teorico4

Prévia do material em texto

Laboratório de 
Análises Bromatológicas 
e Toxicológicas
Responsável pelo Conteúdo:
Prof. Dr. Everton Carlos Gomes
Revisão Textual:
Prof.ª Dr.ª Luciene Oliveira da Costa Granadeiro
Análise Toxicológica em Material Biológico
Análise Toxicológica em 
Material Biológico
• Roteiro 1;
• Roteiro 2.
UNIDADE Análise Toxicológica em Material Biológico
Roteiro 1
Identificação de fármacos em material biológico por 
Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Cromatografia em camada delgada
A cromatografia em camada delgada é uma técnica de adsorção líquido-sólido, 
na qual a separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma 
mistura pela fase estacionária. A CCD está embasada na separação de substâncias 
por meio das suas diferentes velocidades de migração em razão da afinidade relativa 
com solventes, fixando-se numa fase sólida. A CCD é um método simples, rápido e 
econômico, sendo a técnica predominantemente escolhida para o acompanhamento 
de reações orgânicas. Neste método a fase estacionária é uma camada fina formada 
por um sólido granulado (sílica, alumina e poliamida) depositado sobre uma placa 
que deve atuar como suporte inerte. Na CCD gotas da solução a ser separada são 
aplicadas em um ponto próximo ao extremo inferior da placa. Após a secagem da 
placa, ela é colocada em um recipiente contendo a fase móvel, de modo que somente 
sua base fique submersa. O solvente começa a molhar a fase estacionária e sobe por 
capilaridade (Figura 1). Após o deslocamento da fase móvel deixa-se a placa secar, e 
posteriormente é realizada a revelação da placa com reativos que deem cor as subs-
tâncias de interesse (Figura 2). O parâmetro de maior importância na CCD é o fator 
de retenção, que é a razão entre a distância percorrida pela substância e a distância 
percorrida pela fase móvel. Esse fator determinará se a substância analisada confere 
com a substância padrão.
• Capilaridade: é a responsável pelo avanço do solvente ou fase móvel sobre a 
fase estacionária que contém a amostra; 
• Interação: tão logo se inicia a migração da fase móvel, a amostra é dissolvida 
e começa a ser arrastada pela fase móvel. Neste momento aparecem forças de 
interação entre os componentes da amostra e a fase estacionária. Estas forças 
de interação se opõem à força de arraste da fase móvel (capilaridade) retardando 
o avanço dos componentes da amostra.
Vantagens:
• Fácil execução;
• Maior rapidez; 
• Menor trajeto da fase móvel; 
• Boa resolução;
• Manchas em geral menos difusas; 
• Baixo custo; 
• Versatilidade.
8
9
Desvantagens:
• Difícil reprodutibilidade: é muito difícil a confecção de duas placas idênticas, 
com a mesma quantidade de amostra, etc; 
• Difícil determinação exata do Rf.
Na prática:
Figura 1 – Cromatografi a em camada delgada
Fonte: Wikimedia Commons
Figura 2 – Compostos presentes na amo stra após percorrer
a placa de cromatografi a em camada delgada
Fonte: Wikimedia Commons
Aplicação da Teoria na Prática
Identificação de corticoides e piroxicam por cromatografia em
camada delgada em medicamentos manipulados falsificados
O exemplo proposto foi retirado do artigo “Identificação de corticóides e piroxicam por 
cromatografia em camada delgada em medicamentos manipulados falsificados”.
Disponível em: https://bit.ly/3iBuyVb
Muitos medicamentos manipulados comercializados como “naturais” para o trata-
mento de dores são livremente vendidos no país. Entretanto, os padrões de qualidade 
e segurança destes produtos, estabelecidos pela legislação vigente, nem sempre são 
satisfatórios. Erros na rotulagem, assim como fraudes por adição de substâncias não 
9
UNIDADE Análise Toxicológica em Material Biológico
declaradas nas formulações são freqüentes nas amostras encaminhadas ao Centro 
de Medicamentos, Cosméticos e Saneantes do Instituto Adolfo Lutz. Este trabalho 
descreve um levantamento sobre a presença de glicocorticóides e piroxicam em pro-
dutos magistrais contendo formulações naturais de plantas utilizadas no tratamento 
de dores de coluna, artrites e tendinites. Foi detectada a presença de corticóides e/
ou piroxicam em sete de vinte e cinco amostras analisadas entre 2004 e 2010, o que 
indica uma situação de alerta em se tratando de medicamentos manipulados que não 
deveriam constar indicações terapêuticas.
Roteiro de Atividade Prática
Extração, Padronização e Identificação de Fármacos por CCD
Objetivo
Teste rápido para estimar a exposição do organismo a fármacos ou drogas de abuso.
Materiais
Tabela 1 – Básicos
Acetona 100 mL
Ácido acético 50 mL
Clorofórmio 500 mL
Éter de petróleo 100 mL
Fe(NO3)3.9H2O Nitrato férrico decahidratado 40 g
Iodeto de Potássio 4,0 g
Metanol 100 mL
NaOH 1 g
Nitrato de bismuto 2,0 g
Solução de cloreto férrico 10 g
Sulfato de sódio 10 g
Padrões
• Ácido salicílico;
• Cafeína;
• Lidocaína 10%;
• Nicotina.
Agentes cromogênicos
• Solução de cloreto férrico (FeCl3) 5%;
• Solução de Dragendorff Iodado (DI): solução A- 2 g de nitrato de bismuto 
+ 25 mL de ácido acético, qsp 100 mL de água; solução B- 4,0g de KI, qsp 
100 mL de água. Misturar 10 mL da solução A + 10 mL da solução B + 20 mL 
de ácido acético, completar para 1000 mL de água. Adicionar 20 g de iodo e 
agitar por 30 minutos.
10
11
Solvente orgânico
• Éter: clorofórmio (1:2).
• Sistema solvente:
» Cuba ácida: clorofórmio:acetona (9:1);
» Cuba básica: clorofórmio:metanol (4:1).
Equipamentos
Tabela 2
Funil de separação (125 mL) 2
Bastão de vidro 1
Funil de vidro capacidade 100 mL 01
Béquer 100 mL 02
Bastão de vidro 01
Papel Universal pH 02 fitas
Béqueres 100 mL 03
Placas cromatográficas de sílica gel (0,25 mm de espessura)
Capilar de vidro para aplicação em cromatografia 10
Cubas de vidro 2
Nebulizadores 2
Procedimento 
1. Aplicar por capilaridade as soluções padrão 1 e 2 placas cromatográfi -
cas diferentes;
2. Colocá-las nas cubas de desenvolvimento previamente saturada contendo 
o sistema solvente clorofórmio:acetona (9:1). Após o desenvolvimento das 
placas (10 cm), retirá-las das cubas e deixá-las à temperatura ambiente 
para a completa evaporação do solvente;
3. A seguir, revelar a cromatoplaca 1 com FeCl3 e a 2 com DI. Expressar os 
resultados segundo a forma da mancha, cor da mancha e hRf;
4. Aplicar as soluções-padrão 3 e 4 em uma outra cromatoplaca;
5. Colocar nas cubas previamente saturada contendo o sistema solvente 
clorofórmio-metanol (4:1). Após o desenvolvimento das placas (10 cm), 
retirá-las das cubas e deixá-las à temperatura ambiente para a completa 
evaporação do solvente;
6. A seguir revelar a cromatoplaca com DI;
7. Expressar os resultados segundo a forma da mancha, cor da mancha e hRf.
11
UNIDADE Análise Toxicológica em Material Biológico
Roteiro 2
Identificação de Fármacos 
A investigação de fármacos é provavelmente a mais frequente dos testes toxico-
lógicos requisitados, e dependendo do fármaco, das suas características fármaco 
toxicológicas, e do tempo decorrido da exposição, pode ser detectado na forma 
inalterada ou biotransformada em sangue ou na urina.
A importância da escolha de um método de triagem é fundamental, pois define a 
gama de analitos que serão pesquisados e detectados. Portanto, deverá ter sensibili-
dade e abrangência de compostos para ser eficiente. 
Apesar da existência de metodologias de análise modernas com alta especificidade 
e elevada sensibilidade, grande parte dos laboratórios de toxicologia analítica ainda 
utilizam métodos clássicos, como a cromatografia em camada delgada. A técnica de 
CCD é considerada como método de escolha para a triagem de substâncias desco-
nhecidas devido a sua velocidade, confiabilidade, simplicidade, baixo custo e habilida-
de de gerar parâmetros como cor e fator de retenção (Rf), frequentemente expresso 
multiplicado por 100 (hRf), em um curto intervalo de tempo, sendo considerada uma 
técnica de triagem mais abrangente que os imunoensaios.
Aplicação da teoria na prática
O artigo apresentado é um importante exemplo da aplicação detécnica de cromatografia 
para identificar medicamentos ou toxinas presentes na urina para um controle antidoping. 
Disponível em: https://bit.ly/2Gq48sy
Efedrinas são aminas simpatomiméticas componentes de diversas especialidades 
farmacêuticas, utilizadas no tratamento de doenças respiratórias devido à sua ação 
descongestionante e bronco dilatadora. Atualmente, diversos produtos comercializa-
dos como suplementos nutricionais contêm efedrinas e são amplamente utilizados no 
meio esportivo, com o objetivo de facilitar a queima de gorduras e melhorar o desem-
penho. Entretanto, o uso indiscriminado destas substâncias pode acarretar série de 
efeitos tóxicos como hipertensão, taquicardia, cefaleia e tremores. Devido à sua ação 
psicoestimulante, foram incluídas na lista de substâncias proibidas nas atividades es-
portivas pelo Comitê Olímpico Internacional (COI) e estabelecidas concentrações na 
urina para o controle da dopagem (efedrina e metilefedrina: 10 µg/mL). 
Roteiro de atividade prática
Extração
• Amostra: urina, sangue ou conteúdo gástrico.
12
13
Materiais e Equipamentos
Os materiais e equipamentos utilizados nessa segunda parte serão os mesmos da 
primeira prática.
Extração de substâncias de caráter ácido e neutro
1. Colocar 10 mL da amostra em funil de separação (125 mL) e ler o pH;
2. Ajustar o pH entre 4,0 e 5,0 por meio de solução de H2SO4 1%;
3. Extrair com 20 mL da mistura clorofórmio:éter (3:1), agitando vigorosa-
mente o funil por 1 minuto;
4. Deixar o funil em repouso por alguns minutos para a separação das fases;
5. Filtrar a camada orgânica sobre Na2SO4 1% anidro, previamente ume-
decido com a mistura clorofórmio: éter. Recolher o extrato em béquer;
6. Repetir os itens 3 e 4 recolhendo o fi ltrado no mesmo béquer;
7. Evaporar o solvente à secura e reservar o resíduo (Ra= ácido);
8. Desprezar o remanescente aquoso, que fi cou no funil de separação. 
Extração de substâncias de caráter alcalino e neutro
1. Colocar outra alíquota de 10 mL da mesma amostra em funil de separa-
ção (125 mL) e ler o pH;
2. Ajustar o pH entre 8,0 e 9,0 por meio de solução de NaOH 2 %;
3. Extrair com 20 mL da mistura clorofórmio: éter (3:1), agitando vigorosa-
mente o funil por 1 minuto;
4. Deixar o funil em repouso por alguns minutos para a separação das fases;
5. Filtrar a camada orgânica sobre Na2SO4 1% anidro, previamente ume-
decido com a mistura clorofórmio: éter. Recolher o extrato em béquer;
6. Repetir os itens 3 e 4 recolhendo o fi ltrado no mesmo béquer;
7. Evaporar o solvente à secura e reservar o resíduo (Rb= básico);
8. Desprezar o remanescente aquoso, que fi cou no funil de separação. 
Identificação 
Aplicar os padrões, previamente padronizados, na placa cromatográfica e os ex-
tratos ácido e básico. Escolher o melhor sistema solvente e os reveladores que foram 
estudados durante a padronização.
Por meio da comparação com os padrões escolhidos, tentar identificar qual fár-
maco pode estar presente na amostra biológica em estudo.
13
UNIDADE Análise Toxicológica em Material Biológico
Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:
 Livros
Ciências farmacêuticas: Toxicologia Analítica
OREAU, R. L. de M. Ciências farmacêuticas: toxicologia analítica. 2. Rio de 
Janeiro Guanabara Koogan 2015. (e-book)
Fundamentos em Toxicologia de Casarett e Doull (Lange)
KLAASSEN, C. D. Fundamentos em toxicologia de Casarett e Doull (Lange). 
2. Porto Alegre AMGH 2012. (e-book)
Química Clínica: Princípios, Procedimentos, Correlações
Química Clínica: princípios, procedimentos, correlações. 5. São Paulo Manole 
2010. (e-book)
Manual de Toxicologia Clínica
OLSON, K. R. Manual de toxicologia clínica. 6. Porto Alegre AMGH 2013. (e-book)
 Leitura
Identificação de Substâncias em Análise Toxicológica Sistemática utilizando um Sistema 
Informatizado para Cálculo de Parâmetros Cromatográficos e Busca em Bases de Dados
LINDEN, R. et al. Identificação de substâncias em análise toxicológica sistemática 
utilizando um sistema informatizado para cálculo de parâmetros cromatográficos e 
busca em bases de dados. Quím. Nova, São Paulo , v. 30, n. 2, p. 468-475, Apr. 2007.
https://bit.ly/34yx8WT
Validação de Técnica Analítica em Cromatografia em Camada Delgada Comparativa 
para Identificação de Fármacos Anorexígenos Sintéticos em Produtos Fitoterápicos
https://bit.ly/34Nl7NF
Determinação de Fármacos Diuréticos em Associação por Cromatografia 
em Camada Delgada e Espectrofotometria
VALLADAO, D. M. de S.; IONASHIRO, M.; ZUANON NETTO, J. Determinação 
de fármacos diuréticos em associação por cromatografia em camada delgada 
e espectrofotometria. Quím. Nova, São Paulo, v. 31, n. 1, p. 44-46, 2008. 
https://bit.ly/33At8Ge
Determinação de Daidzeína, Genisteína e Gliciteína em Cápsulas de Isoflavonas por Cromatografia 
em Camada Delgada (CCD) e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
CESAR, I. da C. et al . Determinação de daidzeína, genisteína e gliciteína em cápsulas 
de isoflavonas por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de 
alta eficiência (CLAE). Rev. bras. farmacogn., João Pessoa , v. 17, n. 4, p. 616-625, 
Dec. 2007.
https://bit.ly/30GuNIm
14
15
Referências
CAMPESTRINI, I. Determinação de cocaína e metabólitos em amostra de urina de 
usuários da droga e em amostras ambientais. Tese de Doutorado. Unicamp. 2015. 
Disponível em: <http://repositorio.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/249646/1/Cam-
pestrini_Iolana_D.pdf>. Acesso em: 15/02/2020. 
FELTES. M. M. C. Procedimentos operacionais padronizados de bromatologia 
de alimentos. Blumenau: Instituto Federal Catarinense, 2016. 172 p.
LINI, R. S. et al. Caracterização de fármacos por cromatografia em camada delgada 
Rev. Bras. Farm. 95 (1): 486 – 498, 2014.
MOREAU, R. L. M; SIQUEIRA, M. E. P. B. – Toxicologia Analítica. Rio de Janeiro, 
Guanabara Koogan, 2008. 318 p.
ZENEBON. O.; PASCUET. N. S.; TIGLEA. P. Instituto Adolfo Lutz (São Paulo). 
Métodos físico-químicos para análise de alimentos – São Paulo: Instituto Adolfo 
Lutz, 2008. 1020 p.
15