cuidadosamente 
4. Adicionar o lisado (devidamente diluído) de Saccharomyces cerevisiae 
5. Agitar manualmente com cuidado 
6. Transferir todos os tubos do gelo ao mesmo tempo para um banho a 30oC 
7. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 1 
8. Ao retirar cada tubo do banho, interromper a reação enzimática pela adição de 2 ml de tampão 
carbonato-bicarbonato 
9. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 
10. Colocar 100 µ l de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, não se esqueça de anotar 
a posição de cada tubo 
11. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 420 nm no leitor de microplacas 
12. Completar as Tabelas 2, 3 e 4 
13. Determinar graficamente o pH ótimo da α-glicosidase 
 
 
8 
 
pH = ________________________ 
Tabela 1 
tubos 8 mM NPαGlc 
(ml) 
Tampão _____ 
pH ____ 
(ml) 
lisado diluído 
(ml) 
tempo 
(min) 
1 0,1 0,1 0,2 5 
2 0,1 0,1 0,2 10 
3 0,1 0,1 0,2 15 
4 0,1 0,1 0,2 20 
 
Tabela 2 
pH = 4,0 pH = 5,0 
Tubos réplica 1 
(A420) 
réplica 2 
(A420) 
réplica 3 
(A420) 
Média 
(A420) 
Tubos réplica 1 
(A420) 
réplica 2 
(A420) 
réplica 3 
(A420) 
Média 
(A420) 
1 1 
2 2 
3 3 
4 4 
 
Tabela 3 
pH = 6,0 pH = 8,0 
Tubos réplica 1 
(A420) 
réplica 2 
(A420) 
réplica 3 
(A420) 
Média 
(A420) 
Tubos réplica 1 
(A420) 
réplica 2 
(A420) 
réplica 3 
(A420) 
Média 
(A420) 
1 1 
2 2 
3 3 
4 4 
 
Tabela 4 
pH = 9,0 
Tubos réplica 1 
(A420) 
réplica 2 
(A420) 
réplica 3 
(A420) 
Média 
(A420) 
1 
2 
3 
4 
 
 
9 
 
Tratamento de dados e análise dos resultados para o relatório 1 
Prática 1 – Lise de células de levedura 
Prática 2 – Dosagem de proteína 
Prática 3 – Determinação da atividade enzimática 
Prática 4 – Caracterização da enzima – pH ótimo 
 
O relatório deverá conter as seguintes informações: 
 
1. A concentração de proteínas no lisado (mg/ml) e a quantidade total de proteínas obtidas (mg). Para 
obter esta informação será necessário calcular: 
a) Plotar a curva padrão da concentração de proteína pela Abs595nm 
b) Calcular a equação da reta para o gráfico plotado 
c) A concentração de proteínas (mg/ml) no L100x 
d) A concentração de proteínas (mg/ml) no lisado inicial 
 
2. A concentração da atividade enzimática (mU/ml) e no lisado em pH 7,0. Para obter esta informação 
será necessário calcular: 
a) Converter a Abs420nm em concentração de NPαGlc (mM) 
b) Plotar um gráfico com a concentração de NPαGlc (mM) pelo tempo para cada concentração de 
lisado 
c) Calcular a equação da reta para o gráfico plotado 
d) Utilizar a equação da reta para calcular a atividade enzimática (mU) de cada concentração de lisado 
e) Calcular a concentração da atividade enzimática (mU/ml) do lisado original, não se esqueça de 
corrigir pela diluição 
f) Calcular a atividade específica do lisado (mU/mg) 
 
3. O gráfico com a concentração a atividade enzimática (mU/ml) em diversos pH. Para obter esta 
informação será necessário calcular: 
a) Converter a Abs420nm em concentração de NPαGlc para cada pH 
b) Plotar o gráfico do aumento da concentração de NPαGlc ao longo do tempo para cada pH 
c) Calcular a equação da reta para o gráfico plotado 
d) Utilizar a equação da reta para calcular a atividade enzimática em cada pH 
e) Calcular a atividade enzimática relativa em cada pH. A atividade enzimática relativa é a 
porcentagem da atividade enzimática em cada pH em relação à maior atividade enzimática 
observada (incluir as medidas da P3 em pH 7,0 na análise) 
f) Plotar um gráfico com a atividade enzimática relativa pelo pH do tampão 
 
Além disso, o relatório deverá conter as respostas das seguintes perguntas: 
a) Qual a razão de se manter o lisado em gelo? 
b) Por que foi adicionado 100 mM PMSF ao tampão de lise? 
c) Qual é a razão de se usar um branco ao utilizar o espectrofotômetro? 
d) Por que se utiliza NPαGlc para medir a atividade enzimática da α-glicosidase? 
e) Qual é a razão de se utilizar um branco do substrato e um branco da enzima? 
f) Em qual pH a atividade da enzima deve ser máxima? Como o pH de um tampão pode influenciar na 
atividade enzimática? 
 
10 
 
Prática 5 – Purificação de proteínas – cromatografia de troca iônica 
 
Objetivos – Isolar a α-glicosidase utilizando resina de troca iônica. 
 
Procedimento A – Hidratação da DEAE-Sephadex (executado pelas técnicas) 
 
Pesar 0,5 g de DEAE-Sephadex em um béquer 
1. Adicionar 100 ml de tampão fosfato 10 mM pH 6,8 
2. Misturar bem utilizando um bastão de vidro 
3. Decantar de um dia para o outro 
 
Procedimento B – Montagem da coluna de troca iônica (executado pelas 
técnicas) 
 
Montagem da coluna 
1. Utilizar o barrilde uma seringa (20 ml) como suporte da resina 
2. Prender a seringa em um suporte 
3. Colocar um pouco de lã de vidro no seu interior 
4. Compactar a lã de vidro na base utilizando um bastão de vidro 
5. Lavar a coluna com água destilada para retirar fragmentos de lã de vidro 
6. Adaptar uma mangueira de aproximadamente 6 cm na saída da pipeta 
7. Fechar a mangueira com uma presilha 
 
Processo de empacotamento 
8. Fechar a presilha 
9. Homogeneizar com um bastão de vidro a suspensão contendo a resina (Procedimento A) 
10. Adicionar a suspensão até a marca de 1,0 ml 
11. Deixar decantar 
12. Repetir essa operação até a resina sedimentada ocupar o interior da seringa até 1,0 ml 
13. Com a resina empacotada, lavá-la com 20 ml de tampão fosfato 10 mM sem NaCl 
14. Após a lavagem, fechar a presilha 
15. Deixar 3 mm de tampão acima do topo da resina 
16. NUNCA DEIXAR A RESINA SECAR 
 
11 
 
Procedimento C – Cromatografia de troca iônica 
 
Preparação da amostra 
1. Descongelar o lisado, transferir uma alíquota de 1,0 ml para um tubo “tipo eppendorf” e centrifugar a 
10.000 g por 13 s. Coletar o sobrenadante para usar nas etapas abaixo. 
2. Parte de material (0,4 ml) será usada na cromatografia abaixo, enquanto que o restante (0,6 ml) deverá 
ser guardado (congelado) para os próximos passos. 
 
Preparação da coluna 
3. Diluir 0,4 ml do sobrenadante do lisado (ver etapa anterior) adicionando 0,6 ml de tampão fosfato 10 
mM sem NaCl. É muito importante que apenas o sobrenadante do lisado seja usado para evitar 
“entupimento” da coluna. 
4. Verificar se a presilha está fechada. 
5. Utilizar uma pipeta para transferir toda a amostra (devidamente diluída) homogeneamente para a 
coluna. 
6. Colocar o tubo 1 na saída da coluna e abrir a presilha. 
7. Deixar a amostra escoar pela coluna até cerca de 3 mm acima do topo da resina. 
8. Fechar a presilha e transferir o tubo 1 para o gelo. 
 
Eluição das proteínas não retidas pela coluna 
9. Adicionar cuidadosamente tampão fosfato sem NaCl (2 ml) 
10. Colocar o tubo 2 na saída da coluna e abrir a presilha permitindo que o tampão flua pela resina 
11. Coletar 1 ml em cada tubo de ensaio 
12. Trocar o tubo de ensaio e sempre adicionar mais 1 ml de tampão 
13. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 8 
14. Adicionar cuidadosamente mais 1,0 ml de tampão. Assim, acima da resina deverá haver 2,0 ml de 
tampão 
15. Coletar mais dois tubos, sem adicionar tampão 
16. Ao final da coleta do tubo 10, o tampão deverá estar cerca de 3 mm acima do topo da resina 
 
Eluição das proteínas retidas pela coluna 
17. Adicionar cuidadosamente tampão fosfato com NaCl (2,0 ml) 
18. Abrir a presilha e permitir que o tampão flua pela resina 
19. Coletar 1,0 ml em cada tubo de ensaio 
20. Trocar o tubo de ensaio e sempre adicionar mais 1 ml de tampão 
21. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 18 
22. Adicionar 1,0 ml de tampão. Assim, acima da resina deverá haver 2,0 ml de tampão 
23. Coletar mais dois tubos, sem adicionar tampão 
24. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 20. Não deixar a coluna secar 
 
12 
 
Procedimento D – Identificação das frações que contêm a α-glicosidase 
ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO 
1. Preparar um conjunto de tubos numerados de 1 a 20. Adicionar em cada tubo 0,2 ml de 4mM NPαGlc 
2. Transferir os tubos em banho de gelo 
3. Adicionar em cada um destes tubos 0,2 ml das frações coletadas durante a cromatografia 
4. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para um banho de 30oC 
5. Incubar os tubos por 10 min 
6. Ao remover os tubos, adicionar em cada um 2 ml de tampão carbonato-bicarbonato pH 11,0 
7. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 
8. Colocar 100 µ l de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços 
9. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 420 nm no leitor de microplacas 
7. Completar a Tabela 1 
8. Construir um gráfico Absorbância versus números dos tubos 
9. Uma vez identificados os tubos que contém atividade enzimática, reunir as frações (eluídas na 
cromatografia) correspondentes em um tubo “Falcon” identificado como MATERIAL DEAE – número do 
grupo 
Tabela 1 
tubos A420 tubos A420 
1 11 
2 12 
3 13 
4 14 
5 15 
6 16 
7 17 
8 18 
9 19 
10 20 
 
Procedimento E – Determinação da atividade enzimática do lisado de S. 
cerevisiae 
ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO 
Todos os tubos deste ensaio podem ser montados simultaneamente, iniciando o procedimento sempre 
pela adição do substrato. Somente quando todos os tubos já tiverem recebido o substrato deverá ser 
iniciada a adição do sobrenadante do lisado previamente diluído. 
 
1. Diluir o sobrenadante do lisado (utilizar a diluição escolhida na P3) 
2. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc estipulados na Tabela 2 
3. Adicionar em cada tubo o sobrenadante do lisado devidamente diluído 
4. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para o banho a 30oC 
5. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 2 
6. Ao remover cada tubo, interromper a reação enzimática adicionando 2 ml de tampão carbonato-
bicarbonato pH 11,0 
7. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 
8. Colocar 100 µ l de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços 
9. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 420 nm no leitor de microplacas 
10. Completar a Tabela 3 
11. Com os dados obtidos determinar a concentração de atividade enzimática de α-glicosidase(mU/ml) 
presente no sobrenadante do lisado. 
13 
 
Tabela 2 
tubos 4 mM NPαGlc 
(ml) 
água destilada 
(ml) 
lisado diluído 
(ml) 
tempo de 
incubação a 
30 oC (min) 
1 0,2 - 0,2 5 
2 0,2 - 0,2 10 
3 0,2 - 0,2 15 
4 0,2 - 0,2 20 
Branco da enzima - 0,2 0,2 20 
Branco do substrato 0,2 0,2 - - 
 
Tabela 3 
tubos réplica 1 
(A420) 
réplica 2 
(A420) 
réplica 3 
(A420) 
média 
(A420) 
1 
2 
3 
4 
Branco da enzima 
 
Procedimento F – Determinação da atividade enzimática no material DEAE 
Este procedimento pode ser feito junto com o procedimento E 
1. Dilua o material DEAE, transferindo 0,2 ml do material DEAE e 1,8 ml de água destilada para um tubo 
identificado como DEAE-10X. Homogeneizar suavemente e manter no gelo 
2. Adicionar em cada tubo de ensaio os volumes de NPαGlc e material DEAE (diluído 10x) estipulados na 
Tabela 4 
3. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para um banho a 30oC e incubar os tubos pelos intervalos de 
tempos indicados na Tabela 4 
4. Ao remover cada tubo, interromper a reação enzimática adicionando 2 ml de tampão carbonato-
bicarbonato pH 11,0 
5. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 
6. Colocar 100 µ l de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços 
7. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 420 nm no leitor de microplacas e completar 
a Tabela 5 
8. Calcular a atividade da α-glicosidade no Material DEAE. 
Tabela 4 
tubos 4 mM NPαGlc 
(ml) 
Material DEAE 
(diluído 10x) 
(ml) 
tempo de 
incubação a 
30 oC (min) 
1 0,2 0,2 5 
2 0,2 0,2 10 
3 0,2 0,2 15 
4 0,2 0,2 20 
Tabela 5 
tubos réplica 1 
(A420) 
réplica 2 
(A420) 
réplica 3 
(A420) 
média 
(A420) 
1 
2 
3 
4 
14 
 
Procedimento G – Dosagem de proteínas do material DEAE 
ATENÇÃO! O material DEAE usado neste procedimento não deve ser diluído 
1. Adicionar em cada tubo os volumes de água e material DEAE estipulados na Tabela 6 
2. Adicionar o reagente de Bradford 
3. Homogeneizar em vórtice e aguardar 5 minutos 
4. Usar o branco para calibrar (zerar) o espectrofotômetro 
5. Ler as absorbânciasa 595 nm utilizando cubetas 
6. Completar a Tabela 7 
 
Tabela 6 
Tubos Material DEAE 
(ml) 
Água 
(ml) 
Reagente de Bradford 
(ml) 
Branco - 0,1 1,0 
1 0,1 - 1,0 
2 0,1 - 1,0 
3 0,1 - 1,0 
 
Tabela 7 
Tubos A595 Massa de proteína 
(mg) 
Volume de 
amostra (ml) 
Concentração de 
proteína (mg/ml) 
1 
2 
3 
 
Procedimento H – Dosagem de proteínas do material DEAE 
ATENÇÃO! O material DEAE usado neste procedimento não deve ser diluído 
Este procedimento pode ser feito junto com o procedimento G 
1. Diluir 20x o lisado obtido após centrifugação. Transferir 0,1 ml do lisado para um tubo e adicionar 1,9 ml 
de água destilada 
2. Adicionar em cada tubo os volumes de lisado diluído estipulados na Tabela 8 
3. Homogeneizar em vórtice e aguardar 5 minutos 
4. Usar o branco para calibrar (zerar) o espectrofotômetro 
5. Ler as absorbâncias a 595 nm utilizando cubetas 
6. Completar a Tabela 9 
 
Tabela 8 
Tubos Material DEAE 
(ml) 
Água 
(ml) 
Reagente de Bradford 
(ml) 
1 0,1 - 1,0 
2 0,1 - 1,0 
3 0,1 - 1,0 
 
Tabela 9 
Tubos A595 Massa de proteína 
(mg) 
Volume de 
amostra (ml) 
Concentração de 
proteína (mg/ml) 
1 
2 
3 
 
15 
 
Tratamento de dados e análise dos resultados para o relatório 2 
Prática 5 – Purificação de proteínas – cromatografia de troca iônica 
 
O relatório deverá conter as seguintes informações: 
 
1. Um gráfico contendo a atividade enzimática medida na fração eluída pelo número do tubo coletado. 
Indique o momento em que a coluna foi eluída com NaCl. 
2. A atividade enzimática (mU) total adiciona na coluna de cromatografia. Para obter esta informação, 
será necessário calcular: 
a) a concentração de atividade enzimática (mU/ml) de α-glicosidase no lisado 
3. A atividade específica da α-glicosidase (mU/mg) do lisado. Para obter esta informação, será necessário 
calcular: 
a) a concentração de proteínas (mg/ml) de α-glicosidase no lisado 
4. A atividade enzimática (mU) total recuperada após a passagem pela coluna de cromatografia. Para 
obter esta informação, será necessário calcular: 
b) a concentração de atividade enzimática (mU/ml) de α-glicosidase no material DEAE 
5. A atividade específica da α-glicosidase (mU/mg) do material DEAE. Para obter esta informação, será 
necessário calcular: 
b) a concentração de proteínas (mg/ml) de α-glicosidase no material DEAE 
6. O cálculo da recuperação e o enriquecimento da α-glicosidase após a cromatografia de troca iônica 
a) A recuperação é a proporção da atividade enzimática total adicionada à coluna de cromatografia 
que foi recuperada no material DEAE 
b) O enriquecimento é quantas vezes a atividade específica da α-glicosidase aumentou após a 
passagem pela coluna de cromatografia (atividade específica do material DEAE dividida pela 
atividade específica do lisado). 
 
 
 
16 
 
Prática 6 – Purificação de proteínas – SDS-PAGE 
 
Objetivos – Analisar a composição de proteínas do material eluído na cromatografia de troca-iônica que 
contém atividade de α-glicosidase. 
 
Reagentes 
tampão de amostra 
água 
solução C 
glicerol 
100 g/l SDS 
5 g/l azul de bromofenol 
β-mercaptoetanol 
 
 
3,55 ml 
1,25 ml 
2,50 ml 
2,00 ml 
0,20 ml 
0,05 ml 
 
 solução A 
acrilamida 
N’N’bis metilenoacrilamida 
água 
 
 
29,2 g 
0,80 g 
100 ml 
solução de coloração 
Coomassie blue R® 
metanol 
ácido acético 
água 
 
0,1 g 
40 ml 
10 ml 
50 ml 
 
 solução B 
1,5 M Tris 
(acertar valor de pH com HCl) 
 
 
pH 8,8 
solução de descoloração 
metanol 
ácido acético 
água 
 
 
40 ml 
10 ml 
50 ml 
 solução C 
0,5 M Tris 
(acertar valor de pH com HCl) 
 
 
pH 6,8 
tampão de corrida 
tris 
glicina 
100 g/l SDS 
água 
 
3,03 g 
14,4 g 
1,0 g 
1 L 
 
Obs.: Não acertar o pH desta solução tampão 
 
Procedimento A – preparação das amostras 
1. Aplicar as seguinte amostras no gel de SDS-PAGE: 
a. lisado de Saccharomyces cerevisiae (30 µ l) 
b. frações eluídas na cromatografia de troca-iônica e que contém alfa-glicosidase, denominado 
Material DEAE (maior volume possível até 1 ml) 
 
Diálise das amostras 
2. Transferir para um microtubo o volume indicado de amostra. 
3. Identificar o microtubo com: 
a. Nome da amostra. 
b. Número do grupo. 
4. Adicionar água, caso necessário, até completar 600 µ l 
5. Cobrir o microtubo com um pedaço de membrana de diálise 
6. Prender a membrana de diálise com um anel de borracha 
7. Transferir o microtubo para um suporte de isopor 
8. Colocar o suporte dentro de um béquer contendo água 
9. Manter em agitação por pelo menos 16 h 
17 
 
Secagem a vácuo (executado pelas técnicas) 
10. Após a diálise, transferir as amostras para um concentrador a vácuo 
11. Secar as amostras 
 
Desnaturação das proteínas presentes nas amostras 
12. Transferir para cada microtubo 20 µ l de tampão de amostra 
13. Transferir os microtubos para um banho fervente 
14. Incubar os microtubos por 5 min 
15. Aplicar as amostras no gel de eletroforese com o auxílio de micropipetadores 
 
Procedimento B – preparação do gel de SDS-PAGE (feito pelas técnicas) 
Preparação do gel de separação 
1. Adicionar em um tubo os volumes estipulados na Tabela 1 
2. Homogeneizar rapidamente 
3. Transferir a mistura, utilizando uma pipeta Pasteur, para as placas de vidro previamente montadas 
4. Aguardar a polimerização – cerca de 60 min 
5. Colocar o pente sobre entre as placas de vidro 
 
Preparação do gel de empilhamento 
6. Após a polimerização do gel de separação, adicionar em outro tubo os volumes estipulados na Tabela 2 
7. Homogeneizar rapidamente 
8. Transferir a mistura, utilizando uma pipeta Pasteur, para as placas de vidro (com o pente) contendo o 
gel de separação polimerizado 
9. Aguardar a polimerização – cerca de 40 min 
10. Após a polimerização do gel de empilhamento, retirar cuidadosamente o pente 
11. Adicionar o tampão de corrida 
 
Tabela 1 
soluções volume 
água 4,02 ml 
100 g/l SDS 100 µL 
solução A 3,33 ml 
solução B 2,5 ml 
TEMED 5 µL 
persulfato de amônio 50 µL 
 
Tabela 2 
soluções volume 
água 3,05 ml 
100 g/l SDS 50 µL 
solução A 0,65 ml 
solução C 1,25 ml 
TEMED 5 µL 
persulfato de amônio 25 µL 
 
 
18 
 
Procedimento C – eletroforese, coloração e descoloração 
1. Correr a eletroforese com 100V, durante aproximadamente 40 min 
2. Desligar a fonte quando o corante marcador de frente atingir a base do gel 
3. Desconectar os cabos 
4. Retirar o gel 
5. Colocar o gel no frasco contendo a solução de coloração 
6. Corar o gel por 40 min 
7. Retirar o gel do frasco de coloração 
8. Colocar o gel no frasco contendo a solução de descoloração 
9. Descorar o gel 
10. Visualizar as bandas de proteínas 
 
Procedimento D – desidratação do gel (opcional) 
1. Colocar o gel num frasco contendo água 
2. Trocar tantas vezes quanto for necessário a água do frasco até a remoção completado ácido acético 
3. Retirar o gel hidratado do frasco com água 
4. Colocar o gel num frasco contendo solução de glicerol 50 g/l 
5. Molhar com a solução de glicerol lâminas de celofane natural 
6. Dispor as folhas de celofane sobre placas limpas de vidro 
7. Colocar os géis sobre as lâminas de celofane devidamente hidratadas e limpas 
8. Colocar outra folha de celofane previamente hidratada sobre o gel, formando assim um sanduíche. 
9. Retirar delicadamente as bolhas de ar que estiverem aprisionados pelas folhas de celofane 
10. Esticar as folhas e prendê-las 
11. Deixar secar à temperatura ambiente 
 
Fórmula estruturais e massas molares 
 
 
19 
 
Prática 7 – Caracterização da α–glicosidase: Km e Vmax 
 
Objetivos – Caracterizar a α-glicosidase de Saccharomyces cerevisiae através das determinações daafinidade (Km) da enzima pelo substrato (p-nitrofenol-α-glicosídeo) e da velocidade máxima (Vmax) de 
hidrólise do substrato. 
Reagentes Materiais Aparelhos 
• água destilada 
• lisado de levedura 
• 1,0 mM p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) 
em tampão fosfato 100 mM (pH 7,0) 
• 2,0 mM NPαGlc em tampão fosfato 100 
mM (pH 7,0) 
• 8,0 mM NPαGlc em tampão fosfato 100 
mM (pH 7,0) 
• tampão carbonato-bicarbonato 250 mM 
(pH 11,0) 
• tampão fosfato 100 mM (pH 7,0) 
• banho de gelo 
• microplacas de 96 poços 
• pipetadores 
• pipetas 
• ponteiras 
• suportes para tubos de 
ensaio 
• tubos de ensaio 
 
• banho a 30oC 
• espectrofotômetro de 
microplacas 
• vórtice 
 
Procedimento A – Diluição do lisado de Saccharomyces cerevisiae 
ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO 
Utilize a diluição usada na Prática 3. O volume total necessário será de 5,0 ml 
1. Transferir 0,1 ml do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado com L10X 
2. Adicionar 0,9 ml de água destilada gelada 
3. Homogeneizar SUAVEMENTE 
4. Transferir 0,5 ml de L10X para um novo tubo identificado com L100X 
5. Adicionar 4,5 ml de água destilada gelada 
6. Homogeneizar SUAVEMENTE 
 
Procedimento B – Medidas de velocidade da reação de hidrólise do substrato 
ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO 
1. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc estipulados na Tabela 1. ATENÇÃO: prestar atenção nas 
diferentes concentrações de substrato 
2. Preparar os tubos em banho de gelo 
3. Adicionar em cada tubo os volume de tampão e lisado (devidamente diluído) estipulados na Tabela 1. 
Agitar manualmente com cuidado 
4. Transferir todos os tubos do gelo para o banho a 30oC 
5. Incubar todos os tubos por 40 min (OU PELO DOBRO DO MAIOR TEMPO USADO NA PRÁTICA 3) 
6. Remover todos os tubos do banho 
7. Adicionar 2 ml de tampão carbonato-bicarbonato 
8. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 
9. Colocar 100 µ l de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços 
10. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 420 nm no leitor de microplacas e 
completar as Tabelas 2 e3 
11. Construir os gráficos necessários para a determinação do Km e Vmax da α-glicosidase para o substrato 
utilizado 
20 
 
Tabela 1 
tubos 1 mM NPαGlc 
(ml) 
2 mM NPαGlc 
(ml) 
8 mM NPαGlc 
(ml) 
Tampão fosfato 
100 mM pH 7 
(ml) 
Lisado diluído 
(ml) 
1 0,02 - - 0,28 0,10 
2 0,04 - - 0,26 0,10 
6 0,08 - - 0,22 0,10 
4 0,12 - - 0,18 0,10 
5 0,16 - - 0,14 0,10 
6 0,20 - - 0,10 0,10 
7 - 0,16 - 0,14 0,10 
8 - 0,20 - 0,10 0,10 
9 - - 0,10 0,20 0,10 
10 - - 0,13 0,17 0,10 
11 - - 0,15 0,15 0,10 
 
Tabela 2 
tubos réplica 1 
(A420) 
réplica 2 
(A420) 
réplica 3 
(A420) 
média 
(A420) 
1 
2 
6 
4 
5 
6 
7 
8 
9 
10 
11 
 
Tabela 3 
tubos [S] no tubo 
de ensaio 
(mM) 
média 
(A420) 
Produto 
(nmols) 
Tempo de 
reação (min) 
Velocidade 
(nmol/min) 
1 
2 
6 
4 
5 
6 
7 
8 
9 
10 
11 
 
21 
 
Prática 8 – Caracterização da α–glicosidase: determinação de padrão de 
inibição por maltose 
 
Objetivos – Determinar o padrão de inibição de maltose sobre a hidrólise de p-nitrofenil-α-glicosídeo 
(NPαGlc) efetuada pela -glicosidase de Saccharomyces cerevisiae 
Reagentes Materiais Aparelhos 
• água destilada 
• lisado de levedura 
• 1,0 mM p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) 
em tampão fosfato 100 mM (pH 7,0) 
• 2,0 mM NPαGlc em tampão fosfato 100 
mM (pH 7,0) 
• 8,0 mM NPαGlc em tampão fosfato 100 
mM (pH 7,0) 
• 0,4 M maltose em tampão fosfato 100 mM 
(pH 7,0) 
• 1,2 M maltose em tampão fosfato 100 mM 
(pH 7,0) 
• 1,6 M maltose em tampão fosfato 100 mM 
(pH 7,0) 
• tampão carbonato-bicarbonato 250 mM 
(pH 11,0) em tampão fosfato 100 mM (pH 
7,0) 
• tampão fosfato 100 mM (pH 7,0) 
 
• banho de gelo 
• microplacas de 96 poços 
• pipetadores 
• pipetas 
• ponteiras 
• suportes para tubos de ensaio 
• tubos de ensaio 
 
• banho a 30oC 
• espectrofotômetro 
de microplacas 
• vórtice 
 
 
 
Procedimento A – Medidas da velocidade de reação de hidrólise do substrato na 
presença de inibidor 
ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO 
1. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc e maltose estipulados na Tabela 1. ATENÇÃO: prestar 
atenção nas diferentes concentrações de substrato e inibidor 
2. Adicionar em cada tubo os volume de tampão e lisado (devidamente diluído) estipulados nas Tabelas 1 
(grupos pares) e 2 (grupos ímpares). 
3. . Agitar manualmente com cuidado. 
4. Transferir todos os tubos do gelo para o banho a 30oC 
5. Incubar todos os tubos pelo dobro do tempo usado na prática 7 
6. Remover todos os tubos do banho. 
7. Adicionar 2 ml de tampão carbonato-bicarbonato. 
8. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 
9. Colocar 100 µ l de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços 
10. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 420 nm no leitor de microplacas e 
completar as Tabelas 3 e 4 
11. Construir os gráficos necessários para a determinação do padrão de inibição da α-glicosidase por 
maltose. 
 
22 
 
Tabela 1 (grupos pares) 
tubos 1 mM 
NPαGlc 
(ml) 
2 mM 
NPαGlc 
(ml) 
8 mM 
NPαGlc 
(ml) 
0,4 M 
maltose 
(ml) 
1,2 M 
maltose 
(ml) 
Tampão 
fosfato 
100 mM 
pH 7 (ml) 
Lisado 
diluído 
(ml) 
1A 0,08 - - 0,10 - 0,12 0,10 
1B 0,08 - - 0,10 - 0,12 0,10 
2A 0,20 - - 0,10 - - 0,10 
2B 0,20 - - 0,10 - - 0,10 
3A - 0,16 - 0,10 - 0,04 0,10 
3B - 0,16 - 0,10 - 0,04 0,10 
4A - 0,20 - 0,10 - - 0,10 
4B - 0,20 - 0,10 - - 0,10 
5A - - 0,10 0,10 - 0,10 0,10 
5B - - 0,10 0,10 - 0,10 0,10 
6A - - 0,15 0,10 - 0,05 0,10 
6B - - 0,15 0,10 - 0,05 0,10 
 
Tabela 2 (grupos ímpares) 
tubos 1 mM 
NPαGlc 
(ml) 
2 mM 
NPαGlc 
(ml) 
8 mM 
NPαGlc 
(ml) 
0,4 M 
maltose 
(ml) 
1,2 M 
maltose 
(ml) 
Tampão 
fosfato 
100 mM pH 
7 
(ml) 
Lisado 
diluído 
(ml) 
7A 0,08 - - - 0,10 0,12 0,10 
7B 0,08 - - - 0,10 0,12 0,10 
8A 0,20 - - - 0,10 - 0,10 
8B 0,20 - - - 0,10 - 0,10 
9A - 0,16 - - 0,10 0,04 0,10 
9B - 0,16 - - 0,10 0,04 0,10 
10A - 0,20 - - 0,10 - 0,10 
10B - 0,20 - - 0,10 - 0,10 
11A - - 0,10 - 0,10 0,10 0,10 
11B - - 0,10 - 0,10 0,10 0,10 
12A - - 0,15 - 0,10 0,05 0,10 
12B - - 0,15 - 0,10 0,05 0,10 
Tabela 3 
tubos [S] final 
(mM) 
[I] final 
(mM) 
réplica 1 
(A420) 
réplica 2 
(A420) 
réplica 3 
(A420) 
média 
(A420) 
1A 
1B 
2A 
2B 
3A 
3B 
4A 
4B 
5A 
5B 
6A 
6B 
23 
 
 
Tabela 4 
tubos [S] final 
(mM) 
[I] final 
(mM) 
réplica 1 
(A420) 
réplica 2 
(A420) 
réplica 3 
(A420) 
média 
(A420) 
7A 
7B 
8A 
8B 
9A 
9B 
10A 
10B 
11A 
11B 
12A 
12B 
 
 
 
24 
 
Tratamento de dados e análise dos resultados para o relatório 3 
Prática 6 – Purificação de proteínas – SDS-PAGE 
Prática 7 – Caracterização da α–glicosidase: Km e Vmax 
Prática 8 – Caracterização da α–glicosidase: determinação de padrão de inibição por maltose 
 
O relatório deverá conter as seguintes informações: 
 
1. O provável peso molecular da α-glicosidase. Para obter esta informação, será necessário: 
a) Identificar a banda correspondente à α-glicosidase no gel de SDS-PAGE. 
b) Calcular o provável peso molecular relativo da enzima através dos padrões utilizados na 
eletroforese. 
2. O Km e o Vmax da α-glicosidase. Para obter esta informação,será necessário: 
a) Calcular a velocidade inicial (nmol/min) da reação em todos os tubos da P7 
b) Construir um gráfico de Michaelis-Menten para a α-glicosidase (velocidade inicial pela 
concentração de substrato no tubo de ensaio). 
c) Construir um gráfico de Lineweaver-Burk (1/V pela 1/[S)] 
d) Determinar Km e o Vmax da α-glicosidase 
 
3. Padrão de inibição da α-glicosidase pela maltose. Para obter esta informação, será necessário: 
a) Calcular a velocidade inicial (nmol/min) da reação em todos os tubos da P8, inclua os dados dos 
demais grupos 
b) Construir gráficos de Lineweaver-Burk na presença de concentrações diferentes de inibidor (1/V 
pela 1/[S)] 
c) Determine o padrão de inibição da α-glicosidase pela maltose. 
 
Além disso, o relatório deverá conter as respostas das seguintes perguntas: 
a) Por que é necessário dialisar as amostras antes de correr o gel? 
b) Qual a razão de se fazer um gel de empilhamento em cima do gel de separação? 
c) Qual o papel do SDS? 
d) Como o peso molecular calculado se compara com o peso molecular estimado por outros 
trabalhos? 
e) Elabore uma hipótese de como a maltose funciona como um inibidor da α-glicosidase. 
Tarik
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