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MILENA MARY DE SOUZA ANDRADE Efeito imunomodulador do Resveratrol no estresse oxidativo e na formação de redes extracelulares de neutrófilos na infecção por SARS-CoV-2 São Paulo 2022 2 MILENA MARY DE SOUZA ANDRADE Efeito imunomodulador do resveratrol no estresse oxidativo e na formação de redes extracelulares de neutrófilos na infecção por SARS-CoV-2 Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências Programa de Dermatologia Orientadora: Profª Dra Maria Notomi Sato Coorientadora: Dra Luanda Mara da Silva Oliveira São Paulo 2022 3 4 Nome: Milena Mary de Souza Andrade Título da Dissertação: Efeito imunomodulador do Resveratrol no estresse oxidativo e na formação de redes extracelulares de neutrófilos na infecção por SARS-CoV-2 Orientador (a): Dra. Maria Notomi Sato A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado, em sessão pública realizada a ........./......../.........., considerou o(a) candidato(a): ( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a) Examinador(a): Assinatura: ............................................................................... Nome: ...................................................................................... Instituição: ................................................................................ Examinador(a): Assinatura: ............................................................................... Nome: ...................................................................................... Instituição: ................................................................................ Examinador(a): Assinatura: ............................................................................... Nome: ...................................................................................... Instituição: ................................................................................ Presidente: Assinatura: ............................................................................... Nome: ...................................................................................... Instituição: ................................................................................ 5 Dedicatória Dedico este trabalho a minha família (mãe, pai, irmãs e minha avó Jane) e ao meu noivo Adriano, por todo apoio durante o período do Mestrado, por acreditarem em mim mesmo quando eu não acreditava, me dando apoio, carinho e força sempre. 6 Agradecimentos À Deus, por me manter firme, ser luz e proteção, por cuidar de mim e da minha família. Por me dar sabedoria, saúde e persistência. À minha família: minha mãe Elaine, meu pai Marco, minhas irmãs Camily e Laura, minha avó Jane. Vocês são meu alicerce, minha força e inspiração. Agradeço a Deus por ter vocês sempre comigo, por estarmos juntos mesmo nas dificuldades. Pai e mãe obrigada por nos incentivarem com a educação, obrigada pelo apoio quando decidi iniciar minha vida na ciência desde o aprimoramento e em seguida o Mestrado, vocês sempre foram meu suporte e nunca me desampararam. Amo vocês. Ao meu noivo Adriano, que sempre me incentivou a conquistar meus sonhos, que mesmo com as dificuldades e com as incertezas devido a mudança do projeto não me deixou desistir. Me acompanhando nas idas à Campinas, quando ainda executava o projeto materno- fetal, me esperando para conversar na madrugada quando saia tarde do laboratório. Nunca me desamparou e sempre foi mais que meu namorado, foi meu amigo, companheiro e conselheiro. Sou muito grata por todo seu apoio e sua parceria. Eu te amo. À minha orientadora Maria Notomi Sato, que desde o início me apoiou durante todo o período do mestrado, sempre foi muito receptiva, compreensiva e contribuiu muito para meu desenvolvimento pessoal e cientifico. Acreditou em minha desenvoltura e me incentivou a aprender técnicas novas, iniciar novos protocolos no laboratório. Agradeço por entender minhas necessidades de conciliar o trabalho com a pós graduação, esse apoio e compreensão me permitiram chegar até aqui, e serei eternamente grata por essa oportunidade. À Universidade de São Paulo (USP), a Faculdade de Medicina (FM), ao Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo (IMT-USP), ao Laboratório de Investigação Médica em Dermatologia e Imunodeficiências 56 (LIM-56) e ao Instituto Adolo Lutz por toda infraestrutura, apoio tecnológico e oportunidade de realizar o projeto. Ao Hospital das Clínicas (HC-FMUSP), a Divisão de Laboratório Central (DLC-HC- FMUSP) e ao Comitê de Ética do HC, agradeço por permitir a realização desse trabalho, pela autorização em coletar as amostras dos pacientes e dados do prontuário para levantamento de informações para esse trabalho. A todos os pós-graduando do grupo experimental, Anna Júlia, Anna Cláudia, Danielle, Emily, Franciane, Iara, Júlia, Kelly, Luana, Marina, Natalli, Ricardo, Sarah e Yasmin. Sou grata a todos por contribuíram durante todo o período do projeto e pós graduação. Cada um 7 contribuiu de uma forma importante em meu crescimento, cada dica, e cada reunião, foi excepcional para minha evolução tanto no desenvolvimento cientifico quanto no acadêmico. Mesmo com as dificuldades para desenvolvimento dos projetos a união do grupo e parceria tiveram suma importância para nossa evolução como grupo. Durante a pandemia da Covid-19 nossas incertezas e dificuldades aumentaram, mas fortaleceu ainda mais nosso espirito de equipe e o grupo Covid-19 lutou muito, foram mudanças de projetos, dias e noites no desenvolvimento e remodelamento de projetos e protocolos, padronizações, choros e incertezas. Mas vencemos, e sou eternamente grata por toda força e ajuda de cada um. As minhas amigas Dani, Emily, Iara, Julia, Sarah e Yasmin, que além de colaborarem com o desenvolvimento da pesquisa, sempre estiveram comigo nos momentos mais difíceis e de incerteza, de medo com a mudança do projeto. Formamos um grupo de apoio, conselhos e desabafos que foi fundamental para me manter firme e conseguir finalizar meu projeto e realizar meu sonho de concluir meu mestrado. Meninas amo vocês, obrigada por serem presentes meu coração e em minha vida. Ao Vinicius agradeço pela contribuição com o desenvolvimento do meu projeto, com seus conhecimentos enriqueceu diversos experimentos, e foi meu parceiro de analises e experimentos, suas dicas valiosas para a conclusão desse trabalho. À Dra Walcy e à Paula por fornecer o espaço em seu laboratório para realização das leituras da imunofluorescência, além de colaborar com o aprimoramento das técnicas de marcação de imunofluorescência. Aos médicos e pesquisadores Gil, Telminha, Lucas, Tatiane e Alberto pelo suporte estrutural e científico para o desenvolvimento deste trabalho. À Ruth e ao Marcelo da secretária do departamento de dermatologia e a Tati, Edu, Daniel do LIM-56 pelos inúmeros auxílios na organização, seleção de amostras e logística com as na DLC-HCFMUSP. Aos membros da banca de qualificação do mestrado (Cyro Alves de Brito, Telma Sumida Oshiro e Cristiane Naffah de Souza) por suas importantes contribuições científicas e sugestões importantes para o aprimoramento desse estudo. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), processo: 88887.469380/2019-00 pelo apoio financeiro fundamental no desenvolvimento da pesquisa. A todos que fizeram parte dessa trajetória, agradeço imensamente.8 “Você nunca sabe a força que tem. Até que a sua única alternativa é ser forte” Johnny Depp 9 Normalização adotada: Esta dissertação está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação: Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver). Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso,Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011. Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus Sumário Resumo Abstract 1. Introdução ..................................................................................................................................... 15 1.1. Infecção por Sars-Cov-2 ........................................................................................................ 15 1.2. Neutrófilos ............................................................................................................................. 19 1.3. Neutrófilos e SARS ............................................................................................................... 22 1.4. O Resveratrol na Covid-19 .................................................................................................... 22 3. Materiais e métodos ...................................................................................................................... 26 3.1. Casuística e seleção de amostras ........................................................................................... 26 3.2. Delineamento Experimental .................................................................................................. 27 3.3. Análise fenotípica de PMNs em sangue periférico por citometria de fluxo:......................... 27 3.4. Avaliação do Burst oxidativo de neutrófilos por ensaio de DHR: ........................................ 28 3.5. Análise do efeito do RESV no Burst oxidativo de neutrófilos por ensaio de DHR: ............. 29 3.6. Isolamento de neutrófilos: ..................................................................................................... 30 3.7. Cultura de neutrófilos e avaliação do efeito do RESV: ......................................................... 30 3.8. Quantificação de citocinas por ELISA .................................................................................. 30 3.9. Imunofluorescência para avaliação da formação de NETs: .................................................. 31 3.10. Quantificação de NETs por dosagem de DNA livre das células: .......................................... 31 3.11. Análise Estatística ................................................................................................................. 31 4. Resultados ..................................................................................................................................... 32 4.1. Características clínicas dos pacientes com SARS-CoV-2: .................................................... 32 4.2. Dados de exames laboratoriais de pacientes Covid-19 ......................................................... 36 4.3. Análise fenotípica de neutrófilos de pacientes Covid-19 ...................................................... 37 4.4. Análise tSNE dos subgrupos das populações de granulócitos .............................................. 38 4.5. Análise de citocinas plasmáticas em pacientes com Covid-19 ............................................. 41 4.6. Análise oxidativa de neutrófilos em pacientes Covid-19 ...................................................... 41 4.7. Análise de viabilidade de neutrófilos com RESV ................................................................. 43 4.8. Efeito modulatório do RESV na formação de NETs de neutrófilos ..................................... 43 4.9. Modulação de proteínas in vitro pela ação do Resveratrol.................................................... 46 5. Discussão ...................................................................................................................................... 47 Anexos .................................................................................................................................................. 52 Referências ........................................................................................................................................... 53 13 RESUMO Andrade MMS. Efeito imunomodulador do resveratrol no estresse oxidativo e na formação de redes extracelulares de neutrófilos na infecção por SARS-CoV-2 [dissertação]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2022. A infecção causada pelo Coronavírus do tipo 2 (SARS-COV-2), teve início no final de 2019 em Wuhan, China e em poucos meses se alastrou por diversos países, tornando uma pandemia. No Brasil o primeiro caso ocorreu no final de fevereiro de 2020, e em nove meses infectou mais de 5,5 milhões de pessoas e totalizou mais de 160 mil mortes. A infecção pelo vírus pode evoluir de maneira assintomática a sintomas graves, como a síndrome respiratória aguda grave. As características laboratoriais descritas nos pacientes com Covid-19 é a presença de neutrofilia e linfopenia, exaustão dos linfócitos e aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias. Os danos causados pela neutrofilia tem sido investigado na Covid-19, contudo, carecem observações de como atenuar o estresse oxidativo mediado por neutrófilos. Neste estudo a proposta foi avaliar os neutrófilos e sua capacidade funcional em pacientes com quadro moderado, grave e crítico de Covid-19 internados no HC-FMUSP, e a capacidade antioxidante do Resveratrol. Foram incluídos 190 pacientes com Covid-19, sendo 108 com sintomas moderados, 21 graves e 61 críticos, durante o período de maio de 2020 a outubro de 2021. Em relação aos neutrófilos, além da neutrofilia, foi detectado um aumento de neutrófilos com características imaturas caracterizados pela ausência da expressão do marcador CD10. Essa característica imatura foi verificada em prevalência em pacientes com quadros grave e críticos de sintomas. Na análise funcional foi verificado a maior capacidade oxidativa dos neutrófilos de pacientes moderados comparado aos indivíduos saudáveis, mas reduzida de acordo com a gravidade da doença. Na avaliação por TSNE identificamos um cluster na população de neutrófilos somente nos pacientes com Covid-19 e ausentes em indivíduos do grupo controle. A ação antioxidante mediado pelo Resveratrol foi evidenciado pela diminuição da resposta oxidativa de neutrófilos, da formação de Redes Extracelulares de Neutrófilos (NETs) e pelos níveis de DNA livre de células na cultura com neutrófilos. Em conjunto, os dados mostram que apesar da neutrofilia e do potencial oxidativo na infecção por SARS-Cov-2, há uma redução do índice oxidativo, por provável presença de neutrófilos imaturos. A ação antioxidante, do Resveratrol sugere ser um candidato em potencial para atenuar os efeitos danosos de neutrófilos em infecções virais respiratórias como na infecção por Covid-19. Palavras-chave: SARS-CoV-2. Covid-19. Neutrófilos. Armadilhas extracelulares de neutrófilos. Resveratrol. Antioxidantes. 14 ABSTRACT Andrade MM. Immunomodulatory effect of resveratrol on oxidative stress and formation of neutrophil extracellular traps in SARS-CoV-2 infection [dissertation]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2022. The infection caused by the coronavirus type 2 (SARS-COV-2),started in late 2019 in Wuhan, China and in a few months spread to several countries, becoming a pandemic. In Brazil, the first case occurred at the end of February 2020, and in nine months it infected more than 5.5 million people and totaled more than 160 thousand deaths. The virus infection can progress asymptomatically to severe symptoms, such as severe acute respiratory syndrome. The laboratory features described in patients with Covid-19 are the presence of neutrophilia and lymphopenia, lymphocyte exhaustion and increased levels of pro-inflammatory cytokines. The damage caused by neutrophilia has been investigated in Covid-19, however, observations on how to attenuate neutrophil-mediated oxidative stress are lacking. In this study, the proposal was to evaluate neutrophils and their functional capacity in patients with moderate, severe and critical Covid-19, hospitalized at HC-FMUSP, and the antioxidant capacity of Resveratrol. 190 patients with Covid-19 were included, 108 with moderate symptoms, 21 severe and 61 critical, during the period from May 2020 to October 2021. Regarding neutrophils, in addition to neutrophilia, an increase in neutrophils with characteristics immature cells characterized by the absence of CD10 marker expression. This immature characteristic was verified in prevalence in patients with severe and critical symptoms. In the functional analysis, a higher oxidative capacity of neutrophils in moderate patients compared to healthy individuals was verified, but reduced according to the severity of the disease. In the TSNE evaluation, we identified a cluster in the population of neutrophils only in patients with Covid-19 and absent in individuals in the control group. Resveratrol-mediated antioxidant action was evidenced by the decrease in the oxidative response of neutrophils, the formation of Neutrophil Extracellular Traps (NETs) and the levels of cell-free DNA in the culture with neutrophils. Taken together, the data show that despite the neutrophilia and the oxidative potential in SARS-Cov-2 infection, there is a reduction in the oxidative index, due to the probable presence of immature neutrophils. Resveratrol's antioxidant action suggests that it is a potential candidate to attenuate the harmful effects of neutrophils in respiratory viral infections such as Covid-19 infection. Keywords: SARS-CoV-2. Covid-19. Neutrophils. Extracellular traps. Resveratrol. Antioxidants. 15 1. Introdução 1.1. Infecção por Sars-Cov-2 A doença causada pela infecção pelo coronavírus que causa a síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2), conhecida como doença do coronavírus 2019 ou Covid-19, foi declarada uma pandemia global pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em Março de 2020 (1). Os primeiros casos da infecção surgiram em Wuhan na China, no final de 2019 (2,3). Em setembro de 2022, mais de 500 milhões de pessoas foram infectadas no mundo, e aproximadamente 6.300 foram a óbito. No Brasil, no mesmo período, o número de casos confirmados atingiu mais de 34 milhões de pessoas, com cerca de 680 mil mortos (2). Os coronavírus (CoVs) são grandes vírus envelopados (120 a 160 nm) constituídos por uma única fita de RNA de sentido positivo (+ ssRNA), não segmentado, que abrange aproximadamente 30 kilobases. O envelope viral possui projeções conhecidas como spikes (espículas). Os CoVs contêm quatro proteínas estruturais principais, denominadas proteínas spike (S), do envelope (E), de matriz (M) e do nucleocapsídeo (N) conforme ilustrado na figura 1 (3). A ligação inicial do vírus com a célula hospedeira ocorre por meio da interação da proteína S do SARS-CoV-2 com a enzima de conversão da angiotensina 2 (ACE2) da célula hospedeira (4). Além disso, para acessar o citosol, as partículas virais utilizam a serina- protease TMPRSS2 da célula para que ocorra a clivagem da proteína S e fusão das membranas virais e celulares. Em seguida, ocorre a liberação do genoma viral no citoplasma, onde se inicia a transcrição, tradução e síntese do RNA genômico e das proteínas (4) estruturais S, E e M, que são inseridas no retículo endoplasmático (ER). No compartimento intermediário, entre o ER e o complexo de Golgi, o genoma viral é encapsulado pela proteína N formando a partícula madura (5). A proteína M direciona a maioria das interações proteína-proteína necessárias para a montagem do CoV, mas para a formação do envelope é preciso a co-expressão das proteínas M e E. É nesta etapa que a proteína S é incorporada ao vírion. Após a montagem, as partículas são transportadas para a superfície celular em vesículas e liberadas por exocitose. Em vários CoVs a proteína S transita para a superfície celular onde medeia a fusão entre as células infectadas e as células adjacentes, não infectadas. Isso pode levar à formação de células gigantes multinucleadas, permitindo a disseminação de partículas virais sem que ocorra a detecção ou neutralização dos vírus por anticorpos específicos (6–8). 16 Figura 1. Estrutura do SARS-CoV-2. Demonstração ilustrativa do SARS-CoV-2 apresentando as principais proteínas que compõem sua estrutura, glicoproteína spike (S), proteína do envelope (E), de matriz (M), do nucleocapsídeo (N) e o genoma viral (ssRNA+), a figura demonstra o mecanismo de ligação do vírus por meio da proteína S com o ACE2 e a TMPRSS2 presente na célula do hospedeiro. Desde o início da pandemia especulava-se sobre as variantes do SARS-CoV-2, variantes que tiveram origem em países como Reino Unido, África do Sul e Brasil (Figura 2). A ocorrência de mutações em vírus é conhecida, e a prevalência de vírus de RNA, como é o caso dos coronavírus, se faz ainda mais prevalente. A primeira variante surgiu no Reino Unido em setembro de 2020, conhecida como B.1.1.7 (alfa), nela foram observadas 23 mutações, esta foi classificada como Variante de Preocupação (VOC, do inglês Variant of Concern) devido seu alto poder de transmissão. A variante B.1.351 (beta) surgiu em outubro de 2020 na África do Sul, nela foram observadas 21 mutações. Já em dezembro de 2020, surgiu a variante P.1 (gamma) no Brasil e em janeiro de 2021 nos Estados Unidos (9). Em outubro de 2020, foi identificado na Índia a variante B.1.617.2 (delta) classificada como VOC que se espalhou por cerca de 200 países, e gerou alerta para a OMS devido à possibilidade de escape imune ocasionado por essa cepa. Alguns estudos relacionaram a variante Delta como resistente a prevenção e tratamentos atuais, com baixa capacidade neutralizante de plasma convalescentes (10). No início de novembro de 2021, foi identificado uma nova variante denominada B.1.1.529 (ômicron) em Botsuana na África Austral (11). No final de novembro de 2021 foi classificada pela OMS como uma VOC, em poucos meses subvariantes da ômicron BA.1, BA.2 e BA.3 levando a surtos em diversos territórios. Em Abril de 2022 foram 17 identificados mais duas subvariantes BA.4 e BA.5, que possuem transmissão rápida, porém causando menos hospitalizações e mortes quando comparadas as outras subvariantes da ômicron. Essas duas subvariantes apresentam mutações (L452R e F486V) que podem contornar reações imunes e aumentar a capacidade de se ligar a célula hospedeira (12). Figura 2. Distribuição das principais variantes da SARS-CoV-2. Demonstração das principais variantes distribuídas no globo terrestre, cada círculo apresenta o nome da variante, o local de origem e a data da identificação. A diminuição no número de mortes e internações foi causa principal da implementação dos protocolos de vacinação. No Brasil, a vacinação contra a Covid-19 teve início na cidade de São Paulo no mês de janeiro de 2021. A campanha de vacinação iniciou priorizando profissionais da saúde e idosos, sendo disponibilizados a vacina de vírus inativado CoronaVac (Sinovac/Butantan) e a seguir com a vacina de adenovírus (ChAdOx1)da Oxford/AstraZeneca – FioCruz-RJ (13). Após um ano de vacinação aproximadamente 56% da população global havia recebido ao menos uma dose, cerca de 45% receberam duas doses e 4,3% receberam a dose reforço (14). Até o início de setembro de 2022, mais de 470 milhões de doses de vacinas foram aplicadas no Brasil, cerca de 164 milhões de pessoas tiveram a vacinação completa, incluindo a dose de reforço (1). 18 Em particular na infecção por SARS-CoV-2, o final do ciclo replicativo viral pode levar à lesão e/ou morte celular principalmente por piroptose (15). Neste tipo de morte inflamatória é observada uma importante resposta imune com a produção de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias que irão atrair principalmente monócitos e linfócitos T para os pulmões (15,16). O principal receptor ao SARS-CoV-2 na célula é o ACE2, presente em diversos tecidos no corpo-humano, porém alguns tecidos como o intestino delgado, testículos, rins, coração, tireoide e tecido adiposo são detectados em alta expressão (17). A infecção pode evoluir de maneira assintomática ou induzir sintomas brandos como febre, tosse e astenia; moderados, como dispneia e pneumonia; ou grave, como septicemia, coagulação intravascular disseminada e a Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS), necessitando de internação (18). Esses pacientes sofrem de inflamação pulmonar com a formação de microtrombos e necessitam de suporte respiratório invasivo (19). Idosos e indivíduos portadores de comorbidades como doenças cardiovasculares, diabetes mellitus, doenças imunossupressoras, doenças do sistema respiratório e renais, obesidade foram as comorbidades mais suscetíveis às complicações da Covid-19 no início da pandemia (20–22). No entanto após a vacinação observou-se que o índice de complicações mesmo nos indivíduos com comorbidades diminuiu significativamente. Foi avaliado o impacto após o primeiro ano de vacinação e estimou-se uma diminuição da metade do número de potenciais mortes devido às complicações da Covid-19(14). Em alguns indivíduos, no entanto, as células recrutadas não são capazes de eliminar a infecção, mas induzem uma resposta imune disfuncional conhecida como “tempestade de citocinas” (do inglês cytokine storm), responsável por mediar uma inflamação pulmonar generalizada. Neste cenário, é observada uma extensa produção das citocinas IL-2, IL-4, IL-6 IL-7, IL-10, TNF-α e G-CSF, além das quimiocinas CXCL10, CCL2 e CCL3 (2,17,24). Essa “tempestade de citocinas” tem sido observada principalmente em pacientes com quadros graves da infecção por SARS-CoV-2, nos quais a inflamação local pode se propagar através da circulação sistêmica e causar choque séptico e falência de múltiplos órgãos, gerando o óbito do paciente (23). Os sintomas e sinais clínicos de SARS são caracterizadas por hipoxemia, infiltrados pulmonares bilaterais difusos e edema pulmonar extenso. Estudos de eventos histológicos de SARS mostraram que o edema é induzido por aumento da permeabilidade vascular, seguido por presença de fluido rico em proteínas no espaço alveolar e acúmulo de células imunes ativadas. Os danos alveolares e células imunes acumuladas levam ao comprometimento da 19 troca gasosa e manifestando insuficiência respiratória (24). Uma das características do infiltrado de células imunes, são os neutrófilos ativados (25). Os achados hematológicos em pacientes com Covid-19 é a diminuição no número de linfócitos totais (linfopenia), diminuição no número de monócitos e aumento no número de neutrófilos (neutrofilia) (26). Em infecções graves, a neutrofilia pode ser decorrente da granulopoiese de emergência, fenômeno que ocorre quando a medula óssea para atender a demanda e combater ao patógeno, induz liberação de G-CSF e outras citocinas para controlar a produção de neutrófilos (27). Assim, ocorre o aumento de neutrófilos circulantes e pode acarretar em granulócitos imaturos em sangue periférico (28). Uma das principais características observadas em pacientes afetados pelo SARS-CoV-2 é a neutrofilia e a linfopenia gerando uma maior razão de neutrófilo/linfócito relacionado com a gravidade da doença (29). Os neutrófilos em infecções virais do trato respiratório inferior, podem agravar a inflamação pulmonar causada, como ocorre na infecção pelo vírus influenza, causando características citotóxicas durante pneumonias graves (30) O impacto da ativação de neutrófilos circulante aumentou o interesse em entender seu papel na infecção pelo SARS- CoV-2. Na Covid-19, é observada, a produção espontânea de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) no plasma, bem como o aumento da formação de NETs em microtrombos pulmonares de pacientes, achados associados à gravidade dos sintomas. Além disso foi observado a capacidade dos plasmas dos pacientes com Covid-19 induzirem a formação de NETs em neutrófilos de indivíduos saudáveis (31). 1.2. Neutrófilos Os neutrófilos são as primeiras células imunes recrutadas para o local da inflamação após a estimulação por fatores quimiotáticos liberados por tecidos pulmonares danificados. Os estímulos inflamatórios podem ser reconhecidos por receptores específicos dos neutrófilos, promovendo o recrutamento e ativação de neutrófilos circulantes. Estes neutrófilos ativados produzem vários produtos citotóxicos, incluindo ROS, enzimas granulares, NETs e diversas citocinas pró-inflamatórias (32). Os neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) representam de 60 a 70% dos leucócitos circulantes no sangue periférico de seres humanos (33). Estimava-se que os neutrófilos possuíam um curto tempo de vida, aproximadamente 8 horas na circulação, no entanto, os estudos atuais apontam que sob condições inflamatórias, e infecciosas a sobrevida na 20 circulação é prolongada para cerca de 4 dias, e que são caracterizadas pela presença de dois ou mais lóbulos e de grânulos citoplasmáticos (34,35). Os PMNs são caracterizados pela presença de dois ou mais lóbulos e de grânulos citoplasmáticos, sendo esses formados por quatro tipos de grânulos durante o processo de maturação, e são compostos por proteínas pró- inflamatórias. Os grânulos primários (grânulos azurofílicos) são compostos pela proteína mieloperoxidase (MPO) e a proteína de ligação de heparina (CAP37); os grânulos secundários (grânulos específicos) pela glicoproteína lactoferrina, catelicidina, lisozimas e colagenases; os grânulos terciários (gelatinosos) por metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9) (34) e os grânulos secretórios que possuem diversos receptores transmembranares como (receptores do fator de necrose tumoral (TNF) e receptores do interferon-α (IFN-α)), que de acordo com a exocitose se integram com a membrana de neutrófilos (36). Há dois subtipos neutrófilos, diferenciados por densidade, descritos como granulócitos de baixa densidade (LDGs) e granulócitos de densidade normal (NDGs). Os LDGs possuem densidade similar as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de menor densidade, e as NDGs de maior densidade. são co-purificadas com eritrócitos após a centrifugação. Outra diferença que pode distinguir os subtipos é o fenótipo, por expressar moléculas distintas (37,38). Os LDGs foram identificados inicialmente no lúpus eritrematoso sistêmico e febre reumática e também em outras condições patológicas como, malária, câncer, asma, gravidez e infecção por HIV (39). Os neutrófilos são caracterizados pela expressão fenotípica dos marcadores CD11b+, CD15+, CD16+, CD14-, CD33+/dim, CD66b+, LOX-1, sendo que alguns marcadores podem diferenciar as populações de NDGs e LDGs (35,38). Ainda, há um subtipo de células denominadas células supressoras de origem mieloide (MDSC), encontrado apenas em ambientes patológicos. As células são divididas em M-MDSC, as que apresentam características semelhantes a monócitos e G-MDSC, semelhante aos granulócitos. Estas células tem sido relacionada a diversascondições como na gravidez, na autoimunidade e em doenças infecciosas (40). A expressão do marcador LOX-1 (Receptor de lipoproteína de baixa densidade oxidada tipo Lectina), também conhecido como OLR-1, pode ser uma estratégia para diferenciação de G-MDSCs e neutrófilos, uma vez que os PMNs LOX-1+ possuem expressão gênica semelhante aos G-MDSCs, enquanto que os PMNs LOX-1- se assemelham aos neutrófilos de sangue periférico (41). Além disso, os PMNs LOX-1+ possuem semelhanças com as MDSCs granulocíticas na capacidade de supressão na resposta de células T, pela expressão de Arginase-1 (Arg-1) e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). A expressão de CD11b+ e CD16 é usada para determinar o estado de maturação de 21 neutrófilos, contudo, não são muito fidedignos, pois há alteração destes marcadores na ativação celular. Já a expressão de CD10, glicoproteína transmembrana de 100kDa, é expressa nos estágios mais maduros de neutrófilos (42). Desta forma, neutrófilos maduros são caracterizados como CD10+ e neutrófilos imaturos CD10- (27). Os neutrófilos imaturos mostram diminuição na produção de ROS em comparação a neutrófilos maduros (27,43), mas dependem do local e microambiente tecidual e do estímulo que as células foram expostas. A diminuição de formação de NETs e aumento de neutrófilos imaturos são descritos em pacientes com leucemia mieloide aguda (44). Essa limitação na produção de NETs por células imaturas pode ser em função da diferenciação dos grânulos ocorrer nos estágios mais imaturos como também a produção de ROS, já que ambas favorecem a realização de NETs. Os neutrófilos são as primeiras células a chegar no sítio infeccioso, após serem recrutados devido aos mecanismos de resposta à infecção se direcionam do vaso sanguíneo ao tecido em questão. Estudos destacam a capacidade de migração dos neutrófilos para os linfonodos, seja por vias linfáticas ou vênulas endoteliais altas para que ocorra a regulação da resposta imune (45). Entre os mecanismos de regulação mediado por neutrófilos, destaca-se a expressão de arginase, que converte L-arginina em ornitina e ureia, e a depleção da L- arginina, aminoácido necessário para ativação celular resulta em deficiente resposta de células T (37). O aumento da atividade da arginase é descrita em diversas infecções, incluindo o HIV, e associado com a diminuição da expressão de CD3ζ (zeta), em células T (46). Os PMNs também podem regular negativamente a atividade de células T pelas vias ROS e arginase, por depletar a L-arginina e consequente regulação negativa da cadeia ζ do TCR. Além disso, estas células promovem a produção de citocinas reguladoras e indução de células T reguladoras (35). Os neutrófilos se relacionam diretamente com outras células, incluindo outros leucócitos, e sintetizam uma grande variedade de citocinas. Assim, os neutrófilos auxiliam no desenvolvimento da imunidade adaptativa prolongando sua própria sobrevivência (47). Os neutrófilos desempenham papel fundamental na defesa contra patógenos invasores, utilizando mecanismos como a fagocitose, citotoxicidade dependente de anticorpo, degranulação, produção de ROS, MPO que por sua vez induz a liberação de peptídeos antimicrobianos e armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) (37,48). O papel crucial dos neutrófilos em liberar NETs contra diversos vírus são descritos: como para dengue (49), Sincicial Respiratório (RSV) (50), Influenza A (51), Chikungunya (52) e mais recentemente para Covid-19 (53). 22 1.3. Neutrófilos e SARS Os neutrófilos circulantes e em infiltrados pulmonares de pacientes com Covid-19 mostram níveis elevados de liberação de NETs que possuem efeito deletério em células pulmonares epiteliais e podem ser responsáveis pelo agravamento pulmonar da doença (53). Na infecção por SARS-CoV-2, foi demonstrado um dano excessivo de ROS às células, levando à produção de citocinas pró-inflamatórias (54). O aumento de ROS que intensifica a tempestade de citocina, coagulação, formação de trombos e hipóxia tecidual (54). A geração ROS em infecções virais induz um desequilíbrio de reações de oxidação-redução (redox) para sobrevivência e replicação viral no hospedeiro causando dano tecidual (55). Figura 3. Papel dos neutrófilos no alvéolo pulmonar, durante a infecção. A figura demonstra as diferenças entre um alvéolo saudável e um durante a infecção por SARS-CoV-2, onde é possível observar que há uma infiltração de células, descamação do epitélio brônquico, produção de ROS e migração de neutrófilos devido a ativação. Ainda não há tratamento específico para atenuar a neutrofilia na Covid-19, porém existem diversas linhas de pesquisas buscam alternativas para inibir a replicação do vírus, e na inibição de interleucinas. Há também proposição de que compostos que inibam a síntese de NETs possam ser estratégicas para amenizar os efeitos da doença durante a infecção (53). 1.4. O Resveratrol na Covid-19 A terapia com drogas antioxidantes pode ser uma estratégia promissora para aliviar complicações resultantes do desequilíbrio redox em pacientes afetados pelo SARS-CoV-2 ou outras infecções virais inflamatórias. 23 Nosso grupo abordou recentemente, a importância do flavonoide Naringenina como uma intervenção nutricional anti-inflamatória (56). Já evidenciado possuir efeito antiviral para SARS-Cov-1 e MERS-Cov (56). Outra proposta como potencial modulador da resposta à Covid 19 é o Resveratrol (RESV). RESV é um polifenol natural que vem de uvas vermelhas, cranberry, mirtilo, amendoim, soja e vinho tinto, com as uvas tendo o maior teor (57). O polifenol possui dentre suas funções o papel anti-inflamatório e efetivo papel antioxidante (58). Atua também como um papel antiviral importante e na modulação da resposta imune, inibindo a liberação de citocinas pró-inflamatórias e reduzindo a lesão pulmonar através da redução do estresse oxidativo. Os efeitos antivirais do resveratrol têm sido observados pela inibição in vitro de HCoV-229E e SARS-CoV-2 em células MRC5 (59,60), vírus da gripe (61), hepatite C (62), varíola (63) e HIV-1 (64). A eficácia do RESV foi observada em inibir a infecção in vitro por MERS-Cov, promovendo a sobrevivência celular mesmo após a infecção (65). O RESV foi proposto como um promissor composto antiviral in vitro contra a SARS-Cov-2 em células Vero (66). Contudo, o efeito antioxidante não foi explorado nos neutrófilos. A Sirtuína-1 (SIRT-1) é uma NAD+ pertence a família de histonas desacetilases dependente e apresenta-se como regulador fundamental em diversos processos fisiológicos, como na apoptose, no metabolismo, envelhecimento e respostas imunes (67). O RESV ativa a sinalização SIRT1, possivelmente responsável por inibir a replicação viral. SIRT1 inibe a ativação da enzima ADAM17 (um domínio de desintegrina e metaloprotease 17) a inibição de ADAM17 promove a inibição de TNF-α e IL-6, levando a um efeito anti-inflamatória (57). O efeito antioxidante do RESV se deve a capacidade de restauração do equilíbrio entre ROS e antioxidantes (Figura 4), levando a neutralização do dano tecidual ocasionado pelo estresse oxidativo (68,69)No contexto da Covid-19 ainda, o RESV pode ser um aliado para evitar a formação de trombos, uma vez que o RESV possui a capacidade de inibir o fluxo de Ca2+ (70), impedindo a entrada de Ca2+ em plaquetas, evitando a agregação e formação de trombos (71). 24 Figura 4. Desbalanço oxidativo. A) apresenta o vaso sanguíneo de indivíduos sem risco, onde o excesso de espécies reativas de oxigênio (ROS), que é equilibrado pelo aumento de antioxidantes. B) apresenta o vaso sanguíneo de indivíduos com equilíbrio redox prejudicado, onde a produção de ROS não consegue ser controlada adequadamente, causando o dano a hemácias, devido a peroxidação da membrana, que contribui para a ativação de neutrófilos. A suplementação comantioxidantes e/ou inibidores de elastase podem ser estratégias de tratamento terapêutico. A fisiopatologia do Covid-19 grave é marcada pela abundância e funcionalidade de neutrófilos alterados. Analisar o efeito do RESV em neutrófilos de pacientes com Covid-19 tornou-se crucial para entender seu papel nessa patogênese. 25 2. Objetivos Avaliar o perfil fenotípico e funcional de neutrófilos de pacientes com quadro moderado, grave e crítico de Covid-19, e o efeito modulatório do composto antioxidante Resveratrol. Específicos: • Correlacionar os dados clínicos, achados laboratoriais e resultados da pesquisa básica; • Analisar o perfil fenotípico e maturidade de neutrófilos circulantes; • Analise funcional de neutrófilos através da formação de NETs e burst oxidativo, após a estimulação com PMA; • Avaliar a modulação do antioxidante Resveratrol na resposta funcional de neutrófilos. 26 3. Materiais e métodos 3.1. Casuística e seleção de amostras Para realização deste estudo foram utilizadas amostras de sangue de pacientes com diagnóstico de Covid-19, que se encontravam internados nos leitos do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP). As amostras coletadas em tubos com EDTA foram procedentes da Divisão de Laboratório Central (DLC) do HC-FMUSP. As amostras de hemograma foram mantidas a 4ºC e utilizadas no dia seguinte para as análises fenotípicas por citometria de fluxo. As amostras em tubo heparina foram coletadas dos pacientes que autorizaram participar do estudo e foram utilizadas para análises funcionais no mesmo dia da coleta. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do HC-FMUSP (CAAE 30800520.7.0000.0068-2020) Como critérios de inclusão foi necessária a confirmação do diagnóstico de Covid-19 pela detecção do RNA SARS-COV-2 por reação em cadeia de polimerase transcriptase reversa (RT-PCR). Foram exclusos pacientes com idade superior a 75 anos e que não possuíam resultados positivos para o SARS-COV-2. Para definição dos grupos de acordo com os sintomas, foi considerado a classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS) de 2019, onde os pacientes com sintomas não- graves, sem oxigenoterapia ou sob oxigênio por máscara ou cânula nasal (CN O2), pacientes com sintomas graves hospitalizados sob ventilação não invasiva (VNI) ou oxigênio de alto fluxo (CNAF), e sintomas críticos os pacientes submetidos a ventilação mecânica invasiva (VMI) com ou sem suporte de outro órgão de leitos de enfermaria, os pacientes estavam em leitos de enfermaria e Unidade de Terapia Intensiva (UTI) do HC-FMUSP. No período de maio de 2020 a outubro de 2021, foram selecionados 190 pacientes, dos quais 108 apresentavam sintomas não-graves, 21 sintomas graves e 61 sintomas críticos. Para o grupo controle foram admitidos 46 indivíduos saudáveis, sem sintomas para SARS-COV-2 e que não tinham recebido vacina para Covid-19. Foram armazenados materiais para análise de anticorpos anti-IgG CoV-2, no dia do experimento e após 15 dias para verificação de possível infecção no momento da coleta. 27 3.2. Delineamento Experimental Figura 5. Delineamento experimental. Esquema do fluxo de elaboração e realização do projeto de pesquisa. 3.3. Análise fenotípica de PMNs em sangue periférico por citometria de fluxo: Para realizar a caracterização fenotípica, 100 µL de sangue coletado em tubo EDTA foi incubado com anticorpos de superfície descritos na Tabela 1, e foram incubados por 20 minutos à temperatura ambiente. Após, as hemácias foram lisadas com o reagente FACS Lysing (BD Biosciences, Califórnia, USA) por 15 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, as células foram lavadas e adquiridas em citômetro de fluxo LSR Fortessa (BD Biosciences). Foram avaliados em cada tubo aproximadamente 100.000 eventos. Foi utilizado a estratégia de marcação de Fluorescência menos um (FMO) que se refere a marcação da amostra com todos os anticorpos (Ac) menos o Ac que se quer analisar. A estratégia de análise para caracterização fenotípica de PMNs (Figura 7). Realizamos a análise no software FlowJo por incorporação de vizinhos estocásticos com distribuição t (TSNE), onde usamos um algoritmo para agrupamento com base nas células CD66b+. O algoritmo permite visualizar conjuntos de dados de citometria de fluxo de alta dimensão em um espaço de dados dimensional reduzido. Para identificar e caracterizar aglomerados, empregamos o mapa de fluxo auto-organizado (FlowSom), definindo o número de meta-clusters como 8. 28 Tabela 1 - Anticorpos para marcação de superfície Anticorpo Fluorocromo Clone Fabricante CD66b V450 G10F5 BD Biosciences CD15 APC HI98 BD Biosciences CD16 APC-Cy7 3G8 BD Biosciences CD11b PE MEM-174 Exbio CD14 FITC M5E2 BD Biosciences CD10 PE-Cy7 MEM-78 Exbio Live/Dead Texas Red - Invitrogen Figura 6. Estratégia da imunofenotipagem de neutrófilos no sangue periférico. Para isso foi avaliado o Time, para remover interferências de possíveis oscilações do laser, em seguida foram selecionados os singlets para SSC e FSC, em seguida por FSC e SSC selecionamos a população de granulócitos. Após a seleção das células vivas (live dead), foi selecionada a população CD66b, que inclui células granulocíticas. A partir desse gate, avaliamos a expressão dos marcadores CD33, CD14, CD11b, CD10, CD15 e CD16 em indivíduos saudáveis e pacientes com sintomas leves, graves e críticos. 3.4. Avaliação do Burst oxidativo de neutrófilos por ensaio de DHR: Para avaliação do burst oxidativo de neutrófilos, foi realizado o teste de ativação dos neutrófilos através da dihidrorodamina (DHR) 123 (Sigma Aldrich, Darmestádio, Alemanha). Para tal, 500µL de sangue periférico em EDTA foi utilizado. As hemácias foram inicialmente lisadas com solução de lise (NH4Cl/NaHCO3/EDTA, in house) por 10 minutos sob homogeneização constante, após foram lavadas 3 vezes com tampão salina tamponada (PBS)/0,5% soro albumina bovina (Sigma-Aldrich, Darmestádio, Alemanha)/0,2% azída sódica (Merck), o sobrenadante foi desprezado e as células foram ressuspendidas em 600 µL de PBS/SAB/azída. Em seguida, foram preparados em tubo de citometria as seguintes condições: Não marcado, basal, estimulado com 50 nM de acetato miristato de forbol (PMA, Sigma Aldrich, Darmestádio, Alemanha). Em cada tubo 100 µL de suspensão de células foram adicionadas em 1000 µL da solução de PBS/SAB/azída. As células foram incubadas na presença de 5 pM de DHR 123 por 5 minutos em estufa à 37 ºC e 5% de CO2, com exceção do tubo não marcado. Após, foi adicionado 50 nM de PMA no tubo da condição estimulada e 29 incubados à 37 ºC e 5% de CO2 por 15 minutos. Após incubação, os tubos foram centrifugados e sobrenadante descartado. Foi realizada a marcação com os anticorpos CD15 e CD10 por 20 minutos à temperatura ambiente. As especificações dos anticorpos estão especificadas na Tabela 2. Em seguida as células foram lavadas e após ressuspendidas em Formol 4% diluído em PBS/SAB/azída para leitura no citômetro de fluxo LSR Fortessa (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA). Foram adquiridos aproximadamente 500.000 eventos, e utilizado para análise o software FlowJo™. A estratégia de análise utilizada para análise encontra-se na Figura 8. Tabela 2 – Anticorpos utilizados no ensaio de DHR Anticorpo Fluorocromo Clone Fabricante CD15 APC HI98 BD Biosciences CD10 APC-cy7 MEM-78 Exbio DHR 123 - - Sigma Aldrich Figura 7. Estratégia de análise Dihidrorodamina (DHR). Inicialmente foi selecionado os singlets para FSC e SSC, após selecionado a população de granulócitos e então analisado a expressão da molécula DHR. Em seguida foi selecionada a população de CD15+ para selecionar a população de neutrófilos e em seguida, foi avaliado a expressão de CD10+. Após foi analisado a expressão de DHR em neutrófilos CD10+ e emneutrófilos CD10-. 3.5. Análise do efeito do RESV no Burst oxidativo de neutrófilos por ensaio de DHR: Para avaliação da ação do RESV (Sigma) foi realizado a técnica de DHR 123. As células foram submetidas ao tratamento com o antioxidante nas concentrações de 25, 50 e 100 µM antes do estimulo com PMA. Seguindo o mesmo protocolo descrito acima, após adicionar 30 o DHR nas células ressuspendidas em PBS/BSA/azída, o antioxidante foi adicionado aos tubos em previamente concentrações estabelecidas e foram incubadas durante 5 minutos, em seguida foi realizado o estímulo com 50 nM de PMA por 15 minutos. Após incubação, os tubos foram centrifugados e sobrenadante descartado, e incubados com anticorpos CD10 e CD15 por 20 minutos. Após lavagens, foram ressuspendidas em Formol 4% diluído em PBS/BSA/azída para leitura. As células foram adquiridas em citômetro de fluxo LSR Fortessa (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA). Foram adquiridos aproximadamente 500.000 eventos, e utilizado para análise o software FlowJo™. 3.6. Isolamento de neutrófilos: O sangue periférico foi coletado em tubos com heparina sódica. A seguir o material foi diluído em Dextran 6% estéril em proporção volume-volume, a amostra foi incubada por 25 minutos em estufa a 37 ºC e 5% CO². A seguir o sobrenadante foi separado por gradiente de densidade Ficoll-Hypaque 1077, centrifugado a 2000 rpm por 20 minutos, as porções de plasma, PBMCs e Ficoll foram descartadas e o sedimento contendo PMNs e hemácias foi submetido a lise com ACK por 5 minutos e centrifugados. Os PMNs foram ressuspendidos em RPMI sem vermelho de fenol e a pureza avaliada por citometria de fluxo foi > 88%. 3.7. Cultura de neutrófilos e avaliação do efeito do RESV: Para avaliação dos neutrófilos, 200x103 células/poço foram distribuídas em placas de 24 poços (Corning-Costar) recobertas com lamínulas redondas de 13 mm. As células foram mantidas em meio de RPMI sem vermelho de fenol e tratadas com 100 µM de Resveratrol (Sigma Aldrich, por 30 minutos à 37 ºC e 5% de CO2 para sedimentação das células e estimuladas com 50 nM de PMA por 4 horas. Decorrido tempo de cultura foi retirado o sobrenadante para armazenamento e dosagem de proteínas e quantificação de NETs. Na placa foi adicionado solução de 4% de formol para fixação dos neutrófilos na lamínula para proceder a fluorescência. 3.8. Quantificação de citocinas por ELISA Sobrenadantes de cultura e plasma foram utilizados para determinação de citocinas utilizando kits de ELISA comerciais da empresa R&D Systems, para IL-6 (cat. DY406), IL-8 (cat. DY208), IL-10 (cat. DY217B), MMP-9 (cat. DY211), IFN-α (cat. 446404) e IFN-ƴ (cat. 430104), de acordo com a instrução do fabricante 31 3.9. Imunofluorescência para avaliação da formação de NETs: Os neutrófilos plaqueados em lamínulas redondas foram fixados em formol após o tempo de cultura e mantidos a 4ºC até o dia da marcação. Para marcação as lamínulas foram lavadas e incubadas com os anticorpos primários: anti-MPO de camundongo (2C7; Abcam; 1:500), anti-histona H3 de coelho (H3Cit; Abcam;1:250), anti-elastase de coelho (NE; Abcam; 1:1000) e anti-PAD4 de camundongo (OTI4H5; Abcam; 1:200). Posteriormente, as amostras foram lavadas em PBS e incubadas com os anticorpos secundários: cabra anti- coelho IgG Alexa 568 (Abcam, 1:200) ou cabra anti-camundongo IgG Alexa 488 (Abcam, 1:500). Os núcleos foram corados com Hoehcst 33342 (Abcam; 1:500), por 5 minutos. As lamínulas foram montadas em lâminas para leitura em microscopia de fluorescência. As NETs foram identificadas como a área de co-localização de ambos os anticorpos (Hoechst, MPO e H3Cit) e para avaliação da ativação dos neutrófilos avaliamos a expressão dos marcadores (Hoechst, NE e PAD4). Para análise foi usando o software Fiji/ImageJ. 3.10. Quantificação de NETs por dosagem de DNA livre das células: Para quantificação dos níveis de DNA livre em sobrenadantes e plasma de indivíduos controles e pacientes foi realizado a técnica Quant-iT PicoGreen kit (Invitrogen; cat. P11496), conforme descrito (Colón et al., 2019; Czaikoski et al., 2016). 3.11. Análise Estatística Para realização da análise estatística e representação gráfica dos dados foi utilizado o programa Graph Pad Prism 8 (Graph Pad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Os resultados foram expressos em mediana e intervalo interquartil (IQR), a análise de variância foi feita pelo teste ANOVA One-way, através do teste não paramétrico de Kruskall-Wallis para comparar os três grupos de dados. Para análises comparativas entre dois grupos foi utilizado o teste de Mann-Whitney e as análises de correlação foi utilizado o teste de Pearson. O nível de significância foi considerado qual o valor de p foi menor ou igual a 0,05. 32 4. Resultados 4.1. Características clínicas dos pacientes com SARS-CoV-2: Foram avaliados 190 pacientes com diagnóstico de Covid-19, confirmado pela técnica de RT-PCR, que estavam internados nas unidades de enfermaria e unidade intensiva (UTI), do HC-FMUSP entre os meses de maio de 2020 a outubro de 2021. O grupo foi composto por 190 pacientes, sendo 108 com quadro moderado (não-grave), 21 com quadro de sintomas graves e 61 com sintomas críticos. Como controles não infectados foram recrutados 46 indivíduos de ambos os sexos com idade pareadas, e sorologia negativa para IgG anti-SARS- CoV-2. A Tabela 3 ilustra os dados demográficos dos grupos analisados. Tabela 3. Dados demográficos Controles Moderado Graves Críticos n= 46 n= 108 n= 21 n= 61 Média DP Média DP Média DP Média DP Gênero: Masculino/Feminino 16/30 65/43 14/7 37/24 Idade – Homens 47 12,1 54 13,2 51 12,5 56 10,6 Idade – Mulheres 39 11,5 54 14,7 56 11,8 54 16,2 Evolução n % n % n % Alta 92 85,2 18 85,7 29 47,5 Óbito 6 5,6 2 9,5 28 45,9 Transf. para outro instituto 10 9,3 1 4,8 4 6,6 Comorbidades n % n % n % HAS 56 51,9 11 52,4 33 54,1 DM 45 41,7 8 38,1 19 31,1 Neoplasias 22 20,4 2 9,5 4 6,6 Doenças vasculares 10 9,3 1 4,8 7 11,5 Obesidade 24 22,2 6 28,6 18 29,5 33 Uso de álcool / cigarros 32 29,6 5 23,8 11 18,0 Transplantes 10 9,3 0 0,0 4 6,6 Doenças renais 15 13,9 0 0,0 4 6,6 Doenças hepáticas / gastrointestinais 7 6,5 1 4,8 4 6,6 Doenças cardíacas 28 25,9 4 19,0 8 13,1 Doenças neurológicas 9 8,3 0 0,0 4 6,6 Doenças respiratórias 15 13,9 0 0,0 6 9,8 Doenças metabólicas / autoimunes 34 31,5 5 23,8 15 24,6 Outras doenças infecciosas 9 8,3 0 0,0 2 3,3 Outras doenças 10 9,3 3 14,3 9 14,8 Sem comorbidades 5 4,6 4 19,0 7 11,5 1 16 14,8 4 19,0 11 18,0 2 21 19,4 4 19,0 20 32,8 3 25 23,1 4 19,0 9 14,8 ≥4 41 38,0 5 23,8 14 23,0 Histórico hospitalar Média DP Média DP Média DP Dias de sintomas até a coleta 23,4 20,7 14,7 5,0 18,7 9,4 Teste positivo para Covid-19 até a coleta 15,8 19,7 7,5 4,4 10,2 8,8 Dias de hospitalização até a coleta 16,3 20,0 5,3 2,8 9,5 8,8 Dias da coleta até a alta 11,3 16,9 15,0 10,0 27,4 25,4 Dias de hospitalização 27,6 27,8 20,3 10,8 36,9 26,5 Tabela 3: Dados demográficos da coorte de pacientes com Covid-19 e controles usados no estudo. Dados sobre idade, evolução e comorbidades de indivíduos controle e pacientes com Covid-19 classificados como moderados, graves e críticos. M – Masculino; F – Feminino; SC – Controle saudável, N – Número da amostra, HAS – Hipertensão Arterial Sistêmica, DM- diabetes mellitus. A Figura 8 mostra as características clínicas dos pacientes deste estudo. Em relação ao sexo dos pacientes (Figura 8A), o masculino foi de maior prevalência em ambos os grupos com aproximadamente 60% em cada grupo. Considerando a evolução dos pacientes, na figura 34 8B observamos que 85,0% dos pacientes com quadro moderado tiveram alta, 6,0% foram transferidos para outrosinstitutos do complexo HC e 9,0% foram a óbito. A prevalência de alta dos pacientes com quadro grave foi de 85,0% e a de óbitos 5,0%, ainda 10,0% dos pacientes foram encaminhados para outro instituto. Em relação aos pacientes com sintomas críticos 48% tiveram alta, 45,0% foram encaminhados a outros institutos do CN e 7,0% foram a óbito. Desta forma, observamos no grupo de pacientes que fizeram parte do estudo do HC- FMUSP, a prevalência era do sexo masculino, e que os pacientes críticos tiveram frequência de óbito similar aos demais grupos. Esses pacientes foram encaminhados a outros departamentos do hospital para realização de outros procedimentos ou acompanhamento após recuperação da Covid-19. A Figura 8C mostra os dias de evolução dos pacientes em relação a data de coleta do material que utilizamos. Assim, observamos que os pacientes com quadro moderado estavam com aproximadamente 20 dias de sintomas, o grupo grave estavam com média de 15 dias e os críticos com 18 dias de sintomas. Em relação aos dias de teste positivo (RT-PCR) notamos que os pacientes do grupo moderado estavam com média 15 dias de teste positivo, enquanto os grupos de pacientes graves e críticos tinham aproximadamente 8 e 10 dias, respectivamente, de positividade para o vírus. Em relação aos dias de internação dos pacientes observou-se que os pacientes moderados estavam aproximadamente 16 dias internados, e os pacientes graves e críticos com 5 e 10 dias de internação, respectivamente. Quanto a evolução dos pacientes do dia da coleta até o desfecho, notamos que os pacientes críticos tiveram uma internação prolongada com média de 27 dias, sendo que os pacientes moderados e graves ficaram 11 e 15 dias, respectivamente. Moderado Grave Crítico 0 50 100 Sexo F re q u ê n c ia ( % ) Homens Mulheres Moderado Grave Crítico 0 50 100 Evolução F re q u ê n c ia ( % ) Alta Transferência Óbito A B Si nt om as Te st e de C ov id p os iti vo In te rn aç ão A té a a lta /ó bi to To ta l d a in te rn aç ão 0 20 40 60 80 Dias de evolução D ia s ( m é d ia ) Moderado Grave Crítico C Figura 8. Características clínicas dos pacientes Covid-19+. Os gráficos mostram as características clínicas dos pacientes pertencentes ao estudo. A) Frequência do sexo entre os grupos. B) Evolução dos pacientes demonstrado em frequência. C) Evolução em dias durante internação, em relação a data da coleta. 35 Na figura 9 analisamos as comorbidades observadas pelos grupos de pacientes. Verificamos que a hipertensão arterial sistêmica (HAS) foi a comorbidade mais prevalente em todos os grupos de paciente, seguido da diabetes mellitus (DM). O quadro de obesidade nos quadros grave e crítico representavam uma incidência de 29 e 30 pacientes respectivamente, enquanto que no grupo moderado encontramos 24 pacientes, com classificação de obesidade pela equipe médica. 56 45 22 24 34 28 32 15 15 9 7 10 10 9 10 5 4 113 5 4 5 6 8 1 1 2 33 19 18 15 9 11 8 7 6 72 4 4 4 Moderado Grave Crítico HAS DM Neoplasias Doenças vasculares Obesidade Uso de tabáco/álcool Transplantes Dist. Renais Dist. Gastrointestinais/Hepáticos Dist. Cardíacos Dist. Neurológico Dist. Respiratórios Dist. Metabólicos/autoimunes Outras doenças infecciosas Outras doenças Sem comorbidades Figura 9. Comorbidades dos pacientes com Covid-19. Gráfico demonstra o número de pacientes com histórico ou presença de cada comorbidade nos grupos de pacientes acometidos pela doença, considerando o número de indivíduos de cada grupo: 108 moderados; 21 graves e 61 críticos. No grupo grave, 5 grupos de comorbidades não estavam presentes no grupo de indivíduos, são elas: transplantes, distúrbios renais, neurológicos, respiratórios e outras doenças infecciosas. De maneira geral, as comorbidades foram similares entre os grupos moderados, graves e críticos, sendo mais prevalente a hipertensão arterial sistêmica e diabetes mellitus. Com isso podemos afirmar que a presença de comorbidades é um fator importante para a necessidade de atenção hospitalar de indivíduo com infecção aguda, na ausência de vacinas. 36 4.2. Dados de exames laboratoriais de pacientes Covid-19 Os dados laboratoriais procedentes do DLC-HCFMUSP, como hemograma, comportam 108 pacientes moderados, 21 pacientes graves e 61 pacientes críticos. A Figura 10 mostra as informações obtidas com os dados de hemograma. Na Figura 10A observamos que que os pacientes possuíam um número de leucócitos totais superior (leucocitose), que aumentava de acordo com a gravidade quando comparados com a referência de valores de indivíduos controles. A leucocitose, é decorrente da neutrofilia, onde é foi maior em indivíduos críticos (Figura 10B). Houve também aumento na frequência de granulócitos imaturos, relacionado a gravidade dos sintomas (Figura 10C) e linfopenia entre os pacientes, maior no grupo de indivíduos graves (Figura 10D). Já o número de monócitos, houve um aumento significante somente entre o grupo moderado e controles (Figura 10E). A análise da relação neutrófilos/linfócitos (RNL), Figura 10F, mostra aumento da relação de acordo com a gravidade dos pacientes e em relação os indivíduos do grupo controle. 0 10 20 30 40 50 L e u c ó c it o s t o ta is ( m il /m m ³) ✱✱ ✱✱✱✱ ✱✱✱✱ ✱✱✱✱ 0 10 20 30 40 G ra n u ló c it o s ( m il /m m ³) ✱✱ ✱✱✱✱ ✱✱✱✱ ✱✱✱✱ 0 5 10 15 G ra n u ló c it o s i m a tu ro s ( m il /m m ³) ✱✱✱✱ ✱✱✱✱ ✱✱ 0 5 10 15 L in fó c it o s ( m il /m m ³) ✱✱ ✱✱✱✱ ✱✱✱ 0 2 4 6 M o n ó c it o s ( m il /m m ³) ✱ 0 20 40 60 80 100 R N L ✱✱✱ ✱✱✱✱ ✱✱✱✱ ✱ ✱✱✱✱ Controle Moderado Grave Crítico A B C D E F Figura 10. Neutrofilia sanguínea com presença de neutrófilos imaturos com gravidade da infecção Covid- 19. Contagem sanguínea em (A) leucócito total, (B) granulócitos, (C) granulócitos imaturos, (D) linfócitos e (E) a razão neutrófilo-linfócito (NR) de pacientes com sintomas leves (n=110), graves (n=22) e críticos (n=60) e 37 controles saudáveis (n=29). As barras representam a faixa mediana e interquartil. *P≤0,05, **P≤0.01, ***P≤0.001 e ****P≤0.0001 4.3. Análise fenotípica de neutrófilos de pacientes Covid-19 A seguir, analisamos o fenótipo dos neutrófilos em sangue periférico por citometria de fluxo (Figura 11). A Figura 11 mostra a frequência de granulócitos CD66+ obtidos por análise no gráfico dos parâmetros de forward scatter (FSC) e side scatter (SSC), evidenciando um aumento na frequência nos pacientes graves, como já demonstrados no hemograma. A Figura 11B mostra a diminuição da frequência de células vivas que expressam os marcadores fenotípicos de neutrófilos circulantes (CD66b+ CD11b+ CD14- CD15+ e CD16+) nos pacientes do grupo de indivíduos graves/críticos, que pode indicar presença de outras populações de neutrófilos diferentemente ao grupo controle. A Figura 11C, mostra a mediana da intensidade de fluorescência (MFI) da expressão de maturidade de CD10. Observamos que pacientes com Covid-19 apesar de possuírem maior frequência de granulócitos, há diminuição da expressão de CD10. Este dado evidencia que os pacientes com quadro grave possuem aumento de granulócitos com perfil de células imaturas. Característica que também pode ser observada no anexo B, onde estão apresentados os valores do hemograma de cada paciente, é possível verificar a evidência de fases imaturas na diferenciação de neutrófilos nos pacientes procedentes com sintomas críticos. 0 5000 10000 15000 20000 25000 M F I C D 1 5 ( C D 6 6 b + C D 1 5 + ) 0 20000 40000 60000 80000 100000 M F I C D 1 6 ( C D 6 6 b + C D 1 6 + ) ✱✱ 0 1000 2000 3000 4000 5000 M F I C D 1 1 b ( C D 6 6 b + C D 1 1 b + ) 0 500 1000 1500 2000 M F I C D 3 3 ( C D 6 6 b + CD 3 3 + ) 0 5000 10000 15000 20000 M F I C D 1 4 ( C D 6 6 b + C D 1 4 + ) 0 5000 10000 15000 M F I C D 1 0 ( C D 6 6 b + C D 1 0 + ) ✱ ✱✱ Controle Moderado Grave/Crítico A B C D E F Figura 11. Perfil fenotípico de granulócitos de sangue periférico de pacientes com Covid-19. Mediana de Intensidade de fluorescência (MFI) de granulócitos CD66b+ por citometria de fluxo em controles saudáveis (CN, n=16), e pacientes infectados moderados (n=56), graves (n=5) e críticos (n=16) para os marcadores (A) CD15, (B) CD16, (C) CD11b (D) CD33, (E) CD14 e (F) CD10. As barras representam a mediana e intervalo interquartil. **P<0.01, ***P<0,001 e ****P<0.0001 ajustado para múltiplas comparações. 38 4.4. Análise tSNE dos subgrupos das populações de granulócitos A seguir avaliamos os subgrupos de neutrófilos, por tSNE, seguido do algoritmo FlowSOM, onde foram identificados 8 clusters, selecionados por SSC-FSC por citometria de fluxo. A Figura 12A mostra um perfil diferente de populações de granulócitos em pacientes com Covid-19 grave e controles saudáveis. Chama atenção, quando as populações de células são sobrepostas, que o cluster 4 desaparece nos indivíduos infectados. O cluster 4 representa a população de neutrófilos CD66+CD10+CD16lowCD15+, cujas células apresentam características de células não ativadas devido à baixa expressão de CD16 (Figura 12A-C). A Figura 12D mostra o mapa de calor (heatmap) dos subgrupos localizados nas populações de granulócitos. Podemos verificar alta variabilidade dos subconjuntos nos clusters. Além disso, é relevante a alta frequência dos clusters 7 e 8 nos pacientes e sua ausência nos controles. O heatmap permite observar a população CD66b+CD10lowCD16highCD15+, que possui granulócitos de baixa densidade (LDGs). Apresentamos na figura 13 os gráficos de tSNE agrupados de acordo com os marcadores nos grupos de pacientes e controles, observamos que os pacientes apresentam uma variedade de cluster superior quando comparado ao grupo controle, e que a expressão de CD16 é evidente nos clusters não presentes nos controles. Os achados da análise de tSNE evidenciam há um perfil diferente de neutrófilos nos pacientes sendo que há população que está ausente com a infecção por Covid-19. 39 A B C D Controle Covid-19 Figura 12. Subgrupos de neutrófilos distintos em pacientes com Covid-19 em t-SNE. (A) Representação de amostras de pacientes com Covid-19 e controle saudável por análise unificada em t-SNE, demonstrando diferença no agrupamento de populações de células vivas CD66b+. (B) Gráfico t-SNE com análise FlowSOM de 8 clusters. (C) Gráfico demonstrando o número de eventos de cada cluster. (D) Análise do heatmap do clusters demonstrando os marcadores celulares. 40 Figura 13. A análise de t-SNE mostra a expressão de marcadores e distribuição de populações de neutrófilos em indivíduos saudáveis (CN) e em pacientes com Covid-19 de acordo com a gravidade da doença. 41 4.5. Análise de citocinas plasmáticas em pacientes com Covid-19 Os níveis de IL-8, IL-10, IL-6, IFN tipo I (IFN-α) e tipo II (IFN-γ) e metaloproteinase- 9 (MMP-9) foram determinados nos soros de pacientes infectados e controles saudáveis (Figura 14A-F). Elevados níveis séricos de MMP-9 e IL-6 nos pacientes com Covid-19, independentemente da gravidade da doença, comparados com o grupo controle. Outras citocinas, como IL-8, IL-10 e IFN-γ, foram detectadas em níveis aumentados apenas em pacientes graves/críticos (Figura 14B, C, F). Esses são fatores pró-inflamatórios que podem contribuir para o status ativado de neutrófilos na infecção por Covid-19. 0 200 400 600 800 1000 M M P -9 ( n g /m L ) ✱✱ ✱✱✱✱ 0 50 100 150 200 250 IF N - ( p g /m L ) 0 20 40 60 IF N - ( p g /m L ) ✱✱ 0 25 50 50 100 150 200 250 IL -8 ( p g /m L ) ✱ ✱ 0 250 500 500 750 1000 1250 IL -6 ( p g /m L ) ✱ ✱✱✱✱ 0 100 200 300 400 IL -1 0 ( p g /m L ) ✱✱✱ Controle Moderado Grave/Crítico A B C D E F Figura 14. Aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias com a gravidade do Covid-19. A avaliação das citocinas no soro foi analisada por ELISA: (A) MMP-9 e (B) IL-8 foram avaliados no controle saudável (n= 17– 25) e pacientes com sintomas moderados (n= 32–36), Grave (n= 2–4), Crítico (n= 21-24) e (C) IL-10, (D) IL-6, (E) IFN-α e (F) IFN-γ foram avaliados em Controle (n= 7-8), Moderado (n= 7-8), Grave (n = 2) e Crítico (n= 7). Os círculos pretos são representados por graves e os vermelhos por pacientes críticos. Os dados mostram mediana e intervalo interquartil. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 e **** p ≤ 0,0001. 4.6. Análise oxidativa de neutrófilos em pacientes Covid-19 A capacidade oxidativa de neutrófilos foi avaliada pela técnica de dihidrorodamina 123 (DHR 123). A dihidrorodamina 123 na presença de espécies reativas de oxigênio é oxidada a R123 fluorescente dentro das células, e assim auxilia na medida da capacidade oxidativa de neutrófilos. Os resultados obtidos em pacientes com Covid-19 em comparação a indivíduos saudáveis estão mostrados na figura 16. 42 Através da técnica de DHR conseguimos avaliar dois parâmetros: o percentual oxidativo, que é obtido através da subtração do valor expresso do DHR em células estimuladas e as não estimuladas, e o índice oxidativo (ION), valor obtido através da relação entre as médias de intensidade de fluorescência das células estimuladas pela média das células não estimuladas, este valor indica a capacidade de oxidar a DHR. As figuras 15A e D mostram o índice oxidativo (ION) dos neutrófilos totais e percentual oxidativo de células CD15+. Observamos que em pacientes com quadros mais críticos há uma diminuição em relação aos pacientes com quadros moderados. Analisamos a seguir se a imaturidade poderia interferir no burst oxidativo dos neutrófilos. Assim, na figura 15B e 15E, avaliamos o ION e o percentual oxidativo em células CD15+CD10+, correspondentes a neutrófilos maduros, observamos um aumento em relação a pacientes moderados e graves/críticos em comparação ao grupo controle. Ambos o ION e o percentual não mostraram alterações oxidativas nas células CD15+CD10- nos grupos analisados. Os dados evidenciam que apesar da neutrofilia ser mais intensa com a gravidade, o percentual oxidativo dos neutrófilos é superior no grupo moderado, e que os neutrófilos maduros são responsáveis pelo burst oxidativo. 0 10 20 30 IO N ( C D 1 5 + ) ✱✱ 0 10 20 30 IO N ( C D 1 5 + C D 1 0 + ) ✱✱ 0 5 10 15 20 IO N ( C D 1 5 + C D 1 0 -) 0 50 100 % O x id a ti v o ( C D 1 5 + ) 0 50 100 % O x id a ti v o ( C D 1 5 + C D 1 0 + ) ✱✱✱ ✱✱ 0 50 100 % O x id a ti v o ( C D 1 5 + C D 1 0 -) Controle Moderado Grave/Crítico A B C D E F Figura 15. Neutrófilos CD15+CD10+ com aumento do burst respiratório na infecção leve por Covid-19. O ensaio de oxidação de DHR foi analisado em neutrófilos de pacientes com Covid-19 (moderado (n = 47), grave (n = 3) e crítico (n = 24)), comparado com indivíduos saudáveis (CN, n = 9) por fluxo citometria. (A-C) Índice dos dados do Índice de Burst Oxidativo (ION) (B) percentual oxidativo. Células CD15+CD10+ representam neutrófilos maduros e células CD15+CD10- que representam neutrófilos imaturos. Os dados mostram a mediana e o intervalo interquartil. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 e **** p ≤ 0,0001. 43 4.7. Análise de viabilidade de neutrófilos com RESV Para verificar se o resveratrol, e seu diluente a Acetona, não possuiriam efeitos nocivos para as células realizamos um teste de viabilidade celular, com a marcação live/dead por citometria de fluxo. A Figura 16 mostra que não há prejuízos na viabilidade de neutrófilos do grupo controles. 0 50 100 V ia b il id a d e c e lu la r (% )Basal Acetona PMA 50nM PMA + Resv 100 µM PMA + Resv 50 µM Figura 16. Análise da viabilidade de neutrófilos com Resveratrol. Realizado a técnica de DHR para analisar a viabilidade de neutrófilos com uso de live/dead, a frequência de células vivas na condição basal, após tratamento com o diluente do Resveratrol, a acetona, após estímulo com PMA e na presença do RESV em 50 e 100 µM. 4.8. Efeito modulatório do RESV na formação de NETs de neutrófilos O RESV possui ampla atividade antioxidante e atividades bioativas, que incluem funções anti-inflamatórias, anticancerígenas, cardioprotetoras, fitoestrógenos e neuro protetoras. Avaliamos a ação do RESV na formação de NET por neutrófilos de sangue periférico de pacientes com Covid-19 e de controles saudáveis. A Figura 17A mostra um painel de análise de imunofluorescência de NETs liberados por neutrófilos de controles saudáveis e pacientes com Covid-19. No nível basal, observamos uma presença pronunciada de MPO e H3Cit que enriqueceram a co-localização por neutrófilos de pacientes com Covid-19. A estimulação com PMA parece diminuir o número de células e a expressão de marcadores, mas o tratamento com RESV leva a um aumento no número de células e na viabilidade. 44 0 500 1000 D N A l iv re d e c é lu la s (n g /m L ) CN COVID-19 ✱✱✱✱ 0 200 400 600 D N A l iv re d e c é lu la s (n g /m L ) PMA PMA + Resveratrol Basal CN COVID-19 ✱ ✱✱ B C Figura 17. Modulação de formação de NETs pelo Resveratrol. (A) Análise de imunofluorescência representativa da liberação de NETs por neutrófilos isolados de controles saudáveis e paciente Covid-19, cultivados por 4 h a 37 ° C. As células foram coradas para núcleos (Hoechst 33342, azul), MPO (vermelho) e H3Cit (verde). Ampliação original 40x. (B) Determinação de DNA livre de células (cf-DNA) no plasma de indivíduos de controle (n = 15) e pacientes infectados com SARS-CoV-2 (Moderado = 13; Grave = 4, Crítico = 9) por Quant-iT PicoGreen. (C) DNA livre de células no sobrenadante da cultura de neutrófilos incubada com 100 µM de resveratrol 30 min e estimulada com PMA 4 h de indivíduos saudáveis (n=6) e infectados com SARS-CoV-2 (n=5). Os dados representam a mediana e o intervalo interquartil. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 e **** p ≤ 0,0001. 45 Em seguida, analisamos uma quantidade aumentada de DNA livre de células no plasma de pacientes com Covid-19 em comparação com CN (Figura 17B). Para verificar o efeito do RESV in vitro, avaliamos a liberação de DNA de neutrófilos após estimulação com PMA. A Figura 9C mostra que RESV reduziu as quantidades de DNA nos sobrenadantes de neutrófilos de pacientes com Covid-19, demonstrando que o efeito antioxidante do RESV minimiza a formação de NET. O fato da dosagem de PMA ter sido inferior ao nível basal se deve a maior adesão dessas células a lamínula e menor obtenção do sobrenadante, uma vez que os sobrenadantes foram obtidos do mesmo ensaio. Figura 18. Efeito modulador do RESV na ativação de neutrófilos. Estágio representativo da ativação de neutrófilos isolados de controles saudáveis e paciente grave de Covid-19, cultivados por 4 h a 37°C. As células foram coradas para núcleos (Hoechst 33342, azul), PAD4 (vermelho) e NE (verde) e analisadas por imunofluorescência Ampliação original 40x 46 4.9. Modulação de proteínas in vitro pela ação do Resveratrol Analisamos o efeito RESV in vitro na produção de citocinas. O efeito do RESV foi observado em indivíduos saudáveis, em que diminuía produção de MMP-9 e IL-8, mas não em IL-6, somente no grupo controle (Figura 19). 0 200 400 600 800 M M P -9 ( n g /m L ) Controle Covid-19 ✱✱ 0 200 400 600 800 1000 1200 IL -8 ( p g /m L ) Controle Covid-19 ✱ 0 50 100 150 200 250 IL -6 ( p g /m L ) Controle Covid-19 PMA PMA + Resveratrol A B C 0 1 2 3 4 5 IL -1 0 ( p g /m L ) Controle Covid-19 0 10 20 30 40 50 IF N -a ( p g /m L ) Controle Covid-19 D E Figura 19. O resveratrol diminui a produção de citocinas em neutrófilos ativados por PMA de controles. Neutrófilos (2×105 células/mL) foram estimulados com PMA, na presença ou não de resveratrol 100 µM, de controles saudáveis (n = 6-9) e pacientes graves com Covid-19 (n = 5-11). Sobrenadantes do as culturas foram determinadas para (A) MMP-9, (B) IL-8 e (C) IL-6 (D) IL-10 e (e) IFN-α por ELISA. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 47 5. Discussão Os neutrófilos são alvos na infecção por Covid-19, considerando a intenso aumento dos níveis absolutos, geralmente associada a linfopenia, o que reflete no aumento da razão neutrófilos/linfócitos. Além da neutrofilia, que se acentuou de acordo com a gravidade da doença, observamos presença da população imatura CD10- nos pacientes com sintomas graves. No parâmetro funcional dos neutrófilos, foi observado aumento no metabolismo oxidativo, e habilidade de NETose, processo de liberação de redes extracelulares (NETs). O burst respiratório e/ou das vias associadas dos neutrófilos foram negativamente modulados pelo agente antioxidante, resveratrol. Na coorte de pacientes infectados por SARS-Cov-2 do Hospital das Clinicas-FMUSP, realizamos a caracterização dos pacientes baseados nos sintomas moderado, grave e crítico, segundo a nomenclatura da OMS (2019). Na coorte do HC-FMUSP analisada, observamos propensão do sexo masculino na progressão da infecção por SARS-CoV-2, em relação às mulheres. Selecionamos pacientes até 75 anos, portanto, não podemos relacionar sobre a questão de envelhecimento. Quanto ao desfecho, foi observado entre os pacientes críticos 45,9% de óbitos, enquanto para os de moderados, a frequência de 5,6% óbitos, e 9,5% em pacientes graves. Na China, os homens e mulheres mostram a mesma prevalência de infecção por Covid-19, contudo, o risco e gravidade e morte é maior em homens, independentemente da idade(72). As comorbidades observadas mais frequentes foram sequencialmente, hipertensão arterial sistêmica, diabetes mellitus, obesidade, tabagismo e/ou etilismo, distúrbios metabólicos/autoimunes e distúrbios cardíacos similarmente nas condições clínicas, moderados, graves ou críticos. Um boletim epidemiológico dos 26 estados do Brasil e o Distrito Federal, mostra alta prevalência de comorbidades (83%) entre os pacientes que morreram de Covid-19 no Brasil, sendo a doença cardíaca a mais prevalente (73). Os autores evidenciaram doenças cardíacas (35,1%) seguida de diabetes (28,7%), e discutem que a maior prevalência de doenças cardíacas pode ser devido a efeito adverso de drogas, como a cloroquina. Quanto aos dados laboratoriais, em nossa coorte de pacientes com sintomatologia moderada ao Covid-19 já se detectava leucocitose, decorrente de neutrofilia, que se acentuou com a gravidade dos sintomas. Sendo assim, houve aumento da razão entre neutrófilos:linfócitos, salientando a redução dos valores absolutos dos linfócitos no sangue periférico. A proporção neutrófilo:linfócitos têm sido indicada como preditor de gravidade da 48 Covid-19 (74,75). Além disto, os níveis elevados de neutrófilos no sangue periférico são indicadores precoces da infecção por SARS-CoV-2, predizendo quadros graves de doença respiratória e pior desfecho da doença (76). Uma das possíveis razões da linfopenia pode estar relacionado com a evidencia in vitro que após a entrada do vírus, ocorre a replicação viral e apoptose em linfócitos B, monócitos e em menor escala os linfócitos T CD4+ (78). Embora o papel dos neutrófilos, durante infecções por bactérias e fungos, são mais compreendidas, o seu impacto na imunidade antiviral, é menos conhecida. Os neutrófilos, estão envolvidos com o início da defesa antiviral, considerando que podem ser ativados por agonistas de receptores Toll-like (TLR). Os neutrófilos expressam TLR1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, e 10, exceto o TLR3 (78) Entretanto, a
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