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PROFESSORA Me. Suelen Eloise Simoni Microbiologia Clínica ACESSE AQUI O SEU LIVRO NA VERSÃO DIGITAL! https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/18746 NEAD - Núcleo de Educação a Distância Av. Guedner, 1610, Bloco 4 - Jd. Aclimação - Cep 87050-900 | Maringá - Paraná www.unicesumar.edu.br | 0800 600 6360 PRODUÇÃO DE MATERIAIS Coordenador de Conteúdo Sidney Edson Mella Júnior Designer Educacional Vanessa Tiburcio Curadoria Katia Salvato Revisão Textual Ariane Fabreti Editoração Adrian Marçareli, Nivaldo Vilela Ilustração Welington Vainer Fotos Shutterstock. Pró Reitoria de Ensino EAD Unicesumar Diretoria de Design Educacional Universidade Cesumar - UniCesumar. U58 FICHA CATALOGRÁFICA Impresso por: Bibliotecária: Leila Regina do Nascimento - CRB- 9/1722. Núcleo de Educação a Distância. Ficha catalográfica elaborada de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a). Microbiologia Clínica/ Suelen Eloise Simoni. - Indaial, SC : Arqué, 2023. 288 p. : il. ISBN papel xxxxxxxxxxxxxxx ISBN digital xxxxxxxxxxxxxxx “Graduação - EaD”. 1. Clinica 2. Infecções 3. Microbiológicos. 4. Suelen Eloise Simoni 3. I. Título. CDD - 579 02511419 https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/17299 Me. Suelen Eloise Simoni Sou uma pessoa que ama basset hounds, que é fã de cinema, apaixo- nada por musicais da Broadway e completamente fascinada por livros de fantasia (Só para constar, minha casa em Hogwarts é a Lufa-Lufa). A vida toda fui uma grande nerd, e mais atualmente, dedico aqueles minutinhos antes de dormir a assistir alguns animes bem humorados. Mas quem me conhece mesmo, sabe que a minha verdadeira paixão é a dança. Já fiz inúmeros estilos, como balé clássico, jazz, country, dança de salão, dança ucraniana e, hoje, libero todos os meus estresses em uma aula maravilhosa de balé moderno. A dança me ensinou que treino e constância são características importantes para a evolução, e, na medida do possível, aplico toda a determinação e disciplina inspirados por ela em minha vida pessoal. Mesmo com toda esta inclinação artística, eu sou conhecida por ser uma pessoa muito séria - a não ser pelos decibéis da minha gargalhada, nas ocasiões em que a piada é realmente muito boa. Por isso, se você me vir de cara fechada andando na rua, é só dar um tchauzinho. Eu não estou brava, é só a minha cara mesmo. E, se pudesse deixar um conselho valioso daqui para frente, além das inúmeras indi- cações de filmes que virão, é que você encontre algo que lhe preencha a alma - assim como eu encontrei a dança. Ao longo desta jornada de- safiadora que é a vida acadêmica, garanto que isso tornará o processo muito mais gentil para aqueles momentos nem tão fáceis assim. Lattes: http://lattes.cnpq.br/6363749591486302 Aqui você pode conhecer um pouco mais sobre mim, além das informações do meu currículo. https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/14624 Quando identificar o ícone de QR-CODE, utilize o aplicativo Unicesumar Experience para ter acesso aos conteúdos on-line. O download do aplicativo está disponível nas plataformas: Google Play App Store Ao longo do livro, você será convidado(a) a refletir, questionar e transformar. Aproveite este momento. PENSANDO JUNTOS EU INDICO Enquanto estuda, você pode acessar conteúdos online que ampliaram a discussão sobre os assuntos de maneira interativa usando a tecnologia a seu favor. Sempre que encontrar esse ícone, esteja conectado à internet e inicie o aplicativo Unicesumar Experience. Aproxime seu dispositivo móvel da página indicada e veja os recursos em Realidade Aumentada. Explore as ferramentas do App para saber das possibilidades de interação de cada objeto. REALIDADE AUMENTADA Uma dose extra de conhecimento é sempre bem-vinda. Posicionando seu leitor de QRCode sobre o código, você terá acesso aos vídeos que complementam o assunto discutido PÍLULA DE APRENDIZAGEM Professores especialistas e convidados, ampliando as discussões sobre os temas. RODA DE CONVERSA EXPLORANDO IDEIAS Com este elemento, você terá a oportunidade de explorar termos e palavras-chave do assunto discutido, de forma mais objetiva. https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/3881 MICROBIOLOGIA CLÍNICA A microbiologia é conhecida como a área de estudo que aborda os pequenos organismos provindos dos demais habitats, como solo, água e o próprio ser humano. Mas você, aluno(a), consegue mensurar o quão pequeno estamos falando? Além disso, consegue imaginar outro habitat em que seria possível encontrar estes pequenos elementos? E se eu lhe dissesse que já existiram estudiosos que relacionaram doenças de causas inexplicáveis às bactérias de origem interplanetária, você acharia possível? Pois este é exatamente o caso da doença de Morgellons, um distúrbio cutâneo, de causa desconhecida, caracterizado por lesões de pele com aparência inchada e que, curiosamente, produzem e expelem filamentos coloridos (vermelho, preto e azul). Ainda, os pacientes, de maneira recorrente, descrevem a sensação de terem “parasitas ou insetos passando por dentro de suas peles”. No entanto o processo de investigação para determinação de uma doença infecciosa necessita da definição de algumas características essenciais, como: agente etiológico, transmissão, manifestações clínicas (também cha- mados de sinais e sintomas), tratamento e diagnóstico, mesmo que as descobertas associadas a estes fatores não sejam realizadas nesta ordem em particular. Por isso, é comum que processos patológicos os quais podem ser potencialmente associados a micro-orga- nismos sejam estudados de uma maneira mais sistematizada, de forma semelhante a como faremos neste livro. Para que você tenha uma ideia deste processo, recomendo que realize uma pesquisa sobre a doença de Morgellons e se atente ao rigor científico dos seus dados a serem consultados. Aqui vai um conselho: uma equipe liderada pelo Doutor Randy Wymore, em Oklahoma, EUA, possui dados valiosos sobre esta patologia. Se eu fosse você, começaria por eles. Pesquise, principalmente, a etiologia, os sintomas e o tipo de paciente acometido. E então, você conseguiu identificar qual a principal linha de raciocínio deste grupo de estudos? É claro que, para a condução de uma pesquisa médica de qualidade, existem diversos passos e muitas etapas a serem seguidos. Por meio desta pequena visitação, ficou mais fácil entender como funciona a dinâmica de pesquisa clínica? Você consegue imaginar-se atuando desta maneira? Pela necessidade de entendermos os pontos-chaves dos processos infecciosos, as unidades de Microbiologia Clínica estarão organizadas de maneira a identificarmos e definirmos os fatores fundamentais que envolvem a história natural das doenças bacterianas e fúngicas, como as formas de transmissão, os vetores (quando presentes), os sintomas, os sinais físicos e aas potenciais sequelas causadas pela ausência de tratamento. Para isso, serão apresentados os conceitos acerca de características citológicas, histológicas e fisiológicas dos sistemas humanos acometidos nestes processos patogênicos, desde a pele até o tecido nervoso, para que o apren- dizado seja ainda mais enriquecedor. Além disso, entender como funcionam as células bacterianas e fúngicas e quais os mecanismos utilizados por elas que permitem a sua invasão e disseminação no hospedeiro, é fundamental. Além disso, será possível, no final destas unidades, compreender os métodos diagnósticos para as identificações laboratoriais destes patógenos, incluindo os procedimentos manuais e automatizados, bem como os materiais utilizados para sua aplicação analítica. Dentro deste assunto, você aprenderá sobre as maneiras de cultivo destes micro-organismos, quais as exigências ambientais para seu crescimento, os métodos de inoculação e isolamento e, também, você será colocado à frente de situações hipotéticas - mas não menos desafiadoras - que o ajudarão a compreender como funciona o processo da pesquisa clínica e a rotina em umlaboratório de microbiologia. Ainda, você será apresentado aos tratamentos mais comuns para as infecções bacterianas e fúngicas, principalmen- te aqueles que são mais acessíveis e administrados em hospitais. Esta disciplina ainda lhe apresentará curiosidades sobre os micro-organismos, as indicações de filmes e os documentários relevantes para seu processo de aprendi- zado e as oportunidades que vão além desse material escrito, que lhe ajudarão a se familiarizar com o conteúdo e lhe convencerem de que a microbiologia é uma das mais interessantes áreas do arcabouço das ciências da saúde. Por que você se dedicaria ao máximo para a microbiologia clínica? Posso lhe dizer, com toda certeza, que a microbiologia vai muito além dos jalecos brancos e enigmas laboratoriais. No campo acadêmico, o conhecimento profundo da microbiologia ajuda você a interpretar outras disciplinas clínicas, uma vez que a presença de infec- ção altera não apenas ensaios microbiológicos, mas análises bioquímicas, citológicas e hematológicas também. No campo profissional, primeiramente, permite que o profissional seja ferramenta para estabelecer a saúde dos indivíduos, principalmente porque o diagnóstico de uma infecção bacteriana ou fúngica não interfere na vida de apenas um indivíduo, mas consegue ir além, auxiliando órgãos sanitários no controle de endemias importantes. Além disso, entender de microbiologia facilita a comunicação com os demais setores clínicos e capacita o profis- sional a não trabalhar apenas na bancada analítica, mas expandir sua atuação para áreas de auditoria, controle de qualidade, controle de infecções hospitalares, coordenação de setores laboratoriais e elaboração de procedimentos imprescindíveis que garantem o bom funcionamento de um laboratório de análises clínicas. Mas, como você pode conseguir tudo isso? Eu lhe garanto que ficar restrito à leitura do material escrito pode lhe fornecer informações preciosas, mas a garantia de que seu aprendizado seja realmente eficaz vem com a prática. Abuse dos espaços para anotações e mapas mentais, resolva as questões propostas com seriedade, participe, ativamente, das propostas de atividades, consuma o conteúdo em áudio e vídeo disponibilizado, e, também, se divirta com as indicações de entretenimento. O aprendizado é fruto da sinestesia, por isso, a combinação dos seus registros escritos, do consumo dos filmes indicados (até acompanhado de pipoca, por que não?) e dos minutinhos de conversa que teremos neste processo trarão mais leveza para a leitura deste material e serão fundamentais para o aproveitamento integral do seu estudo. Espero você nas próximas unidades! 1 2 43 5 6 113 13 77 49 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA CLÍNICA 173 ASPECTOS CLÍNICOS, EPIDEMIOLÓGICOS E LABORATORIAIS DE INFECÇÕES BACTERIANAS DE SNC E SISTEMA SANGUÍNEO. ASPECTOS MICROBIO- LÓGICOS, CLÍNICOS E LABORATORIAIS DAS INFECÇÕES DO TRATO GASTROINTESTINAL ASPECTOS MI- CROBIOLÓGICOS, CLÍNICOS E LABORATORIAIS DAS INFECÇÕES DE TRATO URINÁRIO ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS, CLÍNICOS E LABORATORIAIS DAS INFECÇÕES SEXUALMENTE TRANSMISSÍVEIS ASPECTOS CLÍNICOS, EPIDEMIOLÓGICOS E LABORATORIAIS DE INFECÇÕES BACTE- RIANAS DO TRATO RESPIRATÓRIO 141 7 8 9 201 245 219 ASPECTOS CLÍNICOS, EPIDEMIOLÓGICOS E LABORATORIAIS DE INFECÇÕES DE PELES E PARTES MOLES ASPECTOS CLÍNICOS, EPIDEMIOLÓGICOS E LABORATORIAIS DE INFECÇÕES DAS MICOSES SISTÊMICAS ASPECTOS CLÍNICOS, EPIDEMIOLÓGICOS E LABORATORIAIS DE INFECÇÕES DAS MICOSES SUPERFI- CIAIS E CUTÂNEAS 1 Nesta unidade, convido você, aluno(a), a aprender as principais formas de organização dos micro-organismos, as características celulares essenciais dos procariontes e quais os fatores que in- fluenciam o crescimento microbiano. Ainda nesta unidade, serão apresentadas as principais técnicas de coloração de lâminas, os fundamentos das análises microscópicas e, acredito, ainda, que você dominará facilmente as denominação e destinação dos principais meios de cultura utilizados em microbiologia. Se aceitar entrar nesta jornada desafiadora, aprenderá, também, as etapas pré-analíticas, que são técnicas de coleta, preservação e transporte de amostras clínicas, as responsabilidades as quais envolvem a microbiologia clínica bem como os pontos críticos que um profissional de saúde deve considerar antes e durante a execução dos ensaios. Introdução à Microbiologia Clínica Me. Suelen Eloise Simoni 14 UNICESUMAR A microbiologia é conhecida como a área de estudo que aborda os pequenos organismos e esconde um conjunto de enigmas e desafios inerentes que não são apenas do tamanho desses elementos, mas envolvem, também, a complexidade de seus metabolismos, processos de patogenicidade e fatores de virulência. Tenho certeza que, com os seus conhecimentos prévios em microbiologia, você sabe que é de extrema importância os profissionais de saúde estarem familiarizados com todos esses conceitos e, também, com o risco associado de trabalhar com amostras clínicas. Sendo assim, o que poderia acontecer, caso esse comprometimento não estivesse tão claro ou se os cuidados a serem tomados durante a coleta de uma amostra não fossem executados em sua totalidade? Considere o seguinte cenário: você é o(a) analista clínico(a) responsável pelo setor de microbiologia de um laboratório hospitalar e recebe o questionamento do médico responsável pelo paciente Quentin Tarantino, um homem de 60 anos que está há 15 dias sob o uso de antibióticos de amplo espectro, mas cujo exame de urina continua apresentando alto crescimento bacteriano, mesmo sob aumento da dose do medicamento. O médico quer saber se existe algum procedimento adotado pelo laboratório ou na coleta que pode influenciar no resultado final. Qual seria a sua resposta? Lembre-se de considerar não apenas o material obtido, mas também as medidas de cuidado pos- síveis de serem aplicadas durante a coleta que assegurem que a amostra reflete, verdadeiramente, a condição desse material. Além disso, o material de coleta pode ser contaminado, de alguma forma, durante a coleta? O uso de Equipamentos de Proteção Individual é capaz de influenciar o resultado final? Em relação à identificação dessa amostra, existe algum interferente com capacidade de a impactar, diretamente, antes que ela chegue ao laboratório? Inicialmente, o domínio dos conceitos pré-analíticos para processamento de amostras em laboratório de microbiologia é um dos pontos mais críticos à obtenção de resultados fidedignos. Por isso, conhecer as condições nas quais uma amostra é coletada, transportada e recebida nas instalações laboratoriais é de suma importância para que profissionais analistas consigam avaliar criticamente os resultados obtidos, auxiliando, dessa forma, nas discussões multiprofissionais que envolvem o bem-estar de pacientes hospitalares ou não. De acordo com uma revisão sistemática realizada em 2012 (LOURENÇO, 2013), a ocorrência de erros pré-analíticos de natureza de coleta envolvendo identificação das amostras, além de comum, pode levar a erros de diagnóstico, implementação de terapias desnecessárias e impacto direto na vida do paciente. Além disso, o cuidado com etapas pré-analíticas envolvendo tanto a escolha de frascos corretos para coleta quanto os volumes adequados de amostras auxilia na tomada de decisão mais assertiva no momento da análise, trazendo mais segurança ao analista e ao resultado. Voltando ao paciente hospitalizado: se eu te dissesse que, no mesmo quarto onde o senhor Tarantino estava internado, o paciente Martin Scorsese, apresentando dores pélvicas fortíssimas e sintomas de infecção, também teve a urina coletada para exames, urina a qual apresentou-se negativa para bactérias, a sua argumentação com o médico mudaria? Para buscar por respostas, te proponho a seguinte atividade: faça a leitura do estudo “Erros pré-a- nalíticos em Medicina Laboratorial: uma revisão sistemática”, disponível no QR Code,a seguir. Esse passo é muito importante na construção do seu aprendizado. UNIDADE 1 15 Como uma forma de refrescar o nosso conhecimento em microbiologia, é importante resgatar alguns conceitos importantes os quais estão constantemente associados à pesquisa de patógenos e ao diag- nóstico de doenças infecciosas. Inicialmente, é importante lembrar que os seres humanos possuem, naturalmente, uma microbiota normal, a qual, em condições fisiológicas usuais, não causa danos, sendo considerada ubiquitária no organismo humano e animal (SOUZA; SCARCELLI, 2000). Você, aluno(a), faz ideia da infinidade de micro-organismos que podem habitar, de forma harmo- niosa e não prejudicial, o nosso corpo? Clique no ícone da Realidade Aumentada e explore as regiões da fisiologia humana possuidoras de microbiota normal, familiarize-se com os gêneros e espécies a serem citados ao longo desta e das demais unidades, futuramente. Agora, após a leitura e utilizando os seus conhecimentos da microbiologia básica, tente listar, ao menos, três possibilidades pré-analíticas capazes de influenciar o resultado questionado pelo médico. Te convido a ir mais além e refletir: você acha que os resultados obtidos nos exames dos dois pacientes possuem correlação? Existe alguma me- dida que pode ser tomada na rotina laboratorial, a fim de prevenir erros pré-analíticos? Use o Diário de Bordo disponível, a seguir, e registre a sua busca. Para acessar, use seu leitor de QR Code. REALIDADE AUMENTADA https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/15469 16 Quadro 1 - Micro-organismos causadores de infecções exógenas / Fonte: adaptado de Brasil (2004). UNICESUMAR Quando o sistema imunológico se apresenta enfraquecido ou em ocasiões de nutrição insuficiente e imunossupressão, no entanto os micro-organismos da flora microbiana são importantes contribuin- tes às infecções transmitidas por via endógena, aproveitando essas fragilidades do organismo para se colonizarem e multiplicarem, sendo denominados patógenos oportunistas (BRASIL, 2004). Além disso, a via exógena, isto é, meio pelo qual micro-organismos invadem o organismo humano através de procedimentos médicos pobremente higienizados, transmissão aérea por gotículas e perdi- gotos e contato direto com mãos, por exemplo, caracteriza-se como a principal forma de transmissão de doenças infecciosas. Isso porque essas bactérias, parasitas e fungos não precisam, necessariamente, que o organismo se encontre em condições ruins, pois tais micro-organismos possuem mecanismos de patogenicidade e fatores de virulência que permitem a invasão de células e sistemas, a fim de utilizarem as nossas fontes de energia para se manterem vivos e replicantes (CARVALHO; MARQUES, 1999). No quadro, a seguir, você observará alguns exemplos de bactérias e fungos importantes causadores de infecções hospitalares e comunitárias. Micro-organismos exógenos Sistemas afetados pelas infecções Bactérias Gram negativas Escherichia coli Trato urinário, sangue Pseudomonas sp trato urinário, trato respiratório, queimaduras Klebsiella sp trato urinário, trato respiratório Proteus sp Trato urinário, trato respiratório Serratia sp Trato urinário, trato respiratório Bactérias Gram positivas Staphylococcus aureus Pele, sangue Streptococcus sp Trato urinário, trato respiratório Staphylococcus epidermidis Pele, sangue Fungos Candida albicans Trato urinário, sangue UNIDADE 1 17 Mas de que forma esses elementos se orga- nizam e funcionam, para serem capazes de provocar doenças graves e, muitas vezes, de difícil tratamento? A resposta a esta pergunta é um tanto quanto controversa, afinal, as células dos pequenos organismos são relativamente simples quando compa- radas à complexidade do funcionamento do organismo humano. Quanto aos fungos, é sabido que são organismos eucariontes, por isso, têm membrana nuclear unicelulares ou pluri- celulares. Possuem membrana plasmática constituída por uma grande quantidade de lipídios e esteróis, responsáveis por ofere- cer estabilidade à célula e suporte em casos de estresse celular. Além de apresentarem o núcleo protegido por um envelope nu- clear, a organização do citoplasma tam- bém é muito variada, contendo diversas organelas, como: mitocôndrias, ribosso- mos, retículo endoplasmático, Complexo de Golgi e lisossomos (BLACK; BLACK, 2021). Em uma seção à parte, abordare- mos melhor as células fúngicas, os seus mecanismos de sobrevivência e como eles influenciam a patogenicidade desses mi- cro-organismos. 18 UNICESUMAR Já as bactérias são um grupo de organis- mos unicelulares e procariontes que se repro- duzem apenas por mitose e apresentam, de modo geral, um único cromossomo, por con- ta disso, possuem estrutura e apresentação relativamente simples. As bactérias perten- cem aos domínios Archaea e Bacteria e são os menores de todos os organismos da terra: medem entre 0,5 e 2,0 μm (micrômetros) de diâmetro (de 4 a 15 vezes menores do que um eritrócito humano) e apresentam variadas formas, por exemplo, esféricas (denominadas cocos) em bastão (chamadas, também, de bacilos) e em espiral (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Diferentemente das células eucarióticas, as células bacterianas limitam-se a apresentar quatro componentes estruturais elementa- res: parede e membrana celulares, citoplasma (contendo ribossomos e material genético) e, também, estruturas celulares externas, como flagelos e pili, por exemplo. UNIDADE 1 19 Descrição da Imagem: a figura apresenta um desenho de uma estrutura oval alongada representando uma célula com formato de bastão envolta por três camadas. A mais externa, de cor laranja, representa a estrutura chamada cápsula. A intermediária, de cor bordô, é chamada de parede celular, enquanto a mais interna e de cor amarela é denominada membrana plasmática. Delimitado por essas três camadas está o citoplasma, apresentado em cor bege e repleto de esferas na cor marrom, caracterizando os ribossomos. Na parte central, encontra-se um emaranhado de traços na cor roxa que representa o material genético (DNA) da célula bacteriana. Figura 1 - Estrutura básica de uma célula bacteriana procarionte / Fonte: Khouri (2016, on-line). Observando a Figura 1, você consegue, aluno(a), identificar a presença dessas estruturas. Devido ao tamanho tão diminuto desses micro-organismos, ao longo do tempo, foi necessário desenvolver técnicas de microscopia e coloração para que analistas pudessem os observar, carac- terizar e catalogar. Dentre elas, a microscopia óptica foi um grande avanço para o diagnóstico e triagem de doenças bacterianas, sendo desenvolvido para que, em meados de 1880, alcançasse a leitura impressionante de 0,2 μm, limite o qual permanece até hoje aos microscópios de banca- da (PIRES; ALMEIDA; COELHO, 2014). Além da microscopia óptica — que fornece junto às técnicas de coloração a principal forma de caracterizar as bactérias isoladas no laboratório — a microscopia de fundo escuro também pode ser útil àqueles micro-organismos que são distorcidos pelas técnicas comuns (coloração de Gram) ou que perdem as suas propriedades características, como a bactéria espiroqueta Treponema pallidum, causadora da sífilis. 20 UNICESUMAR Entre 1930 e 1940, surgiram, também, os primeiros equipamentos de microscopia eletrônica de varredura, a qual, assim como diz o nome, promove uma varredura completa na superfície da amostra analisada, explorando cada ponto e transmitindo o sinal para um detector de imagem e de raio-X, não só identificando as estruturas, mas analisando quimicamente a sua composição (SOUZA et al., 2007). Se olharmos novamente a Figura 1, quais estruturas conseguimos observar com o microscópio óptico e quais seriam possíveis, apenas, através da microscopia eletrônica de varredura? E se voltarmos aos nossos queridos pacientes Quentin Tarantino e Martin Scorsese, você acha que se o laboratório tivesse um microscópio mais tecnológico e evoluído, conseguiria identificar informaçõesmais relevantes? Na rotina laboratorial, é extremamente incomum ter microscópios eletrônicos para pesquisa da patógenos, isso porque, além do equipamento ser muito caro, ele necessita de instalações espe- ciais e pessoal altamente treinado, o que faz os investimentos para a sua manutenção no dia a dia serem muito elevados. Por essa razão, mesmo com algumas desvantagens em relação à resolução das imagens, o microscópio óptico, além de apresentar custo mais baixo, quando associado a outras técnicas de coloração, consegue fornecer resultados satisfatórios na microbiologia clínica. Dessa forma, tendo conhecimento claro sobre as estruturas bacterianas, o seu papel fisiológico e morfológico e como se comportam frente às tecnologias de pesquisa e identificação, você será capaz de exercer, de modo mais fácil, o seu papel de analista. A primeira estrutura a ser estudada é a parede celular, um envoltório externo à membrana citoplasmática, formada de peptideoglicano ou mureína, os quais são constituídos de moléculas de N-acetilglicosamina, ácido N-actilmurâmico e lisina ou ácido diaminopi- mélico. Ela é suficientemente porosa, permitindo a passagem de nutrientes, água e sais minerais para o citoplasma bacteriano e, também, é ela que possui diferenças importan- tes e responsáveis por caracterizar as bactérias como Gram negativas, Gram positivas e ácido-álcool resistentes (BLACK; BLACK, 2021). As bactérias Gram positivas têm uma camada espessa de peptideoglicano fixada, de forma firme, à membrana celular, combinada a moléculas de ácidos teicóicos, e é justamente à sua espessura que está relacionada à capacidade de reter alguns tipos de corantes internamente à célula. No caso de micro-organismos Gram negativos, a parede celular é constituída de vários polissacarídeos, lipídios, proteínas e, também, de peptideoglicano, no entanto a sua espessura não é suficiente para armazenar corantes, como o cristal-violeta, frente à ação de agentes descolorantes. Os micro-organismos Gram negativos apresentam, ainda, a membra- na externa, formada por lipoproteínas, responsáveis pela formação das porinas (importante mecanismo de resistência das bactérias a ação de antibióticos) e lipopolissacarídeos (uma combinação de lipídio A e polissacarídeos), os quais são responsáveis por se desprenderem da célula bacteriana após a sua morte e desempenhar propriedades tóxicas que provocam emergências médicas de moderadas a graves (BLACK; BLACK, 2021). UNIDADE 1 21 Descrição da Imagem: a figura apresenta dois desenhos, lado a lado. Na extremidade inferior, duas células distintas em forma de bastonete possuem, na parte central, o citoplasma, o qual está repleto de esferas em azul-claro representando os ribossomos e um emaranhado de linhas alaranjadas representando o material genético. As duas células são envoltas por uma membrana e as membra- nas de ambas as células estão aumentadas e representadas na parte superior da imagem. Do lado esquerdo da imagem, existe uma organização intitulada “Bactéria Gram negativa”, a qual caracteriza uma bactéria de mesmo nome. Ela tem seis camadas sobrepostas e, na seguinte ordem, de baixo para cima: citosol na cor verde-escuro, membrana plasmática na cor amarela, espaço periplasmático na cor azul claro, peptideoglicano na cor roxa e, novamente, o espaço periplasmático na coloração azul-claro, sendo a última camada, a qual é, também, a mais superior, a membrana externa, na cor verde-claro. A membrana da direita tem o título “Bactéria Gram positiva” e caracterizando uma bactéria de mesmo nome, a qual apresenta quatro camadas sobrepostas e, na seguinte ordem, de baixo para cima: citosol na cor verde-escuro, membrana plasmática na cor amarela, espaço periplasmático na cor azul-claro e, como a última camada e, também, a mais superior, o peptideoglicano na cor roxa. Figura 2 - Diferenças entre membranas plasmáticas de bactérias Gram positivas e negativas e a sua influência na coloração de Gram Na Figura 2, é possível observar as diferenças estruturais entre Gram positivas e Gram negativas. BACTÉRIA GRAM NEGATIVA BACTÉRIA GRAM POSITIVA Membrana externa Espaço periplasmático Espaço periplasmático Espaço periplasmático Membrana plasmática Membrana plasmática Peptideoglicano Peptideoglicano Citoplasma Citoplasma Parede celular Não retém o corante cristal violeta Fornece resultado positivo na coloração de gram No laboratório de microbiologia, são vários os corantes que podem ser empregados, mas, de longe, a coloração mais utilizada é a coloração de Gram. Mesmo possuindo algumas limitações — inadequada à caracterização de micoplasmas que não têm parede celular; espiroquetas devido ao seu tamanho muito pequeno e clamídias por serem bactérias intracelulares obrigatórias — a coloração de Gram consegue diferenciar a maioria das bactérias causadoras de patologias de importância médica. Dependendo do tipo de amostra, técnicas de isolamento diversas costumam ser utilizadas, a fim de obter colônias bem definidas para a confecção da lâmina de Gram. A técnica consiste em adicionar uma colônia bacteriana com menos de 24 horas de incubação a uma lâmina limpa e, preferencialmente, estéril, dispersando-a em uma pequena porção de solução salina estéril a 0,85%. Depois, a lâmina deve 22 Descrição da Imagem: a figura apresenta uma fotografia colorida de parte de uma lâmina microscópica corada. É possível visualizar pequenas bolinhas roxas, as quais caracterizam os cocos Gram positivos. Elas estão dispostas em aglomerados, em duplas ou trios ou em fileiras ao longo da imagem. Figura 3 - Cocos Gram positivos em lâmina microscópica Por que a coloração de Gram deve ser realizada em colônias ou amostras com menos de 24 horas de incubação? O dano fisiológico ou o envelhecimento podem tornar a parede celular de uma célula Gram positiva mais permeável, provocando escapamento do corante roxo, caracterizando-a erroneamente como Gram negativa. UNICESUMAR ser fixada, isto é, submetida a alta temperatura, momentaneamente, para que o esfregaço fique preso à lâmina durante toda a etapa de coloração. A coloração é, de modo geral, composta de quatro passos, sendo o primeiro deles a adição de cristal violeta (ou violeta genciana) em cima da lâmina por 60 segundos. Nesse momento, todas as bactérias com parede celular são coradas, tendo os seus citoplasmas impregnados com o corante de cor roxa intensa. Depois, uma solução a base de iodo (lugol), chamado, também, de “mordente”, é adicionada à lâmina, a qual fica responsável por formar um complexo junto ao corante violeta, fazendo com que ele fique fortemente ligado à parede celular de bactérias Gram positivas (OSANTE; RUIZ, 2016). Na Figura 3, é possível observar como bactérias Gram positivas se comportam na lâmina microscópica. UNIDADE 1 23 Descrição da Imagem: a figura apresenta uma fotografia colorida de parte de uma lâmina microscópica corada. É possível visualizar pequenas bactérias em forma de bastão na cor rosa, as quais caracterizam bactérias Gram negativas. Elas estão dispostas em aglome- rados, em duplas ou sozinhas ao longo da imagem. Figura 4 - Bacilos Gram negativos em lâmina microscópica O ponto crítico da técnica é a etapa de descoloração, representada pela adição de uma mistura de álcool e cetona, a qual fará a remoção do cristal violeta de todas as células Gram negativas. Para as revelar no entanto, uma última etapa de coloração é realizada adicionando o corante safranina ou fucsina, que fará a coloração do citoplasma tornar-se rosa, diferenciando as Gram negativas como na Figura 4. As bactérias álcool-ácido resistentes, dentre as quais se destacam a Mycobacterium tuberculosis e a Mycobacterium leprae, causadoras, respectivamente, da tuberculose e da hanseníase, têm espessura da parede celular semelhante às Gram negativas, contudo a constituição do envoltório consiste em cerca de 60% de lipídios e menos concentração de peptideoglicanos. Nesses micro-organismos, o processo de divisãocelular demanda muito gasto energético, devido à necessidade de produção de gorduras para a parede celular, por isso, possuem tempo de proliferação mais alongado quando comparados a outras bactérias. Também chamados de micobactérias, esses organismos fazem a retenção do corante carbolfucsina no citoplasma, sendo resistentes à descoloração, inclusive a reagentes mais potentes, como a mistura álcool-ácida, justificando, assim, a sua denominação (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). A coloração de Ziehl-Neelsen, adequada à caracterização dessas bactérias, será abordada e aprofundada na Unidade 5. 24 UNICESUMAR A parede celular confere às bactérias uma característica única e importante, assim, fica difícil ima- ginar que exista algo em comum entre as células dos patógenos e as dos seres humanos. Mas se eu te contasse que, em termos de membrana citoplasmática, a composição química e organizacional das bactérias é muito semelhante às nossas? Assim como a membrana de animais, a das bactérias é constituída por um mosaico fluido de fos- folipídios e proteínas. Essa bicamada fosfolipídica apresenta a extremidade externa altamente hidro- fílica, o que permite a interação com o meio aquoso, enquanto as proteínas aderidas a ela conferem às bactérias um perfil específico de identificação, funcionando como uma “impressão digital” da célula bacteriana. Contudo, diferentemente das células eucarióticas, a membrana celular nas bactérias tem funções adicionais à capacidade de troca de fluídos e nutrientes: ajuda na replicação do DNA, realiza respiração celular por meio da captura de energia na forma de ATP e, ainda, secreta proteínas impor- tantes para a defesa ou manutenção da célula no ambiente (BLACK; BLACK, 2021). Para que a parede celular e a membrana tenham os componentes necessários e desempenhem a sua função, as bactérias contam, ainda, com o citoplasma e com a sua composição a base de água, enzimas, carboidratos, lipídeos, íons orgânicos e ribossomos. Os ribossomos — compostos por RNA e proteína em longa cadeia — são os responsáveis pela síntese proteica bacteriana, semelhante à célula eucariótica, além de se diferenciarem em sua estrutura espacial bem como no chamado Coeficiente de Sedimentação (valor atribuído à capacidade de ribossomos decantarem-se em tubos no processo de centrifugação). As células eucarióticas apresentam o valor de 80 unidades Svedber (S) em seus ribossomos, enquanto as bactérias apresentam o coeficiente de 70S (divididos em duas subunidades contendo 30S e 50S). É essa propriedade, inclusive, que torna as bactérias suscetíveis à ação de antimicrobianos como a eri- tromicina, a qual tem capacidade de interagir juntamente com as subunidades ribossômicas da célula, impedindo a produção de proteínas vitais à bactéria (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Por não possuírem membrana nuclear, as bactérias apresentam, ainda, a chamada região nuclear ou nucleoide, a qual se localiza no centro do citoplasma e onde, por sua vez, há uma concentração de DNA em forma circular, composto por um ou dois cromossomos. Além do material genético responsável pela reprodução celular, as bactérias podem conter os plasmídeos, moléculas circulares e pequenas de DNA suplementares ao cromossomo principal e que são responsáveis pelas trocas ge- néticas entre uma bactéria e outra, facilitando o desenvolvimento de mecanismos de resistência bem como a sobrevivência em ambientes agressivos (BLACK; BLACK, 2021). Quer um macete para nunca confundir Gram positivo e Gram negativo em lâmina microscópica? Sempre que a bactéria estiver roxa na lâmina, é só lembrar que roxo é purple em inglês, palavra que começa com “P” de “positivo”. Dessa forma, todas as bactérias roxas serão Gram positivas. UNIDADE 1 25 Descrição da Imagem: a figura apresenta cinco dese- nhos representando a divisão celular bacteriana. Na primeira delas, uma bactéria em forma de bastonete tem um envoltório em amarelo que representa a parede celular e a membrana plasmática, e em seu interior, está o citoplasma em azul-claro. Disperso no citoplasma está o DNA, representado por um emaranhado de traços na coloração roxa, na região central da figura. O plasmídeo também está disper- so no citoplasma na extremidade esquerda inferior, representado por uma estrutura circular na cor lilás. Uma flecha na cor verde indica que a célula inicial pro- moveu a divisão do DNA, ao apontar para a segunda bactéria, a qual apresenta o emaranhado de traços roxos com o dobro de tamanho. Novamente, uma flecha verde leva para a terceira figura, indicando que a bactéria iniciou o processo de divisão celular, fato marcado pela duplicação, também, de plasmídeos (agora, existem duas estruturas circulares na cor lilás e cada uma se localiza em uma bactéria diferente). O envoltório amarelo inicia uma fissura, demonstrando que a bactéria está prestes a se dividir. Por último, duas flechas verdes e distintas indicam duas células bacterianas completamente separadas e idênticas à bactéria inicial e, assim, é revelado o processo final da divisão celular. Figura 5 - Bipartição ou divisão celular bacteriana A combinação desse maquinário bacteriano auxilia em todos os processos metabólicos elementares para a manutenção da bactéria, quando associado aos compostos nutritivos presentes e retirados do ambiente. A multiplicação bacteriana (Figura 5) ocorre por meio de sucessivos processos mitóticos nos quais a síntese de DNA é primordial, de forma que a interrupção da duplicação cromossomal impedirá, automaticamente, os outros processos de divisão de acontecer, pois a produção do pepti- deoglicano está ligada, de forma direta, à divisão celular (PIRES; ALMEIDA; COELHO, 2014). Como a troca de plasmídeos influencia o metabolismo bacteriano? O plasmídeo é um DNA circular extracromossômico possível de ser transferido de uma bactéria a outra por meio da conjugação ge- nética (contato direto), o que foi descoberto em 1946, por Joshua Lederberg. Ele misturou duas cepas diferentes de Escherichia coli que possuíam defeito em rotas metabólicas diferentes, característica que impedia o crescimento das cepas em determinados meios de cultura não enriquecidos. Ao inocular a mistura das cepas em um meio sem os compostos necessários para a proliferação, o pesquisador observou que, mesmo com a deficiência de nutrientes, houve crescimento de ambas as cepas. Você consegue imaginar o porquê? Ao compartilharem os seus plasmídeos, as cepas complementa- ram as rotas metabólicas defeituosas uma da outra, e o mecanismo evolutivo permitiu ao ambiente, antes inóspito, tornar-se favorável à sobrevivência. DNA / Material genético Plasmídeo 26 Descrição da Imagem: a figura apresenta uma fotografia e um desenho sobre a prova bioquímica ágar tríplice ferro. Na esquerda, há uma fotogra- fia colorida de dois tubos de ensaio, um deles é vermelho e o outro amarelo com duas grandes bolhas, uma no centro e outra na base do tubo, caracterizando a forma real de como esse ensaio seria visualizado. Na posição central, há o dese- nho de um tubo de ensaio preenchido com um composto na cor vermelha e, ao seu lado direito, estão escritos os açúcares presentes nesse tubo, respectivamente, de cima para baixo: lactose, saca- rose e glicose. No lado direito da imagem, existem três resultados possíveis para a prova bioquímica. O da extremidade superior direita contém um tubo preenchido com um composto vermelho e a le- genda “K/K (não fermentador)”. O da extremidade inferior direita é um tubo de ensaio preenchido com um composto amarelo com a legenda “A/A (fermenta os 3 carboidratos)”. O tubo entre esses dois apresenta coloração vermelha até a meta- de e, a partir daí até a base, apresenta coloração amarela da metade. A legenda desse tubo é “K/A (fermenta apenas glicose)”. Figura 6 - Reação de fermentação de açúca- res em meio ágar tríplice-ferro Fonte: Barbosa (202 0, on-line). UNICESUMAR Deve ser garantido o conjunto de condições para garantira proliferação das bactérias: atmosfera, temperatura, pH e fornecimento de substratos. Em relação à atmosfera adequada, a presença de oxi- gênio em altas ou baixas concentrações influencia, diretamente, as condições ótimas de crescimento. A maior parte das bactérias são classificadas como anaeróbias facultativas (reproduzem-se in- dependentemente da presença de oxigênio) por produzirem enzimas como a catalase e a desmutase, as quais detoxificam o ambiente de peróxidos e superóxidos que são formados durante o consumo de oxigênio. Bactérias como as do gênero Clostridium precisam de ambiente totalmente livre de oxigênio para proliferar, sendo classificadas, assim, como anaeróbias obrigatórias, enquanto outras, como as do gênero Mycobacterium, são aeróbias estritas, exigindo a presença de oxigênio às sobrevivência e reprodução (PIRES; ALMEIDA; COELHO, 2014). A presença de oxigênio ou não também influencia o tipo de metabolismo que o micro-organismo utilizará para a degradação dos substratos e geração de energia. Através da respiração aeróbica ou oxidação (realizada por bactérias aeróbias estritas ou aeróbias facultativas), as bactérias oxidam o composto orgânico utilizando o oxigênio como aceptor externo de elétrons. Por outro lado, na res- piração anaeróbica, o aceptor final serão moléculas de sulfato, nitrito ou carbonato. Ao passo que, na fermentação, há utilização de moléculas orgânicas em vez de oxigênio. Essa rota metabólica, inclusive, é muito utilizada pelos analistas nos testes bioquímicos bacte- rianos, afinal, esse processo leva à geração de piruvato por meio da glicólise, o qual pode originar, no meio de cultura, moléculas ácidas, como os ácidos acético, lático e butírico. O caráter ácido da reação pode ser observado a olho nu, pela mudança de coloração do meio de cultura, caso seja adicionado um indicador de pH com ponto de viragem abaixo de cinco (OSANTE; RUIZ, 2016). Na Figura 6, há um exemplo de como os indicadores de pH ajudam na interpretação de um resultado metabólico. UNIDADE 1 27 O meio de cultura ágar tríplice-ferro tem em sua composição três açúcares distintos (lactose, sacarose e glicose) que são separados naturalmente no meio de cultura por conta de suas densidades, de forma que a glicose é o carboidrato o qual permanece na base do tubo de ensaio, enquanto a sacarose e lactose permanecem na região inclinada do tubo, chamada de “rampa”. A partir do perfil de cor apresentado nesse meio após a incubação e provocado pela ação da bactéria, é possível analisar se o micro-organismo utiliza esses açúcares como fonte de carbono e se há produção de gás durante o processo. Isso só é possível porque, além dos açúcares, o indicador de pH vermelho de fenol é adicionado no meio de cultura, de forma que, ao utilizar os açúcares, o organismo produzirá derivados ácidos, e o indicador sofrerá a viragem de vermelho para amarelo. A produção de gás pode ser observada através da visualização de bolhas no meio de cultura (BARBOSA, 2020, on-line). As condições de temperatura e pH também são determinantes ao cresci- mento bacteriano. As chamadas bactérias termorresistentes, como algumas cepas de Escherichia coli, podem crescer em temperaturas que variam de 0 a 45oC; as psicotróficas conseguem se proliferar entre 0 e 20oC, como faz a Yersinia enterocolitica. Mas, em se tratando de generalidades, a maior parte das bactérias patogênicas é classificada como mesófila, pois apresentam temperatura ótima de crescimento entre 20 e 40oC (OSANTE; RUIZ, 2016). O fornecimento nutricional mínimo para o crescimento das bacté- rias é água, uma fonte de carbono (por meio dos carboidratos), nitrogênio (por meio dos aminoácidos), compostos iônicos, como: potássio, sódio e magnésio, e cofatores ou componentes de enzimas, tais como: ferro, zinco, manganês e cobre (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). A combinação de todos esses fatores auxilia pesquisadores, professores e analistas a realizarem as melhores escolhas na hora de desenvolver ou colocar em prática um método existente na rotina laboratorial. Conhecendo o mi- cro-organismo procurado, sabendo quais as suas exigências nutricionais, as melhores condições de incubação e os possíveis produtos metabólicos finais, é possível optar por métodos de cultivo e meios de cultura que forneçam dados suficientes para atestar a presença e, em alguns casos, a concentração desses micro-organismos em amostras clínicas. A escolha do meio de cultura para semeadura depende de alguns fatores importantes selecionados de acordo com a sua finalidade. Por exemplo, se- meaduras em tubos de vidro ou polipropileno contendo meio sólido (Figura 7) são comuns em testes bioquímicos ou em isolamento de colônias das quais já se conhece o agente microbiano. 28 UNICESUMAR Já as placas de Petri são mais utilizadas no isolamento de micro-organismos desconhecidos ou na contagem do número de bactérias em métodos quantitativos. Frascos de vidro contendo meios de cultura líquidos também podem ser utilizados no laboratório de microbiologia, principalmente para concentração de bactérias em etapas intermediárias de triagem. Na Figura 8, você consegue observar como esses meios são alocados em estufas bacteriológicas. Descrição da Imagem: a figura apresenta uma fotografia colorida de um meio de cultura. É possível visualizar uma mão esquerda que veste uma luva cirúrgica branca e segura dois tubos de plástico transparentes. No tubo do lado direito, na parte exterior, é possível visualizar marcações que vão do número cinco na parte inferior até o número 45 na parte superior. No interior dos tubos, visualiza-se um meio de cultura na cor bege. Na superfície do meio de cultura, observa-se o crescimento de uma colônia de aparência algodonosa e de coloração branca. Figura 7 - Meio de cultura sólido em tubo inclinado UNIDADE 1 29 Descrição da Imagem: a figura apresenta uma fotografia colorida do interior de uma estufa bacteriológica de incubação, estrutura semelhante a um forno com o revestimento interno em material semelhante ao alumínio. Nesse interior, uma prateleira superior guarda placas de Petri, as quais são recipientes em plástico e em forma circular com tampa. Aqui, elas contém um meio de cultura sólido na cor bege (semelhante a uma gelatina de consistência bem endurecida). Na segunda prateleira inferior, do lado esquerdo, constam, também, placas de Petri com meio de cultura e, à direita, frascos de vidro de, aproximadamente, 250 mL e com tampa azul contêm, em seu interior, um meio de cultura líquido na coloração amarela que preenche cerca de ¼ do seu volume total. Figura 8 - Organização de placas de Petri (à esquerda) e meios líquidos (à direita) em estufas bacteriológicas de cultivo Para conhecer ainda mais o assunto, observe o Quadro 2, onde estão relacionadas algumas caracte- rísticas dos meios de cultura e as suas particularidades. 30 UNICESUMAR Consistência Composição Frasco/Recipiente de cultivo/semeadura Utilidade Meio sólido Nutrientes, indica- dores de pH e ágar-ágar. Placa de Petri - Isolamento - Estudo das caracte- rísticas macroscópicas - Degradação de substâncias (hemólise, produção de halo) - Estudo de fermenta- ção de açúcares Tubo de vidro incli- nado - Estudo de fermen- tação de açúcares na parte anaeróbia - Consumo e degrada- ção de substâncias - Isolamento Meio líquido Água, nutrientes e indicadores de pH. Frasco de vidro - Obtenção de biomas- sa/inóculo - Etapas de enriqueci- mento Tubo - Estudo da fermenta- ção de açúcares - Estudo da descarbo- xilação de aminoácidos Meio semissólido Nutrientes, indi- cadores de pH, gelatina. Tubo - Estudo da motilidade - Degradação da gela- tina Quadro 2 - Características e finalidades dos meios de cultura baseadas em sua consistência Fonte: adaptado de Osante e Ruiz (2016). Estudo de motilidade? Obtenção de biomassa? Etapas de enriquecimen- to? Se junte a mim para dez minutinhos de vivência laboratorial. Venhaestudar e entender comigo o significado desses termos bem como a utilidade deles no laboratório de microbiologia. https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/14615 UNIDADE 1 31 A utilização e destinação corretas dos meios de cultura na rotina do laboratório influenciam, diretamente, a tomada de decisões, porque a interpretação correta, o isolamento de qualidade e a garantia de que os resultados obtidos se tratam, com toda certeza, da amostra analisada, pautam as etapas de identificação no caso de amostras que contenham resultados positivos. Os métodos de identificação são divididos em fenotípicos, moleculares ou proteômicos. Os métodos moleculares baseiam-se na amplificação do DNA por meio da reação em cadeia da polimerase. Este tipo de teste ficou muito conhecido após a popularização do nome do método utilizado no teste diagnóstico para o Sars-Cov-2, vírus responsável pela pandemia de Covid-19. O método deve ser considerado quando os testes bioquímicos de identificação não estão bem descritos ou quando abordam de cepas de baixa frequência, assim como bactérias de difícil cultivo ou crescimento lento (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Os métodos proteômicos, por sua vez, estudam o conjunto de proteínas produzidas a partir do genoma bacteriano. A identificação, nestes casos, ocorre pelas reações de eletro- forese, caracterizada pela migração diferencial de proteínas sob ação de um campo elétrico, ou espectrometria de massas, nesta, após ionização, as proteínas são separadas de acordo com o seu valor de massa e identificadas em um detector. A tecnologia Maldi-Tof (Matri- x-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-of-Flight) vem sendo utilizada há quase dez anos aplicando a espectrometria de massas para identificação bacteriana, comparando os resultados proteicos com os perfis anexados em uma extensa base de dados. Tanto os métodos moleculares quanto os proteômicos possuem alta sensibilidade e especificidade, no entanto o custo dos equipamentos, reagentes e insumos costuma ser muito elevado, dessa maneira, ambos só são aplicados em laboratórios de serviços altamente especializados (OSANTE; RUIZ, 2016). Para a rotina simples de um laboratório, os métodos fenotípicos costumam ser os mais acessíveis financeiramente, sem perder sensibilidade e acurácia. Eles consistem em testes bioquímicos que produzem alguma alteração visual de fácil observação, indicando, na maioria dos casos, os gêneros e espécies dos quais se tratam a positivação de determi- nada amostra. Esses testes envolvem desde técnicas simples, como a coloração de Gram, já abordada nesta unidade, até as mais complexas, como as provas bioquímicas da DNAse e a fermentação de açúcares (Figura 6) e, ainda, a descarboxilação de aminoácidos. A forma como uma bactéria se comporta em um meio de cultura, isto é, se ela: produz gás, muda de cor, produz halo de precipitação ou consumo, inibe o crescimento de outras bactérias ou produz substâncias metabólicas incomuns (por exemplo, sulfeto de hidrogê- nio) são algumas das características observadas nesses métodos. Chamados também de “protocolos de identificação”, os testes bioquímicos demandam experiência considerável do analista, além do conhecimento prévio das etapas de isolamento, assim como das con- dições de recebimento de amostras, qual o sítio ou região de onde ela foi retirada, se possui microbiota normal sujeita a interferir no resultado, inclusive, quais as condições da coleta quando essas informações estão disponíveis (OSANTE; RUIZ, 2016). 32 UNICESUMAR Mas todos esses perfis metabólicos e fenotípicos são expressos apenas nos meios de cultura ou podem ser reproduzidos, também, nos seres humanos infectados pelas bactérias? Por exemplo, é sabido que o Streptococcus pyogenes tem a habilidade de provocar hemólise no meio de cultura, mas isso significa que um indivíduo infectado por ele é capaz de ter as suas hemácias degradadas, levando a processos anêmicos ou hemorrágicos? É importante salientar que, diferentemente dos meios de cultura onde os nutrientes são oferecidos, praticamente, em livre acesso, o organismo humano tem habilidades imunológicas as quais, muitas vezes, reprimem a expressão tanto de proteínas quanto de enzimas bacterianas. Ao mesmo tempo, os pequenos organismos possuem algumas alternativas para escapar ou para enfraquecer o sistema imunológico, chamados fatores de virulência. Por isso, é hora de nos familiarizarmos com os conceitos de interações entre os micróbios e os hospedeiros, história natural da doença e mecanismos de patogenicidade (CARVALHO, 2010). Inicialmente, precisamos diferenciar os termos “colonização” de “infecção”, os quais são cons- tantemente confundidos, levando a conclusões errôneas sobre o processo patogênico. Enquanto a colonização bacteriana não interfere nas funções normais do corpo, a infecção é resultante de uma interação entre micro-organismo e hospedeiro que resulta em algum dano, seja ele produzido a partir dos efeitos bacterianos, como ação de toxinas, seja do próprio processo imunológico, como a Síndro- me Respiratória Aguda Grave, a SARS (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008), tão discutida durante a pandemia de Covid-19 e decorrente da exacerbação dos efeitos do sistema imune. A Anvisa publica diversos vídeos que podem ajudar na sua formação profissional. Te convido a assistir ao vídeo Teste fenotípico colorimétrico para detecção de carbapenemases, com o intuito de fixar, ainda mais, o seu conhecimento acerca dos testes bioquímicos bem como se familia- rizar com essa poderosa ferramenta de conhecimento. �https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/15471 UNIDADE 1 33 Por isso, para que uma desordem orgânica seja considerada, de fato, uma doença, são definidas fases pelas quais o indivíduo deve passar. À soma delas dá-se o nome de história natural da doença (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). São elas: 1. Período de incubação: intervalo entre a entrada do micro-organismo no hospedeiro e o início dos sintomas. É dependente do tipo de patógeno, do seu índice de crescimento, da carga bac- teriana de invasão e de questões de resistência do indivíduo. Dentro do período de incubação, podem ocorrer sintomas inespecíficos e incapazes de diferenciar uma doença da outra (por exemplo, ocorrência de febre), o que classifica, também, a fase prodrômica. 2. Doença ativa: período mais severo da doença, com aparecimento dos sintomas característi- cos e mais agressivos, incluindo o aparecimento das alterações imunológicas representativas (aumento ou queda de segmentados, por exemplo). Nesta fase, o hospedeiro costuma servir de reservatório das doenças transmissíveis direta ou indiretamente. 3. Período de declínio: os efeitos maléficos da infecção diminuem, de forma gradativa, ao passo que o sistema imune consegue combater a doença com mais facilidade. Mesmo assim, o hos- pedeiro ainda é passível de desenvolver problemas secundários. 4. Período de convalescência: o indivíduo é curado definitivamente, assim, ele recupera o seu estado pré-infecção. Em se tratando de desarranjos provocados por ação das bactérias, um dos fatores determinantes ao seu sucesso de patogenicidade são, definitivamente, os fatores de virulência: um conjunto de subs- tâncias, estruturas, enzimas ou mecanismos desenvolvidos pelos micro-organismos para suprimir ou driblar as atividades imunológicas (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). No entanto a expressão dos fatores de virulência depende das condições favoráveis no hospedeiro, fator que pode variar de um indivíduo para outro, dependendo de alguns fatores de predisposição, por exemplo, idade, sexo, con- dição imunológica, condições nutricionais, coexistência de doenças crônicas e uso de medicamentos contínuos (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Ademais, para que a doença, de fato, ocorra, além dos critérios citados anteriormente, os patógenos precisam encontrar alternativas para entrar no sistema humano, a fim de alcançar tecidos mucosos, onde encontrarão as melhores condiçõesde sobrevivência. Os tratos respiratório, gastrintestinal, ge- niturinário e conjuntivo são exemplos de tecidos e membranas mucosas presentes no corpo humano por onde as bactérias costumam adentrar, de forma que os patógenos são capazes de atingir o tecido -alvo através do ar, dos alimentos, da água, das superfícies contaminadas ou pelo contato sexual. A pele também é um importante veículo de inoculação quando não se apresenta íntegra, isto é, quando apresenta feridas preexistentes (BLACK; BLACK, 2021). A via parenteral, isto é, o contato direto com a corrente sanguínea através de agulhas e instrumentos de punção, pode ser uma fonte de infecção bem como é considerada uma das rotas mais críticas, afinal, o sangue entra em contato com todos os tecidos do organismo, facilitando o acesso dos patógenos aos locais-alvo. Picadas de insetos, cirurgias e punções venosas são algumas das condições as quais facilitam a entrada de bactérias por essa via (BLACK; BLACK, 2021). 34 UNICESUMAR Uma vez no organismo, os patógenos conseguem exibir os seus mecanismos de virulência, a fim de permanecerem naquele tecido ou região. A primeira habilidade a ser analisada é a capacidade de aderência ou de adesão das bactérias às células humanas, por meio de adesinas (flagelos, fímbrias, pili ou glicocálix) que interagem com receptores presentes no organismo humano (normalmente constituídos por carboidratos). Como exemplo, tem-se o Staphylococcus aureus, importante patógeno causador de doenças epidérmicas. Ele produz adesinas que se ligam, de forma direta, às fibronectina e laminina, proteínas presentes nas células da pele (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Outrossim, algumas espécies de bactérias também têm a capacidade de compor o biofilme (Figura 9), estrutura complexa formada por colônias bacterianas, matéria orgânica e adesinas que, além de aderir, firmemente, ao tecido-alvo, ainda cria um ambiente rico nutricionalmente para a sobrevivên- cia dessas colônias. Os biofilmes são importantes estruturas a serem estudadas, afinal, devido à sua composição, são resistentes à ação de sanitizantes, tornando instrumentos, cateteres, superfícies e, até mesmo os dentes, por meio das placas dentárias, sejam uma fonte ativa de micro-organismos. Além disso, é uma forma eficaz que colônias bacterianas encontram para se defender contra fagócitos, uma vez que macrófagos dificilmente conseguem transitar pelo material viscoso (ou polimérico) produzido nessa estrutura (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). O cuidado com a via parenteral deve ser bem estabelecido e estudado. Para você, futuramente, tenha condições de instruir profissionais acerca do assunto, sugiro que assista ao vídeo Principais Medidas de Prevenção de Infecção da Corrente Sanguínea e assimile os conhecimentos adqui- ridos até aqui. https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/15472 UNIDADE 1 35 A expressão de determinadas enzimas é um fator de virulência muito conhecido na bacteriologia, pois elas são capazes de digerir materiais — por exemplo, o ácido hialurônico — por meio de hialuroni- dases (destruindo, assim, as propriedades conectivas do revestimento epidérmico), produzir coágulos de defesa, como no caso de algumas espécies do gênero Staphylococcus e suas coagulases (Figura 10) e, até mesmo, destruir coágulos formados pelo próprio sistema imune, maneira como algumas espécies de Streptococcus — as quais produzem fibrinolisina ou estreptoquinases — encontram para degradar coágulos e invadir os tecidos. A produção de colagenases, principalmente em alguns anaeróbios, também é um importante fator de virulência, pois, por meio dessa produção, a bactéria é capaz de destruir o tecido conectivo de tecidos musculares (BLACK; BLACK, 2021). Estágios de formação de biofilmes Descrição da Imagem: a figura apresenta cinco desenhos que ilustram os estágios da formação de biofilme, representados em círculos esverdeados no sentido anti-horário, como se o observador estivesse olhando através de uma lupa. No estágio I, o círculo é preenchido pelo desenho de bactérias em forma de bastonetes e envoltas de estruturas esbranquiçadas semelhantes a pelos, chamadas de fímbrias e flagelos. No estágio II, as bactérias, as quais estavam livres no estágio I, começam a se empilhar, formando uma estrutura semelhante a uma parede de tijolos. Nos estágios III e IV, a parede de bactérias está maior e, entre um bastonete e outro, há uma grossa camada em cor bege, representando adesinas e matéria orgânica. No estágio V, a parede formada pelas bactérias começa a liberar alguns bastonetes para o meio, os quais se agregarão em novos biofilmes, iniciando um novo ciclo a partir do estágio I. Figura 9 - Estágios de formação de biofilmes 36 UNICESUMAR As bactérias são capazes, ainda, de utilizar nutrientes essenciais às células humanas, assim, adicionam mais um agravante para o organismo e influenciam o sucesso de sua patogenicidade. A capacidade de secretar sideróforos (proteínas capazes de extrair moléculas de ferro de transferrinas, ferritinas e lactoferrinas humanas), além de remover íons de ferro da circulação do hospedeiro, auxilia na utilização desse elemento no próprio metabolismo bacteriano (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Inúmeros micro-organismos podem produzir toxinas que contribuem para a expressão de sua patogenicidade. As exotoxinas afetam diversas funções celulares, inclusive, dentro desse grupo es- tão as conhecidas toxina diftérica, botulínica e tetânica, a Shiga toxina e a exotoxina A, responsável por estender infecções pulmonares em pacientes que apresentam fibrose cística (PIRES; ALMEIDA; COELHO, 2014). Os chamados superantígenos também são tipos de exotoxinas e são responsáveis por causar resposta imune muito intensa, uma vez que se combinam a proteínas presentes nos ma- crófagos, resultando em uma proliferação de células T. Como consequência, é gerada a liberação de grande concentração de citocinas, o que desencadeia episódios de febre e desordens gastrintestinais, nos casos mais graves, ocorrem choque e morte. A toxina estafilocócica é um exemplo de superantígeno muito estudado, além de ter muita importância médica (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Mesmo quando a defesa adaptativa do hospedeiro produz anticorpos, existem algumas bactérias capazes de variar as suas sequências antigênicas, driblando, também, esse mecanismo de defesa, por meio da alteração de seus antígenos superficiais. Isso ocorre na Neisseria gonorrhoeae, causadora da gonorreia: ela produz inúmeras cópias de genes Opa em sua multiplicação, resultando na expres- são de diferentes proteínas de superfície ao longo do tempo. Como citado anteriormente, a troca Descrição da Imagem: a figura apresenta uma fotografia colorida do fundo metálico de um tubo de ensaio transparente. Na base do tubo, há uma estrutura opaca, de formato esférico e aspecto gelati- noso, a qual caracteriza o coágulo formado pelas coagulases estafi- locócicas na presença de plasma. Figura 10 - Coágulo formado pela presença de enzimas coagulases produzidas por bactérias UNIDADE 1 37 Analisando todos esses passos, fica fácil de descobrir o porquê das etapas pré-analíticas serem tão passíveis de erro. Volte ao exercício do início desta unidade e reflita sobre os fatores que você incluiu como possibilidades pré-analíticas que poderiam influenciar o resultado final de ensaios. Considerou algumas dentre as citadas até aqui? de plasmídeos, principalmente do tipo R, tem a possibilidade de influenciar o desenvolvimento de resistência bacteriana frente a antibióticos ou à expressão de outros fatores de virulência, tais como toxinas termorresistentes (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). Então, querido(a) estudante, revisitando esses conceitos sobre a célula procariótica, as possíveis in- terações entre ela e o organismo humano e como ela influencia o desenvolvimento da doença ativa, foi possível entender por que é tão importante você, como profissional de saúde, ter domínio sobreo assunto? Com toda essa bagagem teórica, agora, precisamos estudar os critérios essenciais a serem seguidos após a confirmação de que a doença, realmente, está afetando a vida de um indivíduo e como o nosso trabalho pode agir, de forma positiva, na melhora. Partiremos para o estudo da etapa pré-analítica e da coleta, por meio da revisão dos já conhecidos conceitos de prevenção de contaminações e como esses dois estágios interagem entre si. É possível concluir o seguinte: pelo avanço dos processos tecnológicos de realização de ensaios e identificação de micro-organismos, a maior parte dos erros que acontecem em análises labo- ratoriais são voltadas às etapas pré-analíticas (GUDER; NARAYANAN; WISSER, 2001). A fase pré-analítica é marcada pela sequência de tomada de decisões e ações mediadas por diferentes profissionais das demais áreas da saúde que possuem interesses e focos muito específicos em relação aos resultados dos exames, tornando, assim, ainda mais complexo todo o processo, além de adicionar ainda mais pontos críticos (SBPC, 2014). Vamos imaginar, juntos, um cenário de trabalho? Um paciente chega ao hospital com sintomas característicos de infarto agudo do miocárdio, então, o plantonista vê a necessidade de pedir os exames de enzimas CK-MB, troponinas I e mioglobinas. O médico, como requisitante principal, precisa preocupar-se em descrever o exame como caráter de urgência, identificar esse paciente corretamente, expressar, com clareza, quais os exames que devem ser realizados, o tempo máximo que ele tem para receber os resultados e, ainda, correlacionar fatores (idade, peso, sexo e eventos prévios) antes de tomar qualquer decisão sobre o caso. Ao mesmo tempo, um profissional coletador (enfermeiro, técnico de enfermagem, biomédico, farmacêutico) precisa atentar-se a: requisitos técnicos da coleta, riscos de contaminação biológica de si mesmo e de contaminação cruzada da amostra, além de acondicionar, preservar e transportar a amostra com todo cuidado, garantindo a integridade dela até a chegada ao laboratório. E você, analista clínico(a) responsável, ao receber essa amostra no local de análise, deve atentar-se a: todos os critérios de controle de qualidade, preservação da amostra para os ensaios bem como a calibração correta de equipamentos. Somada a tudo isso, a agilidade na execução para obtenção rápida dos resultados. 38 UNICESUMAR Analisando todos esses passos, fica fácil de descobrir o porquê das etapas pré-analíticas serem tão passíveis de erro. Volte ao exercício do início desta unidade e reflita sobre os fatores que você incluiu como possibilidades pré-analíticas que poderiam influenciar o resultado final de ensaios. Considerou algumas dentre as citadas até aqui? Em se tratando de análises de rotina, aquelas onde as amostras são coletadas em laboratórios não hospitalares, ainda há um elemento a mais que pode ser fonte de questionamentos na obtenção de um resultado: o próprio paciente. Isso porque, dando a ele a autonomia da coleta (como ocorrem em coletas para espermograma e exames de urina, por exemplo), além de uma instrução de qualidade, dada por profissional capacitado, resta ao analista confiar na compreensão do paciente e na transpa- rência dele no que tange a não esconder informações relevantes. Em algumas situações, inclusive, talvez seja necessária a recusa automática de amostras, como no caso de materiais conservados em formalina, urinas colhidas com mais de 24 horas, amostras provenientes de cateter de Foley, frascos danificados e swab único com requisição para várias análises (BRASIL, 2000). Ademais, existem alguns materiais capazes de fornecer resultados questionáveis, as- sim, os analistas, junto ao corpo médico, devem encontrar alternativas ou medidas ao processamento dessas amostras. Uma sugestão de manejo desses casos encontra-se no Quadro 3, a seguir. Tipo de amostra Alternativa de análise Swab de amostra de queimadura Processar biópsia ou aspirado Swab de úlcera de decúbito Processar biópsia ou aspirado Swab de abscesso perirretal Processar biópsia ou aspirado Swab de lesão de gangrena Processar biópsia ou aspirado Swab de lesão periodontal Processar biópsia ou aspirado Swab de úlcera varicosa Processar biópsia ou aspirado Vômito Não processar Material de colostomia Não processar Ponta de cateter de Foley Não processar Aspirado gástrico de recém-nascido Não processar Quadro 3 - Medidas para ensaios de amostras provenientes de fontes questionáveis / Fonte: adaptado de Brasil (2000). UNIDADE 1 39 Frente a isso, discutiremos, agora, alguns requisitos e critérios para coleta, trans- porte e armazenagem das principais amostras clínicas que podem ser recebi- das no laboratório de microbiologia, uti- lizando as recomendações descritas pela Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/ Medicina Laboratorial (SBPC, 2014) e pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL, 2000): Preparações pré-coleta: recipientes estéreis e impermeáveis devem ser utili- zados para toda e qualquer coleta desti- nada a análises microbiológicas, a fim de evitar resultados falsos-positivos, seja qual for a bactéria identificada. Para amostras coletadas em ambiente hospitalar, é im- portante ter, ao menos, a preparação dos seguintes requisitos: • Requisição médica com a descrição do exame, quando aplicável. • Frasco(s) de coleta identificado(s) com o nome do paciente ou identifi- cação interna única e legível. • Para coleta hospitalares, identifica- ções adicionais como número do quarto e ala também podem ser úteis. • Profissional de coleta ou recebimento da amostra. • Horário da coleta. • Local anatômico da coleta. • No caso de exames de urina, sinalizar se a amostra é aleatória ou a primeira urina da manhã. • Volume de amostra coletado, se pos- sível. • Descrição do material coletado (san- gue, urina, líquor). • Descrição do uso ou não de antibió- ticos, quando aplicável. 40 UNICESUMAR Preparações para coleta: é adequado que os procedimentos de cole- ta, por sua vez, sejam extensivamente revisados, de forma periódica, principalmente no caso de atualização das tecnologias de análise. Os métodos devem ser desenvolvidos e treinados pelos coletadores; o uso de Equipamentos de Proteção Individual (EPIs) — luvas e jalecos — é praticamente imprescindível. As condutas a serem seguidas dependerão da amostra biológica a ser obtida, como veremos, a seguir. Coleta de urina: de modo geral, os frascos de coleta direcio- nados para urocultura são diferentes daqueles direcionados à uri- nálise, no entanto é importante que ambos sejam estéreis e que as recomendações de coleta sejam seguidas. Sumário de urina, exame simples de urina, uroanálise, urinálise, urocultura e exame de urina tipo I são alguns dos sinônimos utilizados para denominar esse exame nas requisições médicas. Para fins de urinálise (análise de presença de bactérias, sem identi- ficação, mas associada a padrões bioquímicos), o tipo de amostra mais comum é a primeira urina da manhã. Para fins de urocultura, a amostra coletada pode ser aleatória ou obtida por procedimentos invasivos, como a punção suprapúbica, no caso de crianças ou de pacientes sem controle esfincteriano. UNIDADE 1 41 A antissepsia é obrigatória antes da coleta, visto a existência de micro- biota normal dos aparelhos genitais femininos e masculinos, dessa forma, a instrução completa é imprescindível. Além disso, deve-se instruir o paciente a coletar o jato médio (porção intermediária da extrusão de urina), a fim de evitar contaminações derivadas da própria microbiota ou a concentração excessiva de sedimentos urinários, como cristais, os quais dificultam a visualização bacteriana em exames a fresco. É importante que o tempo decorrido entre a coleta e a entrega do material no laboratório seja inferior a duas horas, para evitar a prolife- ração bacteriana bem como a superestimação de resultados quantita- tivos. Quando as análises não forem realizadasnesse prazo, a amostra deverá ser refrigerada e protegida da luz por até 12 horas e nunca deve ser congelada. A coleta pode ser obtida, também, via sonda vesical (Figura 11), a qual deve ser higienizada, externamente, com álcool 70% e nunca devem ser retiradas amostras contidas em bolsas coletoras. É importante que o laboratório tenha uma política escrita detalhando as suas condições de rejeição de amostras. 42 UNICESUMAR Cateter de Foley Bolsa Coletora de Drenagem Bolsa de Coleta Externa Descrição da Imagem: a figura apre- senta o desenho de um paciente huma- no com um cateter ligado diretamente em sua uretra, chamado cateter de Foley, ilustrado como um tubo de cali- bre fino e cor branca. Na saída inferior desse cateter, existe uma bolsa de co- leta azul em posição vertical, chamada bolsa coletora de drenagem, que está presa à perna desse paciente por meio de faixas brancas horizontais, seme- lhantes a um esparadrapo. Na bolsa, estão desenhados, na parte central, pequenos riscos azuis que indicam o volume de urina. Na saída inferior da bolsa, há um tubo de calibre médio na cor azul conectando-se, de forma di- reta, à outra bolsa, chamada de bolsa de coleta externa, ilustrada de forma semelhante à bolsa coletora de drena- gem, mas a de coleta externa apresen- ta-se presa a uma estrutura externa em formato da letra “L” de ponta-cabeça, nessa estrutura é coletada a amostra de urina para análise. Figura 11 - Coleta de sonda vesical Coleta de líquor: as coletas de líquido cefalorraquidiano são indicadas aos diagnósticos de meningoen- cefalites. O material deve ser estritamente coletado em ambiente hospitalar por profissionais médicos treinados e seguindo protocolos rígidos de execução, devido à complexidade de sua obtenção. Antes da coleta, deve ocorrer a antissepsia do local onde a punção lombar será realizada. O volume de amostra varia entre 6 e 12 mL para adultos, 4 e 8 mL para crianças e 2 e 3 mL em lactentes e recém-nascidos. Com o objetivo de conhecer melhor o procedimento, acompanhe-me na Figura 12. UNIDADE 1 43 Posição para punção lombar Agulha inserida no espaço subaracnóideo Coletando o líquido cefalorraquidiano para testes laboratoriais Descrição da Imagem: a figura apresenta três desenhos que ilustram os procedimentos para coleta de líquor. No primeiro desenho, localizado do lado esquerdo, há uma figura de um indivíduo deitado de lado. No segundo desenho, no centro, há a representação da coluna vertebral na região lombar, de forma que, dentro da espinha dorsal, vê-se um canal na cor amarela em posição vertical, repre- sentando a dura máter. Dentro dela, em azul, está o líquido cefalorraquidiano. A imagem de uma agulha atingindo a ponta na região azul representa a punção realizada na região lombar para coleta do líquor. No terceiro desenho, localizado do lado direito, por fim, um profissional aparece coletando o líquido que goteja da parte distal da agulha. Figura 12 - Representação de uma coleta de líquor Na etapa número 1, o paciente é colocado em decúbito lateral (de lado). Depois, na segunda etapa, o profis- sional médico insere a agulha na região do espaço subaracnóideo na coluna, na região lombar. Em seguida, o profissional coleta o líquido cefalorraquidiano que começa a gotejar pela saída posterior da agulha. É adequado que a amostra chegue em período inferior a duas horas após a coleta, principalmente em casos de alta concentração de glicose no material, com o intuito de evitar a superestimação na contagem bacteriana ou a degradação de analitos por ação dos micro-organismos, o que impactaria as análises bioquímicas, as quais podem ser executadas no mesmo material. Coleta para hemocultura: a decisão sobre o tempo de coleta entre amostras — porque dificilmente o laboratório receberá apenas uma hemocultura por paciente — e os frascos adequados ficam sob a responsabilidade do médico, pois é o profissional e não o laboratório quem tem acesso aos dados epidemiológicos e fisiológicos do paciente. A antissepsia do local da coleta bem como a utilização de materiais estéreis, além de proteger o paciente, evitam a ocorrência de resultados falso-positivos por meio de contaminação da amos- tra provinda da microbiota epidérmica (Corynebacterium spp., Micrococcus spp., Bacillus spp. e Propionibacterium acnes). Ainda, se o processo analítico é realizado por sistemas automatizados de monitoramento, o risco de contaminação está apenas relacionado à inoculação da amostra nos frascos de cultura, enquanto os métodos tradicionais de execução são acrescidos da possibilidade de contaminação durante o processamento da amostra. O volume de amostra deve ser adequado, a fim de evitar resultados falsos-negativos, uma vez que a sensibilidade dos exames depende da quantidade de amostra obtida. É recomendado coletar de 20 a 30 mL de sangue no adulto e de 1 a 5 mL ou até 1% de sua volemia em crianças, apesar de alguns autores recomendarem até 4% da volemia. Dependendo do micro-organismo de suspeita, diferentes tipos de frascos são direcionados à coleta, afinal, a composição interna dos recipientes fornece suporte para a viabilidade deles (existem frascos para isolamento de bactérias aeróbias, anaeróbias, fungos, micobactérias e, também, com resinas Figura 13 - Processo de transferência de amostras para hemo- cultura 44 UNICESUMAR aniônicas e catiônicas para adsorção de antibióticos). Os coletores, normalmente, realizam o proce- dimento com seringas comuns, depois, transferem o material aos frascos específicos de hemocultura, como na Figura 13. Quanto ao procedimento laboratorial de diagnóstico, abordaremos melhor na unidade de doenças sanguíneas. Descrição da Imagem: a figura mostra uma fotografia co- lorida de um profissional da saúde vestindo um jaleco azul e calçando luvas cirúrgicas brancas. Em sua mão esquerda, ele segura um frasco de paredes transparentes, semelhan- te a uma pequena garrafa, que possui em seu gargalo um envoltório de proteção na cor verde, ao qual o profissional transfere o sangue coletado. O sangue provém de uma se- ringa branca, segurada pelo profissional com a mão direita. Também é possível observar, na extremidade inferior da ima- gem, um frasco metálico preenchido com algodões brancos. Amostras podem ser obtidas de dispositivos intravasculares — cateteres, portocaths — mas eles são associados a maiores taxas de contaminação (até 10%). Em caso de frascos danificados, mal identificados, com destinação incorreta (requisição do exame para anaeróbios e a coleta realizada em frasco para aeróbios, por exemplo) e volume inadequado devem ser recusados pelo laboratório. Coleta de escarro: normalmente, serão requisitadas e recebidas duas amostras de escarro para inves- tigações de tuberculose. É comum que elas sejam obtidas, também, de ambiente hospitalar, assim como a hemocultura e o líquor. O paciente deve lavar a boca abundantemente com bochechos a base de água, depois, a tosse precisa ser forçada para obtenção do material; o escarro deve ocorrer diretamente no frasco de coleta, sendo altamente não recomendável a transferência do material clínico em mais de um recipiente. É recomendado que a amostra esteja livre ou contenha pouquíssimas quantidades de saliva, pois esse tipo de material possui microbiota rica. Materiais provenientes de aspirado transtraqueal, lavado broncoalveolar e secreção traqueal também podem ser obtidos, mas, neste caso, apenas por equipe médica especializada. Ponta de cateter: envolve a realização de ensaios importantes que determinam a relação entre colonização do cateter e ocorrência de sepse (infecção sanguínea ou generalizada). A rigorosa antis- sepsia com álcool 70% deve ser realizada ao redor do cateter, seguida por solução de iodo a 1% ou PVPI a 10%. Normalmente, é cortada a parte distal do cateter (cerca de 5cm), e o pedaço de cortado é adicionado a um frasco estéril. De modo geral, a contagem acima de 15 UFC (unidades formadoras de colônia)nesse tipo de material caracteriza o cateter como fonte da infecção sanguínea. Secreção de orofaringe: assim como o caso do escarro, essa secreção é um material passível de contaminação pela microbiota da saliva, por isso, o material é obtido via coleta laboratorial UNIDADE 1 45 especializada. Esse tipo de amostra depende da experiência do coletador para a obtenção de resul- tados fidedignos, afinal, o swab precisa passar em regiões onde exista a presença de pus e placas. Ainda, é possível obter materiais como: líquidos pleural, ascítico e biliar via punção percutânea ou cirúrgica com material estéril. Quanto maior o volume da amostra, maior a probabilidade de isola- mento do agente etiológico. Não menos importante: após a coleta e independentemente do material clínico, é imprescin- dível que, na hora do transporte, o profissional confira se todos os frascos estão bem fechados e identificados. O intervalo entre coleta e realização dos ensaios, via de regra, é de, no máximo, duas horas, salvo os casos explicitamente determinados. Recomenda-se que, quando as amostras forem coletadas em tubos, permaneçam na posição vertical. Se utilizadas caixas térmicas, elas devem simbologia de risco biológico. A grande maioria das amostras pode ser transportada entre 22 e 25ºC, mas, caso seja identificada a necessidade de refrigeração, é mais adequado utilizar gelos artificiais, como gelox, em vez de gelo natural. Com toda a informação e conhecimento adquiridos até agora, você, aluno(a), seria capaz de explicar o que aconteceu no caso dos pobres Tarantino e Scorsese, incluindo os seus atípicos resultados laboratoriais? Quando o analista da microbiologia realizou a leitura das duas amostras e percebeu que ambas vinham do mesmo quarto, mas não condiziam com o quadro clínico dos pacientes, a resposta do laboratório foi apenas uma: é necessária uma recoleta, porque as amostras dos pacientes Tarantino e Scorsese não foram devidamente identificadas, portanto, tornou-se muito provável a troca entre o material biológico de um e de outro. Lógico, tal situação rendeu uma bronca memorável para o setor de coletores, além de mais cuidado na obtenção de amostras clínicas. Chegamos até aqui para fixar mais uma importante informação: a nossa habilidade laboratorial pode ser primorosa, mas se o cuidado com a análise não for realizado desde o primeiro contato com esse paciente, as etapas seguintes, certamente, serão impactadas. As habilidades e o conhecimento envolvendo a coleta de materiais são mais do que essenciais ao profissional da saúde aspirante ao trabalho em ambiente laboratorial. A decodificação correta de in- formações, importantíssima para identificação de erros, quando associada ao conhecimento prévio de todas as etapas de preparo e execução de coleta, conferem a você a segurança necessária para executar e interpretar análises e, ainda, discutir tanto possibilidades quanto cenários se você estivesse frente a uma situação como a do início da unidade, envolvendo a troca de amostras. O conhecimento a fundo da célula bacteriana e de como ela se comporta no ambiente laboratorial são habilidades essenciais para quem pretende atuar na bacteriologia. Por exemplo, sabendo que as bactérias do gênero Streptococcus dificilmente crescem em meios de cultura pobres em nutrientes, você jamais autorizará um resultado para Streptococcus pyogenes se os métodos utilizados ao isolamento dela não envolverem técnicas com meios enriquecidos. Ao mesmo tempo, sabendo que o gênero Clostridium é estritamente anaeróbio, você também teria a plena confiança de executar as análises para a pesquisa desse patógeno com técnicas anaeróbicas de crescimento. Por isso, é bastante recomendável que tratemos com gentileza os conteúdos introdutórios e de revisão, sabendo que a aplicação deles servirá não só para aprofundarmos os nossos aprendizados nas unidades se- guintes, mas com a certeza de que o domínio dos conceitos auxilia em uma execução laboratorial de qualidade. 46 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA Ausência de Eucariontes Parede celular Peptídeoglicano Coloração de Gram Citoplasma Proteômicos Moleculares Fenotípicos Material cromossômico (DNA) Testes bioquímicos de identificação Ribossomos e proteínas Presença de Procariontes(Archea e Bacteria) É hora de você relacionar, aqui, todos os conceitos importantes que aprendeu e revisou nesta uni- dade. Os Mapas Mentais são importantes ferramentas que nos ajudam a lembrar rapidamente de algumas coisinhas que podem ficar lá no fundo da memória, algumas vezes. Vamos lá! 47 1. Em relação ao que você aprendeu até aqui sobre a estrutura e a organização das células pro- carióticas e eucarióticas, assinale a alternativa correta: a) Os procariontes são organismos unicelulares que possuem alta complexidade celular com presença de membrana citoplasmática, membrana nuclear, ribossomos e complexo golgiense. b) O plasmídeo é um tipo de DNA cromossômico utilizado pelas bactérias para os processos de conjugação e que auxilia no desenvolvimento de resistência bacteriana. c) o DNA bacteriano pode conter um ou dois cromossomos e fica localizado dentro do núcleo dos procariontes. d) Os eucariontes e procariontes diferenciam-se, principalmente, em relação à membrana cito- plasmática. Enquanto os eucariontes as tem, os procariontes não. e) As bactérias são classificadas como procariontes e não possuem membrana nuclear. No en- tanto apresentam grande quantidade de ribossomos para produção de proteínas, membrana citoplasmática e parede celular. 2. A respeito do conteúdo estudado nesta unidade, assinale a alternativa correta: a) A coloração de Gram pode ser usada no laboratório para identificar bactérias em termos de gênero e espécie. b) Os métodos bioquímicos ou métodos de identificação genotípica diferenciam os micro-orga- nismos em eucariontes e procariontes. c) Micro-organismos aeróbios estritos só se reproduzem e se desenvolvem em ambiente com presença de oxigênio. d) O gênero Staphylococcus é um exemplo de anaeróbio estrito. e) O melhor meio de cultura para isolamento de bactérias é o meio líquido, porque ele é capaz de fornecer maior quantidade de água a bactérias e fungos. 48 3. Com base nos estudos realizados, leia as afirmações, a seguir: I) Os métodos moleculares e proteômicos de identificação possuem alta sensibilidade e especi- ficidade e costumam ser muito baratos, por isso, podem ser aplicados na rotina laboratorial. II) Os métodos fenotípicos de identificação bacteriana são amplamente aplicados em laboratórios e têm sensibilidade satisfatória. III) Alguns métodos fenotípicos de identificação envolvem: fermentação de açúcares, produção de gás e descarboxilação de aminoácidos. IV) A adição de indicadores de pH não é indicada em métodos fenotípicos de identificação bac- teriana, pois alteram a composição dos meios de cultura. Está correto o que se afirma em: a) III e IV, apenas. b) II e III, apenas. c) II e IV, apenas. d) II, III e IV, apenas. e) I, III e IV, apenas. 4. A respeito dos requisitos das etapas pré-analíticas na coleta de amostras, assinale a alternativa correta: a) Requisição médica para exames, identificação dos tubos de coleta. b) Aguardar o paciente receber a antibioticoterapia, identificação de tubos de coleta. c) Requisição da enfermaria para o exame, calibração de equipamentos. d) Teste de equipamentos diagnósticos, diluição de amostras. e) Preparo do material de transporte, coleta de sangue. 5. Em relação à coleta de amostras, assinale a alternativa correta: a) Para coletas de urina, o procedimento de punção supra-púbica é o mais indicado porque não envolve ambiente hospitalar. b) Por não se tratarem de amostras estéreis, o sangue e a urina podem ser coletados em frascos não esterilizados. c) O volume ou quantidade de amostra coletada não influencia o resultado final em exames de hemocultura. d) A coleta de urina executada pelo paciente deve serprecedida de instruções específicas para minimizar o risco de alterações pré-analíticas. e) O laboratório pode executar mais de uma análise por swab, desde que o paciente autorize os exames. 2 Esta unidade o ajudará a relembrar a estrutura funcional e organi- zacional do sistema urinário humano, a resgatar seus conhecimen- tos acerca do tratamento de amostras de urina e a solucionar os problemas envolvendo a sua análise microbiológica. Aprenderá a classificação das infecções urinárias, os principais agentes etiológi- cos, seus mecanismos de patogenicidade e, principalmente, viven- ciará a rotina da bacteriologia. Você se aperfeiçoará em relação aos procedimentos laboratoriais utilizados, as técnicas de cultivo, seus objetivos e se preparará para desenvolver e aplicar metodologias de análise microbiológica em amostras de urina com facilidade e confiança. Aspectos Microbiológicos, Clínicos e Laboratoriais das Infecções de Trato Urinário Oportunidades de Aprendizagem Me. Suelen Eloise Simoni UNICESUMAR 50 Imagine que você está assumindo a escala matutina do laboratório de microbiologia. Realizou a desinfecção das superfícies de trabalho, separou os materiais estéreis para serem utilizados naquele dia, se planejou em relação ao recebimento de novas amostras e já está pronto para assumir as res- ponsabilidades do turno anterior, afinal, na microbiologia, devido às necessidades específicas de crescimento das bactérias, a rotina nunca para. Você escolhe primeiro retirar as incubações do dia anterior da estufa bacteriológica a fim de reali- zar as leituras nas placas de Petri, e ao abrir a incubadora se depara com um fato bem incomum: das quatro placas incubadas, três delas apresentam o mesmo tipo de micro-organismo em crescimento. As placas são de ágar CLED e as colônias apresentam-se esverdeadas, quase metálicas, mas não estão completamente redondas, tendo um aspecto mais rugoso. Ao perceber que todas tratam de amostras provenientes de pacientes e materiais biológicos diferentes (uma amostra de urina, um aspirado brônquico, um swab de garganta e um líquor), você fica atento à possibilidade de ter havido uma contaminação em massa, sem saber ao certo de onde estaria vindo esta contaminação. Baseado em seus conhecimentos prévios e ao estudo da unidade anterior, eu convido você a pensar sobre isso. Você acha que as bactérias são mais propensas a crescerem em determinadas amostras biológicas do que outras? Será possível uma única bactéria ser capaz de contaminar tantas amostras em curto intervalo de tempo? E será que existe um micro-organismo tão potente e resistente que possa de fato causar tanta confusão? UNIDADE 2 51 Dentre as infecções que ocorrem em ampla faixa etária em indivíduos humanos, as que acometem o trato urinário representam uma grande parcela, sendo responsáveis por 30 a 50% das infecções adquiridas em hospitais gerais, e é provável que todas as mulheres em idade entre 15 a 55 anos terão ao menos um epi- sódio de infecção urinária ao longo da vida. Além disso, o sistema urinário é o grande filtro da fisiologia humana, e o cuidado com o seu estado é de grande importância, uma vez que infecções renais graves podem evoluir para insuficiência do órgão e acarretar em consequências para todo o organismo. Ainda, os patógenos que acometem o sistema urinário possuem muita relevância na saúde pública, uma vez que estes mesmos organismos desenvolvem mecanismos de resistência seríssimos frente a antibióticos. Sabendo agora que o estudo do sistema urinário e seus acometimentos infecciosos são de suma importância para trabalhadores e pesquisadores em saúde, voltemos à situação anterior em que você é responsável pelo laboratório de microbiologia do período da manhã. Ainda intrigado com os resultados obtidos em sua placa de Petri, você decide contatar o seu colega de trabalho do dia anterior, Indiana Jones, para entender melhor o que pode ter acontecido. Este seu colega, sempre muito preocupado em desvendar mistérios e casos instigantes, descreve que processou a amostra de líquor inicialmente, seguida da amostra de urina, e por último o swab e aspirado brôn- quico, mas a incubação foi realizada em conjunto. Além disso, seu colega Jones se perdeu na rotina, e acabou semeando as quatro amostras em ágar CLED, o qual é mais aplicável para análises em urina, e não tão comum para os outros tipos de amostra. Por isso você decide investigar isso tudo melhor. É hora de começar: acesse o Módulo IV do manual da Agência Nacional da Vigilância Sanitária Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos disponível no QR Code a seguir e procure pelo ágar CLED (Cystine Lactose Electrolyte Deficient) no sumário. Leia sobre este meio de cultura, anotando informações sobre sua descri- ção, utilidade no laboratório de microbiologia e modos de interpretação. Atente-se, principalmente, nas características de crescimento deste meio de cultura e como essas informações podem respaldar a sua pesquisa laboratorial. Além de conhecer as bactérias, o que elas provocam e quais os seus sítios de ação no organismo humano, é importante começarmos a assimilar a utilidade que os meios de cultura e seus nutrientes fornecem e como podemos utilizar estas informações para complementar a nossa investigação labo- ratorial. Utilizando sua pesquisa como suporte, neste momento convido você a refletir: baseado nos dados que tem até agora, você é capaz de sugerir qual micro-organismo pode ter crescido nestas três amostras? E como você chegou a essa conclusão, isto é, quais foram os dados coletados que ajudaram você a escolher essa determinada bactéria como agente etiológico das três amostras? Não se esqueça de utilizar seu Diário de Bordo para as anotações mais relevantes. https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/18681 UNICESUMAR 52 Por mais que o laboratório de microbiologia seja capaz de atender a uma ampla gama de materiais biológicos, processando-os com o mesmo cuidado e compromisso, é crucial que saibamos primeiro que, independentemente do tipo de amostra recebida, sempre a trataremos de forma isolada, consi- derando todos os fatores que possam envolver sua coleta, mas também, em relação às pré-disposições deste material. Isso envolve como e de onde ele é retirado, se a amostra possui naturalmente nutrientes para crescimento de um tipo específico de bactérias, se possui mecanismo inibidor para proliferação de outras, se no local coletado há microbiota normal e se houver, qual a composição dessa massa biológica. No caso das infecções do trato urinário, devemos associá-las também ao sistema genital, uma vez que estão estritamente relacionados, desta forma, as infecções que ocorrem em um dos sistemas podem facilmente disseminar ao outro. Para fixar melhor o conteúdo, vamos intensificar nosso estudo por hora, apenas no trato urinário, tratando das infecções genitais e sexualmente transmissíveis na Unidade 4. Inicialmente, precisamos relembrar como o sistema urinário atua fisiologicamente, para que futuramente seja mais fácil associar esse funcionamento à ocorrência de colonização e infecção por patógenos. O sistema urinário é representado pela Figura 1 e consiste em condições fisiológicas normais, de dois rins, os quais são constituídos por milhões de néfrons e glomérulos. Estas unidades são res- ponsáveis pela filtração ativa e seletiva do sangue, selecionando alguns íons e substâncias para serem excluídos ou reabsorvidos no organismo, como sódio, potássio, cálcio, cloro, água, glicose e proteínas. UNIDADE 2 53 O líquido restante desta filtração constitui a urina, a qual passa por ductos coletores e é direcionada para o ureter. Ambos ureteres, direito e esquerdo, conduzem a urina até a bexiga que direciona a urina produzida até a uretra, que é a estrutura responsável pela extrusão deste material. Considerando os mamíferos, nas fêmeas, a uretra exterioriza a urina diretamente para o ambiente externo. Nos machos, noentanto, o canal de passagem da urina e do líquido seminal é a mesma, e por essa razão, válvulas fisiológicas estão presentes nos locais onde as uretras entram na bexiga, prevenindo o contrafluxo de urina para os rins (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Descrição da Imagem: a imagem possui dois desenhos. O desenho à esquerda representa o sistema urinário feminino, desenhado em corte frontal ou coronal, de forma que o sistema está compreendido na parte abdominal e pélvica. Os rins são representados em formato de feijão e na cor marrom, estando logo abaixo da glândula suprarrenal (que possuem formato triangular e são rugosas) e próximos e inferiores ao diafragma. A comunicação com o sistema circulatório acontece por meio da artéria aorta, estrutura em vermelho e de calibre grande, que se ramifica em artérias renais, e da veia cava inferior, vaso de calibre também grande em azul, e ponto onde desembocam as veias renais. De cada rim, saem estruturas em forma de pequenos cilindros verde-claros, chamados ureteres, os quais terminam em uma única estrutura, a bexiga urinária. A bexiga, em sua parte mais inferior, forma uma estrutura em forma de cilindro e de calibre bem reduzido, constituindo a uretra. A figura do lado direito representa um corte frontal dos rins, que é revestido por uma fina camada chamada cápsula renal. Logo abaixo dela, tem-se o córtex renal, uma parte espessa que fica em torno da medula renal, região onde se abrigam os glomérulos renais e onde ocorre a produção da urina. O líquido filtrado na região medular desemboca em uma única região chamada de pelve renal, que após reunir todo o volume de urina produzido, a despeja para um único canal, o ureter. Figura 1: Esquema do sistema urinário. / Fonte: Black e Black (2021, p. 1640). As infecções do trato urinário, chamadas de ITUs, normalmente são iniciadas por uretrites e cis- tites, inflamações da uretra e da bexiga, respectivamente. O tratamento ou cuidado destas infecções deve ser considerado essencial, afinal, na insuficiência de medidas de controle, as infecções do trato urinário inferior podem evoluir para pielonefrites, infecções renais de caráter praticamente sistêmico e de difícil tratamento. Nos homens, tem tendência de evoluir para prostatites. A entrada do micro-organismo no sistema urinário pode ser pela via hematogênica, via linfática ou via ascendente. A via linfática é a mais rara de todas, contudo, o acesso à região renal por bactérias UNICESUMAR 54 pode ocorrer por meio de vasos linfáticos que conectam os intestinos aos rins. A via hematogênica (através do sangue) também é possível, afinal, a grande vascularização do rim pode favorecer o acesso de agentes microbianos ao trato urinário, sendo a via mais comum nas infecções por bactérias como Staphylococcus aureus e Mycobacterium tuberculosis (BRASIL, 2000), mas a forma mais recorrente de contaminação costuma ser externa (via ascendente) de forma que, bactérias da microbiota normal da região genital ou retal, por conta da proximidade com a uretra, são capazes de migrar para o sistema urinário. Na abertura externa da uretra existe uma microbiota normal, que nas mulheres é composta por bactérias do gênero Streptococcus sp., bactérias anaeróbias e alguns Gram-negativos. Para homens, a presença de bactérias nos ductos urinários é mais rara, mas já se tem conhecimento de que alguns organismos dos gêneros Propionibacterium sp. e Corynebacterium sp. podem habitar as vesículas seminais e serem encontrados na urina mesmo na ausência de ITUs (BLACK; BLACK, 2021). Desta maneira, não é incomum que a urina analisada em rotina laboratorial tenha naturalmente alguns micro-organismos, no entanto, estes só são capazes de causar infecções ativas em caso de oportunismo bacteriano ou vulnerabilidade do indivíduo (TORTORA; FUNKE; CASE, 2021). A presença destas bactérias, entretanto, somadas às condições de umidade e calor apropriadas para o crescimento bacteriano podem favorecer a proliferação e infecção por estes micro-organismos. Além disso, a ocorrência das ITUs pode depender de fatores ligados ao sexo. Volte à Figura 1 e observe o sistema genitourinário feminino e reflita: você consegue imaginar uma razão para existirem diferenças na ocorrência de ITUs entre homens e mulheres? Nas mulheres, por possuírem uretra de comprimento mais curto (cerca de 4 cm) e mais próxima da região perianal (que é rica em microbiota Gram-negativa), a frequência de ITUs é bem maior do que nos homens (cerca de 40 a 50 vezes mais), afinal, o acesso à entrada do sistema urinário é, portanto, mais facilitada nesse grupo (BLACK; BLACK, 2021), contudo o organismo feminino possui a vantagem de manter o pH das áreas genitais extremamente ácido, por meio da presença de ácido lático produzido por Lacto- bacillus da microbiota normal, os quais, ainda, produzem peróxidos que inibem o crescimento de outros gêneros bacterianos. Acompanhe a Figura 2 para conhecer melhor todos os mecanismos de ação benéficos exercidos pelos Lactobacillus na saúde feminina: 1. Essas bactérias encontram-se dispersas na mucosa vaginal e a partir da produção de peróxidos (compostos antimicrobianos) podem suprimir a proliferação de bactérias patógenas; 2. A presença desses bacilos no epitélio vaginal também impede a invasão de bactérias prejudiciais; 3. Os Lactobacillus ainda conseguem ativar mediadores de imunidade que combatem a presença de patógenos; 4. Em detrimento da sua organização, essas bactérias conseguem isolar nutrientes e impedir que bactérias maléficas se reproduzam; 5. Além de isolarem nutrientes, esses bacilos também são capazes de neutralizar micro-organis- mos prejudiciais; 6. Por meio da produção de ácido lático, conseguem reduzir o pH da mucosa vaginal, tornando o ambiente desfavorável para alguns patógenos. UNIDADE 2 55 Descrição da Imagem: na imagem há um desenho que representa a mucosa vaginal; células ovais com o centro roxo (núcleo) delimitam o epitélio, e nelas, constam algumas bactérias azuis em formato de bastonete. Indicado por números, estão os mecanismos de ação dos Lactobacillus; no número 1, as células azuis emitem peróxidos, representados aqui por espirais na cor preta, que atacam outra célula em bastão, na cor vermelha que representa o patógeno. No número 2, os Lactobacillus estão aderidos às células ovais, protegendo-as. Na etapa 3, os bastonetes azuis produzem mediadores de imunidade, desenhados aqui na forma de triângulos na cor cinza. No número 4, as bactérias láticas impedem que a bactéria patógena atinja nutrientes, desenhados na forma de esferas vermelhas. No número 5, cinco Lactobacillus envolvem uma bactéria prejudicial, a impedindo de se espalhar pelo epitélio. Por fim, no número 6, um bastão azul produz ácido lático bem em cima das células epiteliais, representado por quadrados na cor amarela. Figura 2: Mecanismos de defesa exibidos pelos Lactobacillus na mucosa vaginal / Fonte: adaptada de Nutergia (2020 ) . A presença de Lactobacillus é tão importante para a saúde da mulher, que quando os níveis de estró- geno diminuem por ocorrência da menopausa, há aumento na incidência de infecções urinárias, afinal, a diminuição do hormônio também reduz a oferta de glicogênio pelas células genitais femininas, diminuindo o substrato das bactérias para a produção de ácido lático. Além do mais, o próprio fluxo unidirecional da urina também previne a ocorrência de infecções urinárias de forma efetiva em ambos os sexos (BLACK; BLACK, 2021). A apresentação clínica das ITUs inferiores normalmente envolvem disúria (dor e queimação ao urinar) e emergência/frequência urinária. Cerca de um quarto destas infecções progride para cistites crônicas, que envolvem dor pélvica muito mais intensa. O desconforto ao urinar contribui para o UNICESUMAR 56 esvaziamento incompleto da bexiga, fato que irá intensificar a infecção, pois a urina funciona como reservatório para o crescimento bacteriano (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Você já ouviudizer que "segurar o xixi" é prejudicial? A retenção de urina influencia fortemente na ocorrência das ITUs. A urina contém grande concentração de sais e substratos para a proliferação bacteriana e isso, combinado à temperatura corporal, favorece o crescimento e multiplicação de bactérias no trato urinário. Como já estudamos na unidade anterior, o processo de coleta e preservação de amostras também é ponto crítico para análises em urina. Em casos de urocultura, é preferível que seja coletado o jato médio da primeira urina do dia, após um processo de higienização com água e sabão das genitálias, em ambos os sexos. A bactéria Mycobacterium smegmatis, que é um micro-organismo que vive na parte externa da genitália de homens e mulheres, e que em caso de limpeza inadequada ou ineficiente, pode ser erroneamente identificado na urina como agente patológico, podendo ser confundido com o Mycobacterium tuberculosis, o causador ativo da tuberculose renal caso os processos de higienização e limpeza pré-coleta não sejam realizados adequadamente (BLACK; BLACK, 2021). Além disso, é preferível que estas amostras cheguem ao laboratório imediatamente ou ao menos refrigeradas, porque por mais que o pH naturalmente ácido da urina consiga inibir levemente a pro- liferação bacteriana, quando em temperatura ambiente, este mecanismo químico não é muito eficaz, resultando em dois desfechos que interferem no resultado final: 1. A proliferação de bactérias promoverá um grande número de várias espécies de bactérias, quando o mais comum em casos de ITU é ter grande quantidade de uma única espécie. 2. Alteração dos parâmetros bioquímicos no caso de coleta de urina para urinálise, isto é, consumo de glicose pelas bactérias, podendo resultar em ensaio falso-negativo para glicose; aumento do pH por degradação da ureia pelas enzimas bacterianas chamadas ureases; conversão de nitrato em nitrito e alteração destes analitos nas amostras. Isso ocorre pois, inclusive nos indivíduos mais saudáveis, na parte distal do trato urinário, próximo a saída da uretra, é natural que se tenha uma colonização de bactérias (Escherichia coli e Lactobacillus na maioria das vezes), e estas, mesmo em condições consideradas como “assépticas” (higienização as genitálias antes da coleta do jato médio), durante a micção é possível que algumas sejam transferidas para a urina (BLACK; BLACK, 2021). UNIDADE 2 57 A presença de bactérias na urina é chamada de bacteriúria, mas a contagem de micro-organismos não indica necessariamente que uma doença esteja em evolução. Isto é, quando constatada a presença de agentes microbianos na urina, o paciente pode ser classificado em dois grupos distintos: sintomáticos e assintomáticos. Essa denominação influencia no prognóstico do paciente, isto porque, enquanto sintomáticos necessitam de tratamento imediato, o grupo sem sintomas usualmente é curado espon- taneamente em 25% dos casos (BRASIL, 2000). Para entender melhor as infecções e mensurar o impacto delas na saúde do paciente, elas são clas- sificadas como cistites, pielonefrites e glomerulonefrites. A cistite é a famosa “infecção de bexiga”, e o diagnóstico não depende apenas da urocultura, mas também alguns sinais apresentados na urinálise, como aumento de leucócitos e presença da esterase leucocitária, uma enzima produzida pelas células de defesa que pode ser detectada na urina em caso de infecções. Na Figura 3, você pode obser- var como os leucócitos se apresentam em amostras de urina, sendo estruturas esféricas, translúcidas e com inúmeros grânulos em seu interior (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Você lembra que estudamos os métodos de coleta em crianças? Para exames microbiológicos de urina neste grupo há uma grande dificuldade para aquelas que não possuem o controle esfinc- teriano, sendo a sondagem vesical ou a punção suprapúbica indicadas nesses casos, no entanto, pelos procedimentos serem invasivos, a coleta por meio de saco coletor pode ser uma alternativa, mas possui uma alta taxa de resultados falso-positivos. Por conta disso, é importante que nestas ocasiões, a bolsa de coleta seja trocada de 30 em 30 minutos. Para crianças maiores que já possuem controle da micção, mesmo com a possibilidade de contaminação pela microbiota, a coleta da urina por jato intermediário é mais aplicável. Descrição da Imagem: na figura há uma foto de uma lâmina em microscópio em formato circular, com molduras pretas. O fundo da imagem é branco e em toda sua extensão há cír- culos preenchidos com grânulos que podem ser observados, caracterizando os leucócitos. Figura 3: Lâmina em técnica “a fresco” de amostra de urina apresentando leucócitos e hemácias. Fonte: Shutterstock ([2023a], on-line). UNICESUMAR 58 A pielonefrite, por sua vez, é considerada como uma evolução da cistite. Existem 25% de chance de uma cistite evoluir para pielonefrite, resultando na inflamação dos rins, tanto isoladamente como em ambos, nos casos mais complicados. Por se tratar de um problema um pouco mais grave, os pacientes costumam apresentar sintomas clínicos sistêmicos como febre, e desfechos mais preocupantes como bacteremia (presença de bactérias na corrente sanguínea). Além disso, em situações de fracasso no tratamento, pode haver fibrose renal e consequente insuficiência do órgão (BLACK; BLACK, 2021). Quanto à glomerulonefrite, diferente da pielonefrite, não se trata da evolução de uma infecção do trato urinário, e sim, da deposição de imunocomplexos produzidos durante uma infecção estrep- tocócica sistêmica. Também chamada de doença de Bright, o distúrbio pode ocorrer após a infecção sanguínea por cepas nefrogênicas do Streptococcus pyogenes, que possuem componentes em seu envoltório celular que mimetizam proteínas presentes nos glomérulos renais. Ao produzir anticorpos contra o revestimento bacteriano, quando o complexo antígeno-anticorpo chega aos rins, os anticorpos contra a bactéria passam a atacar também as células glomerulares devido a sua semelhança, provocando inflamação e dano intenso aos glomérulos renais. Diferente dos distúrbios citados anteriormente, na urocultura de um paciente com glomerulonefrite isolada, ou seja, sem a ocorrência paralela de pielo- nefrite e cistite, não é comum de se encontrar o agente causador (Streptococcus pyogenes) na amostra coletada. Uma representação deste fenômeno está ilustrada na Figura 4. Descrição da Imagem: um glomérulo renal é representado na imagem por meio de um desenho. A estrutura é envolta por uma membrana na cor verde, e em seu interior, constam sistemas de filtração, representados por células disformes na cor azul. Em volta da membrana e aderidas a ela, pequenas estruturas em vermelho de bordas pontiagudas representam complexo imune que se liga ao glomérulo configurando a glomerulonefrite. Figura 4: Deposição de imunocomplexos na glomerulonefrite / Fonte: adaptada de Leon (2018). UNIDADE 2 59 O que você acha de explorar melhor o seu co- nhecimento nas doenças renais? O Atlas Digital de Microscopia da Unicesumar possui um ban- co de dados riquíssimo em imagens de lâminas teciduais, desde órgãos em estado normal, até visualizações histopatológicas de processos in- flamatórios e infecciosos. Comece analisando o tecido saudável Agora, observe as diferenças dele para outro com processo de glomerulonefrite ativo: A B A investigação de amigdalites estreptocócicas é sempre considerada, afinal, a habilidade deste micro-organismo de produzir proteínas que mimetizam o envoltório de células humanas pode gerar reação imunológica também nas células das válvulas cardíacas, dando origem à conhecida febre reumática. A leptospirose, doença de acometimento majoritariamente animal, pode também ser transmitida a humanos causando sérios danos renais. Não se tem ainda elucidado o mecanismo pelo qual o Leptospira interrogans, agente etiológico desta patologia, age frente às células renais humanas, mas sabe-se que este micro-organismo vive nos túbulos renaisde alguns animais como ratos e cachorros, e por ser um local privilegiado em relação à fisiologia animal, a bactéria é capaz de se reproduzir e permanecer longos períodos nos rins de seus hospedeiros, estando presente na urina do animal por muito tempo. O contato direto de abrasões epidérmicas com a urina dos hospedeiros por meio de rios, lagos, reservatórios, solo ou piscinas, ou mesmo seu consumo, leva a bactéria a se alojar na mucosa superior do sistema digestório, adentrar ao sistema circulatório e, em uma a duas semanas, sintomas como dores de cabeça, dores musculares, calafrios e febre aparecem, e por serem sintomas altamente inespecíficos, o diagnóstico pode não ser concluído corretamente. Nos rins, podem ocorrer danos tubulares, como nefrite intersticial e necrose com evolução para insuficiência, por formação de imunocomplexos (BLACK; BLACK, 2021). Na Figura 5, é possível observar a morfologia incomum desta bactéria, sendo ela em forma de espiral, lembrando fios de telefones antigos. https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/15473 https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/15474 UNICESUMAR 60 E quanto aos agentes etiológicos mais comuns têm-se as bactérias da família Enterobacteriaceae como Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae e, principalmente, a Escherichia coli. Estas bactérias Gram-negativas podem estar presentes na microbiota intestinal, e, muitas vezes, residentes nas regiões perianais, e devido ao seu local de colonização, acabam tendo acesso mais facilitado à parte distal da uretra (SOLBERG; AJIBOYE; RILEY, 2006). Dentre elas, a Escherichia coli é a que mais merece atenção, afinal, ela possui uma série de fatores de virulência que a auxiliam em sua atividade, mecanismos estes que já são conhecidos há mais de vinte anos (SCHLAGER et al., 1995). A E. coli uropatogênica (UPEC) é capaz de gerar os chamados “com- plexos intracelulares de comunidades bacterianas”, uma espécie de biofilme de resistência e proteção a estes micro-organismos, uma vez que eles conseguem colonizar as células da bexiga. Essa capacidade de agrupamento é devido à expressão de proteínas fimbriais e produção de adesinas, que além de formarem os biofilmes, ainda possuem característica filamentosa de ligação às células do trato urinário (SOLBERG; AJIBOYE; RILEY, 2006). Além do mais, a característica inerente desta bactéria ao apresen- tar o Antígeno O em seu revestimento celular já a confere habilidades importantes também contra o sistema imunológico humano, uma vez que essa estrutura promove uma barreira protetora contra a deposição do sistema complemento durante a resposta imunológica (MIAJLOVIC; SMITH, 2004). A Escherichia coli pode também produzir uma substância chamada aerobactina, um sideró- foro (proteína sequestradora de ferro) formado por duas moléculas de lisina e uma de citrato, ca- paz de extrair o ferro, no estado ferroso, das células humanas. Esta proteína, através de receptores membranares específicos faz a internalização do ferro para o citosol da bactéria, tornando-o Descrição da Imagem: na imagem existem duas fotos em preto e branco tiradas diretamente de microscópio óptico. À esquerda, a foto identificada como “A” possui um fundo acinzentado e o micro-organismo Leptospira interrogans pode ser visto em formato de espiral, semelhante a um abridor de tampa de cortiça, em coloração esbranquiçada. À direita, na foto identificada como “B”, há uma aproximação desse micro-organismo, que possui sua membrana/revestimento levemente franzida e numa coloração branca mais pálida e opaca. Figura 5: Leptospira interrogans em microscopia eletrônica de varredura. Fonte: adaptada de Bharti et al. (2003). UNIDADE 2 61 Ficou muito complicado? Na Unidade 1 estudamos a estrutura da parede celular, se ne- cessário, acesse suas anotações acerca do assunto, não será a última vez que falaremos da parede celular bacteriana, tudo bem? disponível para auxiliar na multiplicação bacteriana, intensificando ainda mais a infecção inclusive em ambientes pobres de ferro, como é o caso da urina (MABECK; ORSKOV; ORSKOV, 1971). Esta espécie também produz hemolisina, proteína que provoca a lise de eritrócitos e outras linhagens celulares, ativando a liberação de citocinas e apresentando propriedades pró-inflamatórias e causa- doras de lesão tecidual (JOHNSON, 1991). Essa habilidade bacteriana está representada na Figura 6. Descrição da Imagem: na imagem, há uma foto de Placa de Petri circular, preenchida com uma estrutura gelatinosa em vermelho, que representa o Ágar sangue. Disperso nele estão bactérias circulares de coloração amarela e alaranjada. Ao redor das bactérias há um envoltório incolor que contrasta com o fundo vermelho da placa, indicando a hemólise das hemácias presentes no ágar sangue. Figura 6: Placa de Ágar sangue com bactéria produtora de hemolisina. Fonte: Shutterstock ([2023b], on-line). O gênero Pseudomonas, também do grupo das Gram-negativas, são potenciais causadoras de ITU e agregam um risco a mais aos pacientes: este gênero é altamente resistente à ação de antimicrobianos. Os beta-lactâmicos, como penicilinas e suas variações, são amplamente aplicados nos tratamentos das ITUs devido ao anel beta-lactâmico, estrutura formada por três carbonos e um nitrogênio, que inibe um grupo de proteínas bacterianas chamadas PBPs (do inglês, penicillin binding-proteins). Estas proteínas são responsáveis por realizar a ligação entre as cadeias de peptideoglicano da parede celular. Agora, observe a Figura 7, na qual encontramos a estrutura molecular da amoxicilina, um dos beta- -lactâmicos mais utilizados no mundo, e tente descobrir qual parte é o famoso anel beta-lactâmico responsável pelo mecanismo de ação deste medicamento. UNICESUMAR 62 Tenho certeza de que você não teve dificuldades para encontrar o anel beta-lactâmico responsável pelo mecanismo de ação deste grupo farmacológico, certo? Então vamos pensar juntos: o desenvolvi- mento de mecanismos de bloqueio a estes agentes seria uma importante fonte de resistência para os agentes etiológicos, pois é justamente isso que as bactérias do gênero Pseudomonas são capazes de fazer. A Pseudomonas aeruginosa é produtora de beta-lactamases, enzimas que clivam os anéis beta-lactâmicos impedindo assim a sua ação, e estas enzimas são codificadas por genes presentes em plasmídeos (está lembrado que discutimos sobre eles na unidade anterior?), sendo responsáveis assim pela persistência das infecções causadas por este gênero. Estas bactérias, que possuem ainda uma capacidade de formação de biofilmes incrível, podendo manterem-se aderidas a instrumentos cirúrgicos, e após procedimentos pélvicos invasivos, podem colonizar e futuramente infectar as células do sistema urinário (BLACK; BLACK, 2021). No grupo das Gram-positivas, a bactéria coagulase negativa chamada Staphylococcus sa- prophyticus é o agente etiológico mais comum das ITU na família dos estafilococos. A bactéria pode ser um integrante da microbiota vaginal e é responsável por infecções do trato urinário em mulheres jovens e adultas, pacientes os quais costumam responder rapidamente ao uso de antimicrobianos, e por isso, as infecções têm curta duração, no entanto o índice de reincidência não é pequeno (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Outra espécie, o Staphylococcus epidermidis, também pode ser o causador de ITUs, principalmente em situações hospitalares nas quais os pacientes utilizam cateteres de demora (BLACK; BLACK, 2021). Descrição da Imagem: na figura há a representação química espacial da amoxicilina. A parte responsável pelo mecanismo de ação é o chamado anel beta-lactâmico, que na imagem é representado por um quadrado tendo em dois de seus vértices grupamentos de carbono e hidrogênio (C-H) e nas outras duas pontas, de maneira colateral, uma molécula de nitrogênio e uma carbonila (Carbono ligado ao oxigênio por uma ligação dupla). Figura 7: Estrutura molecular da amoxicilina / Fonte: Shutterstock ([2023c], on-line).UNIDADE 2 63 Pela diversa possibilidade de agentes etiológicos, o tratamento das ITU pode ser desenvolvido de forma estratégica. Segundo as diretrizes da Sociedade Americana de Doenças Infecciosas, o uso de nitrofurantoína de 50 a 100mg/dia é o primeiro tratamento de escolha, devido a sua segurança e alta eficácia, principalmente nos casos de cistite. Este medicamento age provocando danos no DNA bacteriano e inibindo a síntese de proteínas. A administração de norfloxacino (de 200 a 400mg/dia) também é uma opção como terapia alternativa, no entanto, as quinolonas são mais indicadas em caso de pielonefrite. Seu mecanismo de ação envolve a inibição de enzimas da multiplicação e divisão bacteriana, e o desenvolvimento de mecanismos de resistência frente a essa classe farmacológica é de grande preocupação, e por essa razão é que são utilizadas com mais cautela (NICOLLE et al., 2005). Voltemos a sua situação no laboratório de microbiologia e o mistério das placas de ágar CLED. Você considerou algumas das bactérias que estudamos até aqui em sua pesquisa? Agora que você as conhece um pouco melhor, teria condições de afirmar com mais confiança sobre a sua conclusão? Você já consegue citar algum mecanismo de ação bacteriano que possa reafirmar a possibilidade de contaminação das amostras? A partir desta unidade vamos tratar das análises laboratoriais de forma mais direta, considerando que já estudamos e refletimos sobre os requisitos necessários para execução dos ensaios. Assim, vamos aceitar que todos os fatores discutidos na Unidade 1 (requisição médica e suas especificações, condição de coleta e transporte) foram cumpridas e que estamos aptos a executar as análises de forma segura e garantida. São necessários dois procedimentos primordiais no laboratório de microbiologia quando tratamos de urocultura: a contagem de bactérias na urina e a posterior identificação delas. Os métodos de contagem são divididos em semiquantitativos e quantitativos. Representando os métodos semiquantitativos, o laminocultivo é uma escolha importante por facilitar a semeadura e transporte, além de possuir conservantes que permitem que a amostra per- maneça estável por cerca de seis meses (BRASIL, 2000). Na Figura 8 você pode observar como esse produto se apresenta comercialmente. Descrição da Imagem: na imagem há uma foto de três frascos de laminocultivo. Os tubos são cônicos, transparentes e de tampas cinzas. Eles encontram-se na horizontal, com a tampa do tubo voltada para a esquerda. Internamente há uma placa em formato retangular, contendo o meio de cultura, no qual, há círculos vermelhos e azuis, representando as colônias de bactérias. Figura 8: Recipientes para laminocultivo. Fonte: adaptado de Laminocultivo DP (2016). UNICESUMAR 64 O laminocultivo consiste em um recipiente plástico, semelhante a um tubo de ensaio de cerca de 40 mL, que possui em seu interior um suporte plástico contendo meio de cultura em suas duas faces. A urina pode ser diretamente despejada neste frasco, ou semeada por meio de swab embebido de urina recentemente homogeneizada, e depois este material é incubado em atmosfera normal (isto é, com presença de oxigênio) a 35° ± 2 °C, durante 18 a 48 horas. Ele é considerado como semiquantitativos, pois a leitura do ensaio resultará em uma contagem estimada (BRASIL, 2000). Observe a Figura 9 para entender como funciona este processo. 102 103 104 105 106 Descrição da Imagem: a figura possui o desenho de cinco retângulos verticais que representam a lâmina do laminocultivo. Em cada retângulo estão desenhados círculos pretos, de forma que, quanto maior a quantidade de círculos, maior é presumida a contagem na amostra testada. Começando do lado esquerdo, no primeiro retângulo, onde há quatro círculos pretos, abaixo do retângulo está o número 10². Ao lado no segundo retângulo onde há vinte e um círculos pretos, abaixo está o número 10³. Ao lado no terceiro retângulo onde há vários círculos pretos, abaixo está o número 10⁴. Ao lado no quarto retângulo onde há vários círculos pretos, abaixo está o número 10⁵. E por último do lado direito no quinto retângulo onde há vários círculos pretos, preenchendo todo o retângulo, abaixo está o número 10⁶. Figura 9: Interpretação de resultados em laminocultivo. / Fonte: adaptada de Uribac (2020). Cada retângulo da imagem representa uma lâmina de laminocultivo, e os círculos pretos que se encontram dispersos nas lâminas são representações das Unidades Formadoras de Colônia (UFC) encontradas na amostra inoculada. Como não se sabe ao certo o volume de material adicionado, a contagem final de micro-organismos será estimada de acordo com o estabelecido pelos fornecedores dos ensaios, de forma que, quanto mais colônias aparecem nas faces das lâminas, maior será a sua contagem estimada. Usando a Figura 9 como exemplo, caso uma amostra de urina apresentasse 20 colônias no laminocultivo, como na segunda lâmina da figura, a contagem estimada para este material seria 10³ UFC/mL. Este tipo de ensaio está disponível no mercado por diversos fornecedores, sendo de ampla utiliza- ção em laboratórios de pesquisa e diagnóstico. A conveniência deste tipo de análise também se revela quando observada a vastidão de meios de cultura que podem ser empregados, os quais possibilitam muitas vezes a identificação direta dos micro-organismos mais comumente encontrados em amostras de urina, facilitando ao médico a escolha da terapêutica mais indicada para aquele paciente, no entanto UNIDADE 2 65 o método apresenta algumas desvantagens, principalmente porque dificulta a observação de culturas mistas (mais de um tipo de micro-organismo) e por não fornecer contagem exata de micro-organis- mos, apenas estimada (BLACK; BLACK, 2021). Outro método indireto que é amplamente aplicado na rotina laboratorial é o chamado “Dipstick” ou Fitas de urina (Figura 10). Estes testes são complementares à contagem e pesquisa de micro-or- ganismos, estão disponíveis por diversas marcas e consistem em fitas impregnadas com reagentes para reações específicas, e em se tratando de aplicação em microbiologia, estes instrumentos revelam a presença de dois componentes importantes em urinas potencialmente contaminadas com patógenos: esterases leucocitárias, liberadas pela alta concentração de leucócitos na urina indicando estados de inflamação/infecção, e nitrito, produto de redução do nitrato por ação de enzimas bacterianas. Estes testes são de fácil observação, uma vez que nas suas próprias embalagens vêm descritas as mudanças visuais que ocorrem nas fitas reagentes na presença destes compostos, como mostrado na Figura 10. Cada ensaio é identificado por uma cor e normalmente, quanto mais intensa a cor, maior a concen- tração do composto correspondente (BRUNATI; PINI; COLZANI, 2010). Descrição da Imagem: na figura há uma foto com um frasco de tiras reagentes à esquerda, cilíndrico na cor preta e em seu rótulo, estão desenhados quadrados coloridos, de forma que, cada quadrado representa a revelação de um tipo de ensaio. À direita, há um frasco de coleta em formato cilíndrico, transparente, sem tampa, com mais da metade de seu volume preenchido com um líquido amarelo, representando urina. Figura 10: Fitas reagentes para ensaios químicos em urina. Fonte: Shutterstock ([2023d], on-line). Quanto às técnicas quantitativas, para análise de urina elas podem ser por meio de semeadura com alça microbiológica calibrada, ou por inoculação de um volume específico de material bioló- gico. Nas técnicas de espalhamento por alça, primeiramente, é necessário que aprendamos esse importante instrumento laboratorial. Como você pode observar na Figura 11, a alça bacterioló- gica consiste em uma haste de metal na qual em sua ponta, há uma circunferência, normalmente esterilizável e constituída de platina, que possui diâmetro compatível com volumes específicos. Isto significa que, quando mergulhada em alguma amostra, a alíquota retirada será “aprisiona-da” em toda a área formada por essa circunferência metálica, que possui volume fixo, e assim as contagens microbianas realizadas nas placas serão convertidas em contagens por mililitros ou microlitros de material biológico de acordo com esse determinado volume (BRASIL, 2000). UNICESUMAR 66 Uma vez o material retirado de seu recipiente de coleta, ele pode ser semeado na superfície de meios de cultura específicos para patógenos esperados na urina. É indicado que as alças possuam volume de 0,01 mL quando esperadas contagens superiores a 100 UFC/mL de amostra. Uma vez que a alíquota é retirada, a alça bacteriológica deve ser pousada delicadamente sobre o meio de cultura e, inicialmente, o analista faz uma linha reta bem no centro da placa de Petri, e depois por meio de sucessivas passagens em ângulo de 90 graus através dessa linha original, movimentando a ponta da alça para cima e para baixo, o material é espalhado. Após a incubação em estufa bacteriológica com condições de umidade e temperatura adequados, o resultado final é semelhante à Figura 12. Descrição da Imagem:Na imagem de fundo branco é possível visualizar uma alça bacteriológica, que consiste em uma haste prateada e em sua ponta há um círculo metálico responsável pela coleta de alíquotas de amostras. Figura 11: Alça microbiológica utilizada em procedimentos em bacteriologia. / Fonte: Shutterstock ([2023e], on-line). UNIDADE 2 67 Outro método amplamente utilizado para contagens microbianas é o método pour plate ou inoculação por profundidade. Nele, uma alíquota de amostra homogênea pura ou diluída é adicionada em volume conhecido diretamente sobre uma placa de Petri. O meio de cultura, após fundido e ambientado entre 45 e 40 °C, é vertido sobre a amostra. O analista clínico deve homogeneizar essa mistura por meio de movimentos delicados e circulares. Depois do meio solidificado, ele pode ser incubado em condições de temperatura e umidade ótimas para pro- mover o crescimento bacteriano. Este método possui uma pequena vantagem sobre o anterior pelo melhor espalhamento e distanciamento das colônias, e a possibilidade de se diluir amostras com altas contagens sem perda de sensibilidade do ensaio (BRASIL, 2000). Descrição da Imagem: na imagem há uma foto de uma placa de Petri repleta de colônias coloridas (brancas, beges e vermelhas) formando uma espécie de tapete de bactérias, resultantes de inoculação por esgotamento. Um indivíduo calçando luvas cirúrgicas brancas segura a Placa de Petri com a mão esquerda. Figura 12: Placa de Petri com crescimento bacteriano após técnica de inoculação por esgotamento. Fonte: Shutterstock ([2023f], on-line). UNICESUMAR 68 É importante que o laboratório tenha também um protocolo de identificação para os micro-organis- mos encontrados. Essa identificação pode ser realizada paralela a contagem ou posterior a ela, tudo depende do meio de cultura utilizado para os ensaios e qual o grau de especificidade que se procura. Dentre os meios de cultura que podem ser aplicados, três deles chamam mais atenção para análises de urina: o ágar MacConkey, o ágar EMB (do inglês eosin methilene blue) e, principalmente, o ágar CLED (do inglês cystine lactose eletrolyte deficient). Tanto o ágar MacConkey quanto o EMB são di- ferenciais para crescimento de micro-organismos Gram-negativos, uma vez que estes são os maiores causadores de ITUs. No geral, estes meios possuem componentes inibidores de Gram-positivos, uma fonte de carbono e energia (normalmente a lactose), um indicador de pH para revelar a fermen- tação ou não do açúcar presente no meio, e uma fonte de nitrogênio proveniente de extratos de carne. O ágar CLED, por sua vez, é mais amplamente utilizado. Primeiramente porque além de não inibir o crescimento de Gram-positivos (como vimos anteriormente, mesmo que em menor incidência ainda podem causar infecções urinárias), ainda possui menor concentração de eletrólitos, o que inibe a proliferação exacerbada de bactérias do gênero Proteus. Este grupo de bactérias, quando crescem em meios de cultura nutritivos, são responsáveis por um fenômeno chamado “swarming” (Figura 13), no qual, forma uma espécie de véu na superfície do meio de cultura, dificultando a contagem de outras bactérias. O ágar CLED também permite o crescimento de leveduras do gênero Candida, auxiliando também no diagnóstico de ITUs causadas por fungos (BRASIL, 2000). Como conteúdo de fixação, assista e ouça ao vídeo elaborado pela The University of British Columbia por meio do QR Code a seguir, para ter uma leve ideia de como são realizadas as técnicas em pour plate no laboratório. Aumente o volume, ative as legendas e aproveite para aprender esta técnica. Para acessar, use seu leitor de QR Code. https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/15475 UNIDADE 2 69 O ágar CLED, inclusive, foi o meio de cultura escolhido pelo seu colega Indiana Jones como meio de cultivo para as amostras que você retirou da estufa. Você, aluno conseguiu perceber a importância de se conhecer os meios de cultura e suas aplicações? Você acha que se o seu colega não tivesse usado o meio CLED para semear amostras diferentes de urina, o mesmo fenômeno teria acontecido? Também são possíveis as aplicações de meios de cultura cromogênicos (CHROMagar Orientation® e CPS ID2® e CPS ID3®) que, ainda que possuam alto custo de aplicação na rotina, fornecem resultados mais rápidos, por revelarem por meio da coloração das colônias a identificação presuntiva de espécies e agentes (CIRAGIL et al., 2006). Você pode observar a variedade de micro-organismos identificáveis na Figura 14: 1. Colônia roxa, brilhante com o centro mais escuro corresponde a Escherichia coli; 2. Colônias beges e opacas indicam Staphylococcus aureus; 3. Colônias lilases e pequenas indicam Staphylococcus saprophyticus; 4. Colônias pequenas em azul turquesa correspondem ao gênero Enterococcus; 5. Colônias amareladas e com aspecto de véu, vocês já sabem, indicam presença de Proteus spp; 6. Colônias azuis escuras e de aparência metálicas podem indicar bactérias dos gêneros Klebsiella, Enterobacter e Serratia. Descrição da Imagem: na figura, há uma foto de uma placa de Petri que tem semeada em sua superfície uma bactéria, a qual forma uma película esbranquiçada na superfície do meio de cultura, possuindo ainda um ponto central semelhante a um alvo. Figura 13: “Swarming” ou crescimento em véu de bacté- rias do gênero Proteus em ágar chocolate. Fonte: Shutterstock ([2023g], on-line). UNICESUMAR 70 Descrição da Imagem: na imagem é apresentada uma foto de uma placa de Petri contendo meio de cultura sólido na cor branca. Nele estão semeadas seis colônias coloridas, e cada cor corresponde a um tipo de micro-organismo ou gênero bacteriano. As colônias estão numeradas de um a seis e dispostas em sentido crescente e horário nas cores roxa escura, bege, lilás, azul turquesa, amarela e azul escura. Figura 14: Diferenciação de bactérias em ágar CHROMagar Orientation®. Fonte: adaptada de Plastlabor (2021). Para as etapas de identificação bioquímica, os métodos fenotípicos citados na Unidade 1 são os mais amplamente aplicados, mas por serem numerosos e aplicáveis para uma infinidade de micro-orga- nismos, existem protocolos já bem estabelecidos e estudados por órgãos Nacionais e Internacionais. Falando de uma analista para outro analista, o estudo sobre estes testes bioquímicos será constante e interminável, mas garantimos que não haverá arrependimentos quando você souber resolver qualquer enigma microbiológico no seu laboratório com muita confiança. Pensando nisso, sempre buscamos um manual de fácil acesso e recheado de informações sobre estes testes sempre quando precisamos. Sugerimos no #EuIndico que você salve esse documento com carinho em suas bases de dados, e apro- veite para ler e aprender mais sobre este assunto. UNIDADE 2 71 E mesmo estudando e conhecendo todos os procedimentos aplicados no laboratório, é sempre bom lembrar que o resultadoda urocultura deve ser associado a outros achados clínicos e resultados de outros ensaios laboratoriais, como a presença de leucócitos na urina. Além disso, resultados mais significativos são considerados quando a urocultura resulta no crescimento de um único tipo de mi- cro-organismo, o que diminui as chances de um falso positivo. Ainda, no caso de urocultura positiva, a conduta comum no laboratório é encaminhar esta amostra para testes de antibiograma, principalmente nos casos de cistite/pielonefrite persistentes ou mau curadas (BRASIL, 2000). Título: Microbiologia clínica para o controle de infecção relacionado à assistência à saúde Autor: Agência Nacional de Vigilância Sanitária Editora: Agência Nacional de Vigilância Sanitária Sinopse: Material desenvolvido para auxiliar laboratórios, analistas, gestores e equipe multiprofissional no manejo de doenças infecciosas de origem viral, bacteriana e fúngica. Contém dez módulos e, em cada um, pontos relevantes da rotina laboratorial, ambulatorial e hospitalar são tratados em seus parágrafos. Certamente conhecemos a sua preocupação em ser um profissional de saúde de referência onde decidir atuar, por isso, temos certeza de que você já conhece um pouco sobre os exames de antibiograma. Gostaria de se aprofundar e conhecer melhor os antimicrobianos e as normati- vas que envolvem a realização destes ensaios? Só precisamos de dez minutos para apresentar estas análises nesta roda de conversa e con- vencer você da importância de saber quando aplicá-la no laboratório de microbiologia. É só dar o play! https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/14616 UNICESUMAR 72 E quanto ao nosso mistério em relação às placas de ágar CLED, você conseguiu desvendar? Por mais que seu colega se chame Indiana Jones, ele certamente não usou de muita astúcia e esperteza que possui o personagem dos cinemas de mesmo nome. Futuramente, você aprenderá que cada amostra bioló- gica pode ser tratada de uma maneira que facilite o crescimento de determinados micro-organismos dependendo do material biológico que se recebe no laboratório. Além disso, saberá que nem sempre a mesma técnica é indicada para todos os tipos de análises, justamente devido às especificidades do material coletado, ou mesmo do micro-organismo e suas atividades quando presentes nesse material. O caso do desatento Indiana Jones podia ser apenas uma história de Hollywood, no entanto, não foi. Em alguns anos de laboratório já tivemos contato com histórias curiosas e surpreendentes em relação ao mundo das bactérias, e essa é uma delas. O que ocorreu foi o seguinte: na história real, a amostra de urina tinha uma contagem tão grande (grande mesmo) de Pseudomonas aeruginosa que por um descuido (infelizmente não se descobriu qual) a placa de Petri que continha este micro-organismo acabou por contaminar todas as outras placas. E pior! Após o ocorrido, praticamente a estufa inteira ficou contaminada com a bactéria, provavelmente devido a sua resistência aos produtos de limpeza usualmente utilizados, e a sua capacidade de formação de biofilme e fixação em superfícies. Por fim, depois de quase dois dias passando a tabela periódica inteira dentro da incubadora a fim de eliminar qualquer vestígio da bactéria, foi possível colocá-la novamente para uso na rotina com segurança, no entanto, depois desse evento, todos os analistas do laboratório tiveram cuidado redobrado com amostras de urina, e sempre que existia uma placa com suspeita de Pseudomonas aeruginosa no la- boratório, ela era lacrada com fita aderente entre uma incubação e outra (procedimento que, confesso, adoto inclusive nos dias de hoje). Acreditamos que para você, que chegou até aqui, ficou evidente a importância de se conhecer as análises em urina, independentemente do tipo de laboratório, seja ele hospitalar ou ambulatorial, que você decidir atuar. As infecções urinárias podem acometer qualquer faixa etária, o que irá colocar você em contato com todos os grupos de pacientes possíveis, sendo necessário que conheça os fatores de risco para alguns indivíduos, como no caso das mulheres, ou no cuidado com as instruções de coleta, como na ocasião de crianças e adultos. Indo além do fator humano, conhecer os micro-organismos mais comuns, se fazem parte ou não da microbiota normal e de seu comportamento dentro do laboratório, também ajudará você futuramente a tomar decisões envolvendo a tomada de decisão na execução dos ensaios, em como tratar amostras contaminadas e a evitar que seja mais um “Indiana Jones” no laboratório de microbiologia. Por fim, por se tratar de um tipo de pesquisa muito comum na bacteriologia, os exames de urina acabam sendo um tipo de análise que contribuiu financeiramente para o crescimento de um laboratório, e ao mesmo tempo, que demandam muito conhecimento técnico e disposição de tempo. Assim, quanto mais você conhecer sobre os procedimentos, os meios de cultura envolvidos e as técnicas aplicáveis, poderá futuramente atuar como gestor de um laboratório (por que não?), sabendo exatamente onde investir mais recursos e tomar as melhores decisões para o seu processo e para os pacientes envolvidos. 73 Não foi tão difícil! Agora é hora da fixação do conteúdo! Logo a seguir está um Mapa Mental que pode ajudá-lo a não somente anotar seus conhecimentos adquiridos, mas você pode organizá-lo, complementá-lo e alimentá-lo da forma que achar melhor. Não se esqueça de revisar o texto mais uma vez e tente utilizar palavras-chave que o ajudem a lembrar de cada detalhe importante. INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO Diagnóstico Agentes etiológicos Classificação Sinais e SintomasDefinição Semi-quantitativo Quantitativo 74 1. De acordo com seus conhecimentos sobre as infecções das vias urinárias e seu estudo acerca do assunto, assinale a alternativa que contém o micro-organismo mais comumente encontrado em amostras de urocultura em análises microbiológicas nos casos de infecção ativa: a) Staphylococcus aureus. b) Mycobacterium tuberculosis. c) Mycobacterium leprae. d) Escherichia coli. e) Staphylococcus saprophyticus. 2. Em relação à epidemiologia das ITUs, é sabido que a ocorrência desta doença é mais comum nas mulheres do que nos homens. Assinale a alternativa que contém a informação correta acerca desta afirmação: a) As infecções possuem maior prevalência em mulheres em decorrência da proximidade da uretra com a região perianal, que é rica em microbiota Gram-negativa. b) As mulheres não possuem mecanismos de defesa suficientes contra os agentes etiológicos das ITUs quando comparadas aos homens. c) Mulheres apresentam maior prevalência de ITUs porque são o público que mais faz reposição hormonal. d) O pH vaginal não é capaz de proteger a mulher contra ITUs, além disso, as mulheres não possuem microbiota genitourinária normal eficaz contra patógenos. e) As defesas femininas aumentam com o tempo, e não são dependentes das variações hormonais. 75 3. Considere uma cistite infecciosa e ativa. Os resultados esperados em exames de urinálise e urocultura são: a) Urocultura positiva, presença de nitrito e esterase leucocitária negativa. b) Urocultura positiva, presença de nitrito, esterase leucocitária positiva e piúria. c) Urocultura negativa, presença de nitrito e esterase leucocitária negativa. d) Urocultura positiva, ausência de nitrito, esterase leucocitária negativa e piúria. e) Urocultura positiva, presença de nitrito, esterase leucocitária positiva e presença de cristais de fosfato. 4. Em relação aos testes de sensibilidade a antimicrobianos, assinale a alternativa correta: a) É necessário que o laboratório disponha de meio de cultura MacConkey para a sua execução, pois este meio de cultura é indicado pelos protocolos estabelecidos pela CLSI. b) A escolha dos antimicrobianos testes não envolve o micro-organismo pesquisado, pois só são testados antimicrobianos de amplo espectro. c) Não existe teste de sensibilidade a antimicrobianos paramicro-organismos super-resistentes. d) Ampicilina, amoxicilina, bacitracina e cefalosporinas são antimicrobianos que podem ser testados em antibiogramas. e) O teste de sensibilidade a antimicrobianos é um ensaio obrigatório no laboratório de micro- biologia. 76 3 O trato gastrointestinal é um dos sistemas mais interessantes e ricos para o aprendizado da microbiologia. Seu funcionamento, suas influências em outros sistemas e sua função primordial para o organismo podem impactar diretamente nos microrganismos e seus mecanismos de ação, ora dificultando seu crescimento e pro- liferação, ora contribuindo para os mecanismos de patogenicidade dessas bactérias. Nesta unidade, você terá o primeiro contato com as bactérias causadoras de epidemias e pandemias, e, também, saberá a importância de conhecer as toxinas bacterianas. Além de conhecer as principais formas de contaminação e tratamento para as enfermidades causadas pelas bactérias, você entrará em contato com as técnicas usuais de diagnóstico microbiológico em amostras de fezes, conseguindo aplicar seus conhecimentos adquiridos até aqui com as novidades apresentadas nesta unidade. Aspectos Microbiológicos, Clínicos e Laboratoriais das Infecções Do Trato Gastrointestinal Me. Suelen Eloise Simoni UNICESUMAR 78 O que pode dar errado em um exame de colonoscopia? Esse tipo de exame é muito requisitado e exe- cutado pelos médicos quando se deseja diagnosticar ou, até mesmo, tratar algum problema digestivo envolvendo o reto, o cólon e o íleo distal, como a doença de Crohn e a Colite Ulcerativa. No entanto, por se tratar de um exame invasivo, os procedimentos de colonoscopia carregam consigo complica- ções passíveis de ocorrer, envolvendo as condições do equipamento de análise, o ambiente do exame, a capacitação do profissional de execução e, também, as circunstâncias dos pacientes, como estado de saúde, uso de medicações e preparo para o exame. Em uma das etapas do preparo, o paciente deve tomar laxativos, a fim de manter o intestino livre de obstruções, o que facilita a observação da condição gastrointestinal e a verificação da presença de pólipos (alterações celulares que levam à proliferação e crescimento anormal de células intestinais formando estruturas proeminentes e observáveis apenas por endoscopia ou colonoscopia). O laxativo de escolha, muitas vezes, é o manitol, um açúcar que quando diluído na água e ingerido provoca a evacuação por diarreia osmótica, e que ao mesmo tempo, pode ser utilizado como substrato para metabolismo bacteriano, uma vez em contato com os microrganismos intestinais. Sabendo dessa informação, e certo de que seus conhecimentos adquiridos nas unidades anteriores possam te ajudar, você consegue pensar em complicações gastrointestinais envolvendo bactérias? Teriam seus fatores de virulência algum envolvimento? Os nutrientes que consomem e os produtos metabólicos produzidos pelas bactérias poderiam, de alguma forma, interferir ou complicar um exame de rotina como a colonoscopia? Você, aluno, já deve ter notado que, tratando-se de microbiologia, nem o paciente, tampouco a sua potencial doença devem ser enxergados unilateralmente. É mais do que imprescindível que se com- bine os conhecimentos sobre as bactérias e seu comportamento com a experiência e vivência clínica de sinais, sintomas e relatos dos pacientes, e, ainda, com a compreensão sobre os distúrbios de saúde que envolvem a presença desses pequenos organismos. E mais do que isso, trabalhar com bactérias exige que os profissionais possam, inclusive, prever situações perigosas ou de potencial dano à vida dos profissionais e pacientes. Por exemplo: você acreditaria se eu contasse que, durante um exame gastrointestinal, como a colonoscopia, é possível ocorrer uma explosão? E que ela pode ser associada à presença de bactérias da microbiota do trato gastrintestinal? Conhecer as exigências que envolvem os exames laboratoriais ou hospitalares, como vimos na Unidade 1, ainda será necessário no nosso atual estudo. E no caso dos exames envolvendo a pesquisa de patógenos em amostras fecais, o cuidado e a seriedade com que devem ser tratadas as análises laboratoriais devem ser ainda mais intensificados para esses materiais. É importante frisar, também, que a coleta e entrega de amostras fecais no laboratório podem gerar certo constrangimento e timidez aos pacientes, e, por essa razão, o seu trabalho como profissional da saúde torna-se ainda mais indis- pensável, porque conferir mais dignidade a uma pessoa que já está em condições de saúde debilitadas não é uma tarefa fácil, mas não tenho dúvidas que você pode tirar isso de letra! Voltando ao caso da colonoscopia, convido você a um exercício rápido, que enriquecerá ainda mais os seus conhecimentos. Acesse o estudo publicado em 2017 por Kurachi e colaboradores, intitulado “Explosão de cólon após uso de manitol para preparo de colonoscopia: Relato de caso”, por meio do seu leitor de QR code, e leia com atenção o estudo de caso apresentado pelo pesquisador e sua equipe. UNIDADE 3 79 Para ajudar no exercício proposto, faça suas anotações. Pense e reflita: como a presença das bactérias no trato gastrointestinal pode ter interferido no desfecho apresentado? E de acordo com os seus conheci- mentos, qual a possível fonte do problema relatado? Teria alguma forma de esse fato ter sido evitado? Use o espaço a seguir à vontade para criar suas teorias, testar suas hipóteses e fixar seu conhecimento. Depois, leia o estudo publicado em 2020 por An- drade e colaboradores (2020), intitulado "Explo- são de cólon durante colonoscopia" por meio do QR code a seguir, e colete todas as informações envolvendo a ação dos microrganismos que você achar pertinentes. 01 02 https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/18683 https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/18685 UNICESUMAR 80 O sistema gastrointestinal é um dos sistemas mais emblemáticos para a microbiologia devido não apenas a sua complexidade, mas também porque a presença de microrganismos ao longo do tubo digestivo não é um fato incomum. Desde a boca até o final do intestino, o sistema gástrico é composto de suas partes essenciais, sendo a microbiota bacteriana uma parte muito importante e essencial para seu de- vido funcionamento. O sistema gastrointestinal e seus componentes estão representados na Figura 1. Como sabemos, o propósito do sistema gastrointestinal é realizar a digestão dos alimentos a fim de fornecer nutrientes para uso em processos metabólicos essenciais, como também, caminho de de- glutição de líquidos orais hidratantes. Basicamente, o alimento é levado à boca, e a digestão inicial já começa nessa cavidade com o auxílio dos dentes (cortam, amassam, trituram), da língua, saliva e enzimas digestivas, como a amilase salivar. Durante a deglutição, a epiglote faz o bloqueio do acesso dos alimentos à traqueia, fazendo com que o material mastigado seja conduzido ao esôfago. Depois de ser conduzido por esse tubo, o alimento chega até o estômago, onde sofrerá ação do ácido clorídrico Boca Língua Epiglote Fígado Vesícula biliar Intestino grosso Apêndice Glândulas salivares Faringe Esôfago Estômago Pâncreas Intestino delgado Reto Ânus Descrição da Imagem: a imagem apresenta uma figura do corpo humano em corte frontal, mostrando as estruturas que compõem o sistema gástrico. As seguintes partes são representadas partindo-se da boca em direção ao ânus: boca, língua, glândulas salivares, faringe, epiglote, esôfago, fígado, estômago, vesícula biliar, pâncreas, intestino delgado, intestino grosso, apêndice, reto e ânus. Figura 1 – Representação do sistema gastrointestinal / Fonte: Shutterstock ([2023a], on-line). UNIDADE 3 81 estomacal, o que irá dar continuidade no processo digestivo. É nesse ponto que algumas bactérias que possam estar presentes na água e nos alimentos sofrem a ação mais agressiva do organismo humano, por conta do baixíssimo pH do estômago, tornando as condiçõesmuito ruins para sobrevivência bacteriana (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). O bolo alimentar (quimo) é direcionado, então, ao intestino delgado em sua porção inicial, cha- mada duodeno, na qual são liberados os fluidos pancreáticos e biliares, que são determinantes para a digestão completa. Eles fornecem surfactantes e enzimas que digerem proteínas, amidos e lipídios. No duodeno também é liberado o bicarbonato, que ajuda na neutralização do ácido proveniente do estômago, e alguns aminoácidos e enzimas antibacterianas, como a lisozima (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). A absorção da maioria dos nutrientes ocorre nessa região, e esses componentes são direcionados ao fígado por meio da veia, porta para processamento, metabolismo ou produções necessárias. Nos lóbulos do fígado, uma rede de vasos e capilares chamados sinusoides (Figura 2) são responsáveis ainda por remover células mortas, combater algumas bactérias e toxinas por meio das células de Kupffer (BLACK; BLACK, 2021). O quimo segue pelo intestino delgado, onde ocorre a absorção de açúcares simples, aminoácidos e gorduras por meio da comunicação das células presentes nas microvilosidades deste órgão e das terminações sanguíneas e linfáticas. Nesse ponto, também são secretadas enzimas importantes para a defesa do organismo frente aos potenciais patógenos, como vírus e bactérias. Além disso, as placas de Descrição da Imagem: a figura é composta por três imagens: a localizada na extremidade superior esquerda representa o fígado na cor marrom e de estrutura semelhante a uma pirâmide com a sua base na diagonal. A figura central representa o tecido hepático, o qual é desenhado em marrom e cada lóbulo aparece em formato hexagonal adjacente e justaposto, compondo visualmente uma estrutura semelhante a um favo de mel. A terceira figura, esta na extremidade superior direita, representa a aproximação do lóbulo hepático, e nela é possível observar os sinusoides, desenhados em linhas coloridas de vermelho, verde e amarelo, representando os vasos sanguíneos e linfáticos que ficam em torno dessas estruturas. Figura 2 – Representação do lóbulo hepático e dos sinusoides. / Fonte: Shutterstock ([2023b], on-line). UNICESUMAR 82 Peyer (Figura 3), uma espécie de tecido linfoide, também contém grande concentração de linfócitos e macrófagos que podem combater invasores indesejados. O bolo fecal segue para o intestino grosso, onde bactérias que habitam naturalmente o sistema e fazem parte da microbiota intestinal concluem a digestão, liberando importantes subprodutos, como tiamina, vitaminas K e B12 e riboflavina. Além do mais, essas bactérias também competem por nutrientes com possíveis patógenos, dificultando a proliferação dos microrganismos maléficos ao organismo. Por fim, as fezes são formadas e armazenadas no reto, para depois serem evacuadas para o meio externo (BLACK; BLACK, 2021). A microbiota normal pode variar de indivíduo para indivíduo, e pode ser devido a isso que a variedade de gêneros e espécies que a compõem seja tão vasta. No Quadro 1 a seguir, você pode encontrar alguns tipos, quantidades e curiosidades sobre a microbiota do sistema gastrointestinal e suas particularidades. Descrição da Imagem: a imagem apresenta uma foto vista em microscópio óptico. Ela representa as Placas de Peyer na mucosa intestinal. A estrutura possui um envoltório sinuoso, formado por células roxas, longas e em sentido vertical. As Placas de Peyer estão dentro deste envoltório, em formato triangular e oval. Figura 3 – Placas de Peyer na mucosa intestinal. UNIDADE 3 83 Tratando-se de infecções gastrointestinais, as doenças diarreicas são as mais representativas, sendo que nos últimos vinte anos o conhecimento sobre os agentes patogênicos causadores desses distúrbios aumentou de forma importante. A descoberta de episódios diarreicos causados pelos microrganismos dos gêneros Isospora spp. e Cryptosporidium spp. em pacientes imunossuprimidos foi determinante para a resolução de problemas envolvendo esse público e ajudando também a decidir o melhor manejo para esses casos. Em crianças, os episódios diarreicos normalmente são causados por rotavírus, por isso, apenas em casos negativos para o vírus é que se realiza a pesquisa de patógenos bacterianos em amostras fecais. Em adultos, a causa mais comum é inflamatória, no entanto, a pesquisa de bactérias em materiais fecais não é tão rara, e o maior desafio nesses casos é diferenciar o agente patogênico das bactérias constituintes da microbiota normal (BLACK; BLACK, 2021). Grupo de microrganismos Localização Particularidades Fusobacterium sp., Strep- tococcus sp., Actinomyces sp., Propionibacterium sp., Veillonella sp. e Staphylo- coccus sp, Boca Mais de 750 espécies co- nhecidas, e cada mililitro de saliva pode conter milhões de bactérias. Ausentes (em condições normais) Estômago e esôfago O baixo pH estomacal tor- na praticamente impossível a manutenção de microbio- ta bacteriana. Bacteroides sp., Bifidobac- terium sp., Clostridium sp., Lactobacillus sp., Entero- coccus sp., Eubacterium sp., Fusobac- terium sp., Peptostreptococcus sp., Ruminococcus Intestino delgado (após o primeiro terço de sua porção) Cerca de 40% da massa fecal é constituída de bac- térias. Elas são responsáveis também por metabolizar. nutrientes que, na sua au- sência, não seriam quebra- dos nem absorvidos, como alguns polissacarídeos. Bacteroides sp. (Enterótipos 1,2 e 3), Escherichia coli Intestino grosso O alimento pode permane- cer até 60 horas antes de ser completamente digeri- do, criando um ambiente adequado para a prolife- ração bacteriana. Estes microrganismos conse- guem digerir substâncias e produzir vitaminas. Quadro 1 – Composição da microbiota normal do sistema gastrointestinal Fonte: adaptado de Murray; Rosenthal e Pfaller (2021); Black e Black (2021); Sommer e Bäckhed, (2013). UNICESUMAR 84 Surtos associados à contaminação da rede de abastecimento público de água também podem ocorrer em regiões de saneamento básico insuficiente, afinal, a falta de condições adequadas desses serviços influencia em processos infecciosos pelo consumo de água e alimentos contaminados (BRASIL, 2004). No Brasil, esses distúrbios são denominados Doenças Diarreicas Agudas e ocorrem cerca de 10 milhões de casos por ano, e ainda que na maioria das vezes sejam autolimitadas, os distúrbios eletrolíticos, desidratação e déficit nutricional acarretam piora no quadro, tanto em pacientes vulneráveis quanto naqueles em estados normais de saúde (BRASIL, 2018). Tratando-se de sistema gastrointestinal, nada mais lógico que começarmos pelos distúrbios envolvendo a boca e seus órgãos anexos. Primeiramente, precisamos lembrar que o fluxo e com- posição salivar varia de um indivíduo a outro, e, por esta razão, algumas pré-disposições à cárie e à periodontite podem ser explicadas. Isso ocorre porque em pessoas com baixo fluxo salivar, a probabilidade de grupos bacterianos se fixarem na superfície dental através de biofilmes é aumen- tada. O microrganismo com maior potencial cariogênico é chamado Streptococcus mutans, o qual é capaz de metabolizar uma grande variedade de carboidratos, sintetizar dextrano (um polissaca- rídeo aderente que é capaz de aglomerar moléculas de glicose) e, ainda, é capaz de tolerar um alto nível de acidez) (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Na Figura 4, à esquerda, você pode observar a estrutura característica dessa bactéria em microscópio eletrônico de varredura, sendo possível observar que as células bacterianas se apresentam agrupadas e em fila. Do lado direito, nas setas vermelhas, é possível observar o dextrano ao redor dessas bactérias. A fisiopatologia da cárie envolve duas características importantes que se correlacionam entre si: a capacidade de adesão dessas bactérias ao dente e a sua propensão de formar as placas bacterianas. Em dentes limpos, é muito improvável que ocorra aderência de células bacterianas, no entanto,mesmo após a escovação, em poucos segundos os aminoácidos presentes naturalmente na saliva criam um ambiente propício para a adesão de bactérias na superfície dentária. Uma vez aderidos, os microrga- nismos são capazes de metabolizar carboidratos e açúcares, produzindo ácido lático que, ao remover Figura 4 – Streptococcus migrans na cavidade bucal. / Fonte: Tortora, Funke e Case (2019, p. 750). Descrição da Imagem: na imagem aparecem duas fotografias provenientes de microscópio eletrônico de varredura, em preto e branco. A foto da esquerda possui em branco bactérias agrupadas, ligadas umas às outras em fileira. Do lado direito, a segunda foto apresenta estruturas mais disformes em branco, e em duas delas há duas setas vermelhas. UNIDADE 3 85 o esmalte dentário, cria um ambiente favorável para a aderência de mais células bacterianas (BLACK; BLACK, 2021). A degradação do esmalte dentário levará a desmineralização, erosão e corrosão dos dentes (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). O flúor, componente de diversos cremes dentais e antissépticos bucais, reduz o efeito do ácido lático no esmalte dentário. Além disso, a natureza alcalina da saliva também pode neutralizar essa produção de ácidos, no entanto, se a corrosão do esmalte não for tratada, a massa bacteriana será capaz de invadir o tecido dentário interno. E nesse ponto, é importante observar que, após o agravamento de uma cárie superficial, a população bacteriana, capaz de provocar abcessos dentários, é completamente diferente daquela que iniciou a infecção (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). A principal forma de se combater ou evitar cáries é a escovação dentária, uso do fio dental e em casos mais extremos, uma redução no consumo de açúcares e preenchimento da cavidade dental com resinas (materiais plásticos) ou com amálgama (mistura de prata e outros metais) pode ser necessária (BLACK; BLACK, 2021). Alimentos "sem açúcar" podem contribuir para o desenvolvimento das cáries? O sorbitol e o xilitol não contribuem para a formação de cárie dental, porque a maioria das bactérias são incapazes de metabolizá-los. E, mesmo que utilizem, o ácido liberado é facilmente neutralizado pelos tampões da saliva. UNICESUMAR 86 Ainda na cavidade bucal, as cáries podem evoluir para doenças periodontais, como a gengivite, que é caracterizada, principalmente, por sangramento da gengiva durante a escovação e o processo é facilitado quando o hábito de escovação diminui, afinal, a deposição e acúmulo de bactérias é facilitada nesses casos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). As doenças periodontais são a soma da gengivite com a erosão dos chamados ligamentos periodontais que sustentam os dentes. Dessa forma, formam-se sulcos entre os dentes e a gengiva, facilitando o desprendimento dos dentes. Com relação aos agentes etiológicos, os grupos anaeróbios, estreptococos e actinomicetos são os mais comuns de serem encontrados nessas condições, e as formas de tratamento envolvem higiene bucal mínima, como escovação e uso contínuo do fio dental. No caso da evolução para a gengivite ulcerativa necrosante aguda, pode haver a necessidade de aplicação de colutórios contendo antimicrobianos e remoção física das placas e tártaros (BLACK; BLACK, 2021). Um processo de gengivite e periodontite concomitantes podem ser observados na Figura 5. Figura 5 – Processo infeccioso de gengivite e periodontite. Fonte: Shutterstock ([2023c], on-line). Descrição da Imagem: na imagem há uma foto de um indivíduo com seus dentes expos- tos. Um profissional calçando luvas cirúrgicas está afastando o lábio superior com um ins- trumento metálico, revelando parte da arcada dentária desse indivíduo, revelando processo de gengivite, caracterizado pelo sangramento da gengiva entre o dente canino e o primeiro pré-molar. Além disso, há o aparecimento de manchas amarelas nos dentes, na região pró- xima à gengiva. Mais uma vez, o Atlas de Microscopia Digital da Unicesumar pode te ajudar a visualizar inúmeras opções, e nas infecções do trato gastrointestinal não seria diferente. Você pode observar uma lâmina histológica de uma infecção gengival. Aproveite para navegar pela plataforma e agregar ainda mais conhecimento no seu processo de aprendizagem. Para acessar, use seu leitor de QR Code. https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/18686 UNIDADE 3 87 Os agentes etiológicos, normalmente, envolvem microrganismos que não fazem parte da microbiota normal, ou espécies produtoras de fatores de virulência e toxinas capazes de afetar o organismo hu- mano e que, infelizmente, a presença em alimentos não é tão incomum. Em abril de 2022, durante o famoso festival de música Coachella, em Los Angeles (LA), cerca de 40 pessoas da mesma empresa de ônibus foram levadas ao hospital com sintomas e sinais de intoxi- cação alimentar, depois de três horas do jantar servido à equipe. Investigadores dos departamentos de saúde pública e saúde ambiental do condado de Riverside, LA, realizaram mais de 200 entrevistas e identificaram uma pessoa que ficou doente e levou parte da comida para casa. Após a realização de exames com essa amostra, o laboratório detectou a presença de uma toxina, também chamada de superantígeno, produzida por um microrganismo Gram positivo que, segundo o Centers for Disease Control and Prevention, não costuma evoluir para condições graves de saúde, mas que exige cuidados em relação à intensa desidratação dos pacientes (AR NEWS, 2022). Como diferenciar infecção de intoxicação alimentar? É importante lembrar que intoxicações ocorrem de maneira repentina, com sintomas abruptos e, normalmente, em ausência de febre. Além disso, intoxicações ocorrem pelo consumo da toxina, e não necessariamente estará envolvida em uma infecção bacteriana. Agora estudaremos mais sobre as infecções que afetam o trato gastrointestinal inferior, as quais, neste capítulo são mais notórias e significativas para análise laboratorial. As doenças que acometem o estô- mago e intestinos dependem de fatores internos, como imunidade, condição da microbiota intestinal, condição fisiológica de peristaltismo, alergias alimentares e externas, envolvendo, principalmente, o estado do alimento/água consumidos e as condições higiênico-sanitárias dos instrumentos utilizados no preparo de alimentos, e ocorrem quando patógenos conseguem se multiplicar e driblar as defesas naturais do indivíduo (Placas de Peyer). Sabendo disso, sugiro revisitar a Unidade 1, onde estudamos as genera- lidades das bactérias, e procurar nos parágrafos em que discutimos os fatores de virulência das bactérias, alguns candidatos microbiológicos que podem produzir os chamados “superantígenos”. Você conseguiu encontrar alguma bactéria que pudesse ser a produtora dessa toxina em especial? UNICESUMAR 88 Você deve ter visto que algumas espécies do gênero estafilococos são capazes de produzir toxinas, e, dentre elas, o Staphylococcus aureus é muito significativo para doenças gastrointestinais. Além de suportar condições de alto estresse (temperaturas elevadas, concentração de sal acentuadas, baixa pressão osmótica), podem ser transferidos para alimentos através das mãos de manipuladores ou do próprio consumidor final (RADDI; LEITE; MENDONÇA, 1988). Por isso, é hora de relembrar quem é essa bactéria e por que ela tem tanta importância na investigação de doenças gastrointestinais. Os estafilococos são bactérias Gram positivas que medem entre 0,5 e 1,5 micras de diâmetro, imóveis, incapazes de formar esporos, e a maior parte das espécies são catalase positiva (Figura 6), enzima que tem a capacidade de quebrar peróxido de hidrogênio em água e oxigênio, fazendo com que ambientes ricos em peróxidos não sejam nocivos a essas bactérias (BLACK; BLACK, 2021). Os superantígenos são proteínas e estruturas capazes de ativar o sistema linfocitário policlonal e iniciarem uma intensa resposta imunológica, envolvendo não apenas intoxicações alimentares, mas, também, doenças cutâneas e sanguíneas (SIVIERO; UTIYAMA, 2000).O Staphylococcus aureus, especificamente, também possui em sua superfície a enzima coagulase, a qual se liga ao fibrinogênio do plasma humano convertendo-o em fibrina, fato que, além de proteger bactérias que ficam enclausuradas em coágulos, ainda provoca problemas ao hospedeiro (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Na Figura 7, temos um breve resumo dos fatores de virulência do Staphylococcus aureus, onde conseguimos observar (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021): Figura 6 – Prova da catalase negativa (esquerda) e positiva (direita). Fonte: Shutterstock ([2023d], on-line). Descrição da Imagem: A imagem apresenta uma foto de uma lâmina de vidro em um fundo preto, contendo duas colônias bacterianas adicionadas em um líquido transparente que é o peróxido de hidrogênio. À esquerda, a colônia se assemelha a um botão transparente, sem formação de bolhas e geração de gás, caracterizando a ausência da enzima catalase nessa bactéria. A colônia da direita está turva e apresenta inúmeras bolhas de ar, caracteri- zando a prova de catalase positiva. UNIDADE 3 89 • Substâncias invasivas e de degradação, como a hialuronidase, auxiliam na fixação do micror- ganismo nas células alvo e, ainda, favorecem a sua entrada e disseminação no organismo. • A produção de enzimas, como a catalase e a coagulase, auxiliam nas manobras de sobrevivência e proliferação bacteriana. • As toxinas ajudam a aumentar a vulnerabilidade do indivíduo infectado. • A presença de microcápsula está envolvida com uma menor sensibilização de neutrófilos e neutralização de elementos do sistema complemento. • A parede celular possui inúmeras proteínas e receptores que auxiliam na internalização de nutrientes e trocas com o ambiente externo. • Família de microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules (MSCRAMM), um conjunto de genes codificadores de adesinas bacterianas, que se ligam às células-alvo faci- litando sua permanência nos tecidos. • Presença do gene MecA, responsável por codificar proteínas que tornam a bactéria resistente a antimicrobianos de amplo espectro, como a oxacilina. • Presença de plasmídeo, que quando transferido de outras bactérias, também confere caracte- rísticas de resistência microbiana. Invasinas Enzimas Toxinas Anticorpo Proteína A Parede celular Microcápsula Ribossomos Descrição da Imagem: A imagem possui uma figura que representa a célula do Staphylococcus aureus através de uma estrutura esférica, circundada inicialmente por um envoltório azul claro (microcápsula), seguido de um envoltório amarelo claro (parede celular). Presos a esta esfera, estão representados os fatores de virulência. No lado esquerdo da imagem tem-se as invasinas, ilustradas como estruturas azuis triangulares agudas; enzimas, desenhadas em forma de esferas pequenas e coloridas; toxinas, representadas por estruturas disformes. Do lado direito, a proteína A e os MSCRAMM, que se assemelham a espículas coloridas aderidas na parede da esfera. No centro da célula tem-se em branco o material genético da bactéria, estando preso a ela uma estrutura em forma de bastão, na cor marrom, representando o gene MecA. Ainda o plasmídeo pode ser encontrado na figura, representado por um círculo amarelo. Figura 7 – Fatores de virulência do Staphylococcus aureus. / Fonte: Shutterstock ([2023e], on-line). UNICESUMAR 90 A infecção pelo S. aureus envolve, principalmente, a invasão direta do tecido gastrointestinal devido as suas adesinas e substâncias invasivas que rompem as barreiras do epitélio e comprometem as junções de aderência, utilizando os fatores de virulência, observados na Figura 7, como principais mecanismos para sua sobrevivência (SANTOS et al., 2007). Ainda assim, a característica mais notória que o configura como potencial microrganismo causa- dor de doenças gastrointestinais é a sua capacidade de produção de enterotoxinas. As enterotoxinas estafilocócicas (EE) são termorresistentes e são produzidas e fixadas nos alimentos, dessa maneira, mesmo após a remoção da bactéria pela cocção, é possível que a toxina permaneça no alimento (HENNEKINNE; BUYSER; DRAGACCI, 2012). No Brasil, a pesquisa de enterotoxinas estafilocóci- cas é exigida em produtos lácteos como leites fermentados, iogurtes, leite integral e queijos, devido a ocorrências anteriores de toxinfecção causada por S. aureus nessas matrizes alimentares (SABIONI; HIROOKA; SOUZA, 1988). Ainda, as tortas de creme e bolos de festa, os produtos à base de aves e salada de batatas, são alimentos comumente envolvidos em intoxicações estafilocócicas, e essas toxinas também não alteram características visuais e organolépticas desses alimentos (BLACK; BLACK, 2021). São conhecidas mais de 20 classes de toxinas estafilocócicas, mas as mais comuns são as das classes SEA, SEB, SEC, SED e SEE, sendo a SEA mais envolvida em intoxicações alimentares e a SEB associada, inclusive, como arma biológica (WU et al., 2016). O mecanismo da intoxicação ainda não é bem elucidado, sendo explicado principalmente pela sua capacidade de induzir uma resposta inflamatória intensa, mas também por ações indiretas, afetando a expressão de citocinas imunológicas e metabólitos produzidos pelos macrófagos, células T e monócitos (WU et al., 2016). No entanto, o dano tecidual do trato gastrointestinal só ocorre após a toxina circular no sangue e voltar ao intestino, sendo que dentro de uma a seis horas após o consumo do alimento contaminado, o indivíduo pode desenvolver diarreia, dor abdominal, náuseas e vômitos e, geralmente, sem febre. A velocidade de aparecimento dos sintomas é correlacionada com a quantidade de toxinas, por isso um alimento carregado delas gerará sinais de intoxicação mais rapidamente. É importante lembrar que intoxicações não conferem imunidade, por isso o cuidado com o preparo e manipulação de alimentos deve ser constante e monitorado (BLACK; BLACK, 2021). Ainda no grupo dos Gram positivos, três bactérias anaeróbias estritas merecem atenção: o Clos- tridium botulinum, Clostridium perfringens e Clostridium difficile. O botulismo ocorre através da ingestão das toxinas produzidas pelo Clostridium botulinum, as quais, ao invés de causarem trans- tornos gastrintestinais, causam alterações preocupantes no sistema nervoso (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019) que serão discutidas futuramente na Unidade 6. A toxina produzida pelo Clostridium perfringens por sua vez, além das intoxicações alimentares, também pode causar gangrena gasosa, no caso de germinação da bactéria em feridas, ou inflamação do tecido conjuntivo. É importante saber que essa toxina só é produzida em caso de esporulação do microrganismo, processo que ocorre no caso de cozimento inadequado de carnes, caldos e molhos e que, ainda, são mantidos quentes por muito UNIDADE 3 91 O principal sintoma da doença causada pela toxina é a diarreia, mas diferente da intoxicação causada pelo S. aureus, essa demora mais para apresentar sinais e sintomas e permanece mais tempo no or- ganismo, gerando o desconforto (cerca de 24 horas). A principal forma de se evitar uma intoxicação devido à presença de Clostridium perfringens é a manipulação correta e higiênica de alimentos, além de cuidado nos processos de cozimento e conservação. O Clostridium difficile é o mais isolado em amostras fecais de pacientes hospitalizados que desenvolvem diarreia após três dias, ou mais, da in- ternação (BRASIL, 2000), e, assim como as outras bactérias pertencentes ao seu gênero, essa bactéria é capaz de produzir toxinas que desencadeiam os sintomas gastrointestinais (BLACK; BLACK, 2021). O Bacillus cereus, um bacilo Gram positivo e alongado, também é capaz de produzir toxinas que induzem vômito no indivíduo, com os sintomas aparecendo rapidamente (cerca de 8 horas após o con- sumo do alimento contaminado). Essa bactéria pode ser encontrada na água e no solo, e geralmente a intoxicação por sua toxina está associada a alimentos servidos à base de arroz cozido no vapor e carne mal preparada(BLACK; BLACK 2021). tempo. O processo de esporulação pode ser observado na Figura 8, a qual também pode ocorrer em ambientes pobres de nutrientes, afinal, esta morfologia bacteriana é assumida como forma de proteção e preservação da célula (BLACK; BLACK, 2021). Descrição da Imagem: na imagem há a representação de dois ciclos de multiplicação e esporulação bacteriana. O ciclo da esquerda possui em seu centro o nome “ciclo vegetativo” o qual ilustra o ciclo de multiplicação de um bastonete amarelo, posicionado na horizontal, com o DNA representado em roxo. Na célula central desse ciclo, bem em cima de seu material genético, há a indicação da estrutura "Nu- cleoide axial”, e esta célula inicia o ciclo ilustrado do lado direito. Este ciclo possui em seu centro a denominação “Ciclo de esporulação”. Figura 8 – Processo de esporulação de um bacilo Gram positivo. / Fonte: adaptada de Black e Black (2021). UNICESUMAR 92 Mas os distúrbios gastrointestinais não se limitam apenas aos Gram positivos. Os vibriões, grupo que inclui os gêneros Vibrio e Aeromonas, são representantes de enterites de importância médica, sendo essas bactérias de morfologia incomum. São bacilos curvos, em forma de vírgula, Gram negativos e móveis, possuindo apenas um flagelo (Figura 9), chamado de flagelo polar. Essas bactérias crescem em meios de cultura simples, em um intervalo amplo de temperatura (de 14°C a 40°C) e requerem cloreto de sódio para cultivo adequado (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Título: O Despertar de uma Paixão (The Painted Veil) Ano: 2006 Sinopse: Neste filme, Kitty é integrante da alta sociedade e está farta do controle de seus pais, e, aproveitando que o belo médico Walter Fane tem seus belos olhos só voltados a ela, Kitty decide se casar, sem saber que assumir esse compromisso sem amor pode ser pior que uma enterite. Ou não? Ambientado em 1920, em uma cidade no interior da China, o filme traz os dramas do casal em meio a uma epidemia mortal, fato que pode mudar definitivamente a forma como eles enxergam um ao outro. Comentário: Aproveite para assistir a esse romance e refletir sobre as condições do local onde há a epidemia, as relações entre alimentação e infecção, medidas de profilaxia e maneiras de tratamento em uma época em que a penicilina ainda não havia sido descoberta, e, na qual, os profissionais da saúde trabalhavam em condições muito diferentes das de hoje. Descrição da Imagem: na imagem há uma figura em 3D do vibrião. Possui fundo preto, e a bactéria está desenhada em laranja, em forma de bastonete curvo, com um flagelo saindo de sua extremidade posterior. O flagelo possui formato da letra “S”. Figura 9 – Representação 3D do vibrião. / Fonte: Shutterstock ([2023f], on-line). UNIDADE 3 93 Os vibriões podem ser encontrados em águas de estuários, mas a principal forma de contaminação é através de água e alimentos impregnados com a bactéria, caracterizando a contaminação fecal-oral. Essas bactérias formam biofilmes que ficam aderidos em algas, plantas aquáticas e plâncton, e, ainda, possuem a capacidade de ficarem “dormentes” em condições ambientais desfavoráveis. Por essa razão, podem ficar viáveis por longo período de tempo. No entanto, para que causem os efeitos clínicos, devem ser inoculados no indivíduo em grande concentração, uma vez que não possuem alta resistência aos ácidos intestinais. (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021; TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Os maiores representantes desses grupos são o Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus e Vibrio vulnificus. Os principais fatores de virulência que envolvem esse grupo são a produção de toxinas, aderências às células gastrointestinais e evasão do sistema imune pela apoptose de macrófagos. Para algumas espécies (V. parahaemolyticus) ainda há a produção de hemolisinas, chamadas também de Kanagawa positivas. O V. vulnificus pode, ainda, produzir substâncias neutralizantes ao ácido clorídrico estomacal (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). O Vibrio cholerae, principal causador daquela que conhecemos por cólera, é produtor da toxina colérica, que quando liberada, promove a secreção exacerbada de água e eletrólitos pelas células gas- trointestinais, causando uma diarreia massiva e rica em muco e células epiteliais (aspecto chamado clinicamente de “água de arroz”). Pelo alto volume de fluidos perdidos (chegando de 12 a 20 litros de perda hídrica por dia) pode causar choque hipovolêmico, afinal, a perda de líquidos torna o sangue viscoso demais para ser bombeado pelo coração e disperso entre os órgãos (BLACK; BLACK, 2021). O organismo humano produz anticorpos de memória contra essa bactéria, de forma transitória, pre- venindo a recorrência apenas contra microrganismos do mesmo sorogrupo, caracterizados de acordo com o tipo de lipopolissacarídeo O presente em sua superfície. O sorogrupo O1 é subdividido em três sorotipos (Inaba, Ogawa e Hikojima) e dois biotipos (clássico e El Tor). Apesar da divisão, ela é utilizada para fins acadêmicos, afinal, há a possibilidade de as cepas transacionarem entre os sorotipos Inada e Ogawa, por exemplo (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Devido ao seu poderoso mecanismo de patogenicidade, e a sua transmissão depender de condições ruins de saneamento básico, essa bactéria foi responsável também por recorrentes pandemias gastrin- testinais, sendo a primeira datada em 1817, iniciada na Índia, e a última chamada também de “sétima pandemia de cólera”, em 1961. Nos anos 1960 o biotipo El Tor, localizado na Indonésia, ultrapassou os limites territoriais da região, atingindo o litoral da América do Sul pelo Peru. Cerca de 30 anos depois, a epidemia começou a ser disseminada no Brasil, começando pelo Nordeste e Norte do país e depois se alastrando para os estados de Minas Gerais, Paraná e São Paulo (GEROLOMO; PENNA; 1999). É importante destacar que o curso e a intensificação da doença acompanha as regiões mais pobres. E, mesmo com a escassez de estudos científicos atuais que envolvam a sétima pandemia de cólera (que, inclusive, dura até os dias de hoje), Gerolomo e Penna (1999) discutem brilhantemente os dados epidemiológicos desta condição, relatando que o maior impacto sentido socialmente e finan- ceiramente, até a publicação do estudo, foi nas Regiões Norte e Nordeste, enquanto as regiões mais ricas em investimento e infraestrutura, como Sul e Sudeste são poupadas, afinal, os índices de acesso à rede de esgoto e à água tratada, por exemplo, podem ser o dobro nessas localidades mais abastadas. UNICESUMAR 94 O Vibrio parahaemolyticus também pode produzir a doença colérica, mas costuma gerar um distúrbio gastrointestinal mais brando e autolimitado, e sua incidência está mais associada a regiões de alto consumo de crustáceos, frutos do mar e peixe cru. Essa bactéria também pode infectar feridas superficiais através do contato do indivíduo com água contaminada. Já o Vibrio vulnificus produz uma resposta muito mais agressiva, podendo gerar septicemia acompanhada de febre, calafrios, e geração de feridas epidérmicas secundárias. Os surtos de cólera podem ser evitados com o estabele- cimento correto de medidas de saneamento básico, e, ainda, a imposição de quarentena de pacientes infectados junto à interrupção de embarques em cidades portuárias que pode ser uma boa escolha, afinal, a maior parte dos casos não é relacionado a causas autóctones, e sim, a indivíduos que vêm de localidades endêmicas para outras não endêmicas (BLACK, BLACK, 2021). Outro gênero que acompanha os vibriões, que são bastonetes Gram negativos, anaeróbios faculta- tivos e separados das enterobactérias devido a sua capacidade de causar reação positiva para oxidase, é o gênero Aeromonas. Quase 50 espécies fazem parte desse grupo, sendo as espécies A. hydrophila, A. caviae e A. veronii biotipo sóbria, as mais notórias. Assim como os vibriões, a forma de contaminação também é oral-fecal, e essas bactérias também estão presentes em corpos de águas, e são capazes de causar distúrbiosdiarreicos acompanhados de dor abdominal intensa e, adicionalmente, infecções oportunistas sistêmicas em indivíduos imunossuprimidos (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). Você sabe a diferença entre diarreia e disenteria? É dado o nome de diarreia ao amolecimento das fezes acompanhado de grande quantidade de água, decorrentes de uma infecção do intestino del- gado. No intestino grosso, a doença pode evoluir para a disenteria, ou seja, diarreia com presença de muco, sangue e, até mesmo, pus. Outro extenso e complexo grupo capaz de causar enterites é o grupo das enterobactérias. A família Enterobacteriaceae é composta de bacilos Gram negativos, anaeróbios facultativos e que não possuem a capacidade de formar esporos. Neste grupo incluem-se as bactérias que não produzem oxidase, uma enzima que reduz espécimes à base de oxigênio, água ou peróxido de hidrogênio, e esta reação pode ser revelada pelo uso de um corante impregnado em um papel filtro (Figura 10) (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). UNIDADE 3 95 As características visuais em meios de cultura desses microrganismos também são importantes para sua identificação. Por exemplo, ao se semear uma colônia suspeita em ágar MacConkey, é possível separá-los em “fermentadores da lactose” (colônias avermelhadas dos gêneros Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter e Serratia) e “fermentadores tardios de lactose” ou “não fermentadores de lactose” (colônias incolores dos gêneros Salmonella, Shigella e Yersinia spp) (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). No geral, o grupo das enterobactérias possui um conjunto de fatores de virulência que contribuem para o seu crescimento e disseminação no organismo do hospedeiro. A presença das enzimas enterobactina e aerobactina, responsáveis por sequestrar íons ferro de suas proteínas carreadoras, está presente na maioria dos gêneros desta família. Além disso, a cápsula bacteriana é resistente à ação de fatores imunológicos presentes no soro, e a maioria das enterobactérias apresentam mecanismos de resistência a antimicro- bianos usualmente utilizados pela transferência de plasmídeos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Para começar, vamos estudar sobre a bactéria que faz o cabelo de qualquer um ficar em pé quando é encontrada em amostras clínicas: a Salmonela. Primeiramente, precisamos combinar algo muito importante e que pode mudar muito a forma como você, aluno, lê artigos científicos e trabalhos acadêmicos. A classificação taxonômica do gênero Salmonella causa muita confusão, no entanto, já é sabido que as espécies causadoras de salmoneloses pertencem ao gênero e espécie Salmonella ente- rica, grupo que possui mais de 2500 sorotipos diferentes, sendo os mais comuns os sorotipos Typhi, Typhimurium e Enteritidis (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Descrição da Imagem: Na imagem há uma foto de uma placa de Petri dividida ao meio. Do lado esquerdo, há um papel filtro retangular, posicio- nado na vertical, com uma mancha roxa em sua extremidade superior. Acima deste retângulo há a escrita “Oxidase +” em verde. Do lado direito, há também um papel filtro retangular de cor branca, e na sua extremidade superior há uma mancha amarela. Acima deste, existe a escrita “Oxidase - " em vermelho. Na parte superior da placa de Petri, ainda, tem a escrita “teste da oxidase” em vermelho. Figura 10 – Teste da oxidase. Fonte: Shutterstock ([2023g], on-line). UNICESUMAR 96 A salmonelose é uma enterite muito comum, de distribuição mundial, e os sorotipos causadores mais comuns são a Salmo- nella enterica sorovares Typhy, Choleraesuis e Enteritidis. Estes bacilos Gram negativos, são móveis e possuem inúmeros flagelos, e podem ser encontrados no trato gastrointestinal de aves, tar- tarugas e roedores. Por essa razão, a superfície e interior de ovos ou as fezes desses animais são potenciais fontes de contaminação para o homem. Dessa forma, as principais formas de prevenção às enterites causadas pelas salmonelas se inicia no cuidado com os animais e sua saúde, cocção correta de carnes e ovos, cuidado com a pasteurização do leite, indo até a aplicação de armadilhas e ratoeiras em estabelecimentos e locais de manipulação de ali- mentos (BLACK; BLACK, 2021). Esse grupo também pode estar presente na água e, em forma de biofilme, em superfícies, o que configura um risco a mais, uma vez que os biofilmes podem resistir ao ácido do estômago, fa- zendo com que uma alta carga bacteriana chegue aos intestinos. As enterites em geral possuem a dor abdominal e diarreia como sintomas característicos, podendo também o indivíduo apresen- tar febre (devido, principalmente, às endotoxinas produzidas por essas bactérias). O tempo de incubação (intervalo entre consumo do alimento contaminado e o aparecimento dos sintomas) ocorre entre 8h e 48h após a ingestão, e a doença costuma ser autolimitada. O principal tratamento é a hidratação do indivíduo, e nos casos graves ou ocorrência em crianças e idosos, é comum a prescrição de antimicrobianos (BLACK; BLACK, 2021). O principal agravante da salmonelose, no entanto, é o de- senvolvimento de febres entéricas, que ocorrem em virtude da Considerando que essa bactéria é es- tudada há muito tempo, pode ser que você tope com algum livro, trabalho ou artigo que faça a citação dela isolada- mente como espécie, mas é importan- te lembrar que todas elas são soroti- pos de Salmonella enterica, tudo bem? Com isso esclarecido, partiremos para o entendimento sobre fisiopatologia das doenças causadas por esse grupo. UNIDADE 3 97 capacidade de invasão que as Salmonella spp possuem frente às células intestinais, penetrando-se na corrente sanguínea. A febre tifoide, um dos tipos de febres entéricas, é causada pela Salmonella enterica sorovar Typhi, e o seu mecanismo de invasão está exemplificado na Figura 11. Célula M Enrugamento de membrana Linfonodo Corrente sanguínea Salmonella A bactéria se liga aos enterócitos e ao invadi-los, utiliza a própria membrana plasmática da célula para constituir um vacúolo protetor, que serve também de local e concentração bacteriana após a divisão. É neste momento que o processo inflamatório causa os sintomas diarreicos. Eventualmente, ocorre a extrusão das bactérias do enterócito para a corrente linfática, onde serão fagocitados pelos macrófa- gos, irão novamente se multiplicar no interior destas células de defesa e atingir a corrente sanguínea. Descrição da Imagem: a figura apresenta um de- senho representando o processo de invasão da Sal- monella no epitélio intestinal. Ela é composta de seis desenhos separados por flechas pretas descenden- tes, indicando uma sequência de eventos. As células intestinais são ilustradas na forma de retângulos de vértices arredondados, com estruturas alongadas em sua extremidade superior, lembrando cílios, e no seu interior, uma esfera na cor roxa pálida re- presenta o núcleo. A bactéria é representada por pequenos bastões na cor roxa escura, o linfonodo se assemelha a uma bolsa em forma de feijão na cor verde, contendo dois vasos na extremidade superior, semelhante a canudos, e um vaso na extremidade inferior. A corrente sanguínea é representada por uma figura parecida com um cano na horizontal na cor vermelha. Figura 11 – Invasão da Salmonela nas células intesti- nais em direção à corrente sanguínea Fonte: Tortora, Funke e Case (2019, p. 756). UNICESUMAR 98 Dentro de 1 a 3 semanas, o indivíduo pode apresentar septicemia acompanhada de cefaleia e febre alta. Um agravante importante desse distúrbio é a capacidade da bactéria em reinfectar o intestino, uma vez que, ao infectar a vesícula biliar e se dividirem, as bactérias são enviadas ao intestino novamente na digestão (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). Por essa razão, os pacientes que sofrem dessa doença constantemente se queixam de distensão e hipersensibilidade abdominal, podendo, ainda, desenvolver quadros de hemorragia e perfuração do intestino. No entanto, se o tratamento for corretamente administrado (normalmente fluoroqui-nolonas, como o ciprofloxacino) o indivíduo se recupera e ainda desenvolve imunidade contra esse microrganismo. E mais uma informação muito importante: A Salmonella enterica sorovar Typhi não é encontrada em fezes de animais, e, sim, nas fezes humanas, por isso a bactéria tem como reservatório o próprio ser humano (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Os principais fatores de virulência dessa bactéria são três: a secreção de proteínas de invasão (cha- madas Ssps), um sistema de secreção que injeta estas proteínas para dentro dos enterócitos e genes, que codificam proteínas capazes de driblar as defesas imunológicas do hospedeiro. Com relação aos mecanismos de patogenicidade, isto é, a forma como a bactéria é capaz de mobilizar o sistema imune e causar danos ao indivíduo, envolvem a liberação de prostaglandinas e posteriores fatores inflamatórios e citocinas (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Indivíduos saudáveis podem ser portadores assintomáticos do sorovar Typhi de Salmonella. O exem- plo mais clássico é de uma cozinheira, Mary Mallon, apelidada de "Typhi Mary" ou "Maria tifoide". Era uma mulher simples, imigrante irlandesa e funcionária de várias famílias da alta sociedade no estado de Nova Iorque, e conhecida por seu famoso sorvete de pêssegos cortados à mão. Após o adoecimento de vários membros de famílias diferentes, um engenheiro sanitário foi contratado para investigar os casos e encontrou apenas um denominador comum em todos eles: Mary Mallon. A trabalhadora foi examinada à força depois de muita resistência (ela inclusive atacou um policial com um garfo!) encontrando-se a sorovar Typhi em suas fezes. Não se sabe se a condição de saúde foi devidamente explicada à cozinheira, ou se instruções de cuidado de higiene foram dadas, mas é estimado que ela tenha sido responsável pela contaminação de mais de 50 pessoas. Fonte: BLACK; BLACK, 2021. Outra enterite, denominada de desinteria bacilar, é mais um distúrbio gastrointestinal causado por enterobactérias, dessa vez, pelos microrganismos do gênero Shigella. O único reservatório desta bactéria é o intestino humano e o dos primatas, e as principais espécies são Shigella sonnei, S. dysenteriae, S. flexneri e S. boydii. Os constituintes desse gênero são capazes de produzir a Shiga toxina, estrutura que, ao adentrar nas células intestinais, bloqueia a produção de proteínas, levando à destruição celular (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). UNIDADE 3 99 No intestino, essas bactérias se ligam às células en- téricas por meio de adesinas (Figura 12), e, após a secreção de proteínas, promovem o enrugamento da membrana celular do enterócito, adentrando em sua estrutura e promovendo a proliferação bacteriana. Depois, as bactérias têm a capacida- de de invadir as células adjacentes ao utilizarem filamentos de actina, evitando a ação do sistema imunológico. E o dano tecidual é proveniente do abscesso causado pela destruição celular que as bactérias provocam ao produzirem toxinas (BLACK; BLACK, 2021). Célula M Enrugamento de membrana Abscesso mucoso Shigella O dano tecidual gera os episódios diarreicos, com fezes mucosas, compostas de alta concentração de neutrófilos e, eventualmente, presença de sangue. A dor abdominal também é presente, podendo levar ao desenvolvimento de cãibras. A lise do enterócito, adicionalmente, atrai células polimorfonucleares que intensificam o processo inflamatório, levando à febre. Os sintomas iniciam de 1 a 3 dias após a contaminação oral, e o distúrbio costuma ser autolimitado, uma vez que a bactéria raramente atinge a corrente sanguínea, sendo a administração de antimicrobianos muito rara, e as medidas de hidratação são a forma mais comum de manejo para essa doença (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Pelo fato de a contaminação ocorrer através do consumo de alimentos mal higienizados (a bactéria pode persistir por quase 1 mês na superfície de alimentos), água não tratada (consumo, banho, lavagem de roupas) e contato das mãos com a boca, medidas simples de higiene e boa cobertura de saneamento básico são suficientes para se evitar essa infecção (BLACK; BLACK, 2021). Descrição da Imagem: a figura apresenta um desenho repre- sentando o processo de invasão da Shigella no epitélio intesti- nal. Ela é composta de cinco desenhos separados por flechas pretas descendentes, indicando uma sequência de eventos. As células intestinais são ilustradas na forma de retângulos de vértices arredondados, com estruturas alongadas em sua extremidade superior, lembrando cílios, e no seu interior, uma esfera na cor roxa pálida representa o núcleo. A bactéria é representada por pequenos bastões na cor roxa escura. Figura 12 – Mecanismo de invasão entérica da Shigella spp. Fonte: Tortora, Funke e Case (2019, p. 755). UNICESUMAR 100 Em casos especialmente graves, a doença pode evoluir para dano neurológico, devido à presença de Shiga toxina, deficiência de proteínas (denominada kwashiokor), redução dos níveis de vitamina B12 e eletrólitos, levando a casos de convulsões e até ao coma (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). O gênero Shigella também possui enganos taxonômicos. As quatro espécies (S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii e S. sonnei) tiveram seus DNAs analisados e descobriu-se que, na verdade, todas são um biogrupo de espécies de E. coli, mas em nível de conhecimento e estudo, os livros preferem tratá-las por seus nomes históricos. E depois de conhecer essa variedade imensa de bactérias causadores de doenças gastrointestinais você, como bom estudante e observador, me perguntaria: professora, passaremos esta unidade inteira sem falar da Escherichia coli? Bem, querido(a) estudante, não será desta vez que nos veremos livre desse grupo altamente patogênico. A E. coli é um importantíssimo membro da família das enterobactérias, por isso, recomendo que você volte à Unidade anterior e revise os mecanismos de patogenicidade e fatores de virulência que foram extensivamente tratados na Unidade 2, porque no trato gastrointestinal, ela é capaz de utilizar dos mesmos mecanismos para promover a infecção. Para as infecções gastrointestinais, os mais importantes, no entanto, são a expressão de adesinas em sua superfície e a produção de toxinas. A E. coli é membro participante da microbiota intestinal, e para que cause doenças gastrointestinais, o indivíduo deve entrar em contato com as cepas patogênicas através de contaminação fecal-oral, seja por consumo de água ou alimentos contaminados, ou pelo contato direto da mãos e instrumentos colonizados. Para estudarmos melhor, e, também, facilitar suas pesquisas posteriores de aprofunda- mento de conteúdo, vamos tratar as unidades patogênicas divididas em grupos. No grupo das E. coli enteropatogênicas (EPEC), bactérias responsáveis pela maior ocorrência de diarreia em países desenvolvidos, os microrganismos são capazes de formar estruturas em pedestal (Figura 13), a qual, além de ser um mecanismo de proteção à bactéria e facilitador de sua disseminação, é capaz de eliminar as microvilosidades dos enterócitos, causando dano tecidual (que gera os episódios diarreicos) e, ainda, prejudicando a absorção de nutrientes (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Eles são gerados por expressão gênica de proteínas virulentas codificadas por regiões denominadas “locus de apagamento de enterócitos” (LEE), possuindo mais de 40 genes responsáveis pela destruição celular (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). UNIDADE 3 101 No grupo das E. coli enteroinvasivas (EIEC), além de também serem capazes de formar a estrutura em pedestal (Figura 13), é neste grupo que se incluem os biotipos de Shigella, sendo o mecanismo de patogenicidade muito semelhante ao citado na Figura 12. Esse tipo é mais raro de ser identificado e as cepas patogênicas estão mais associadas aos sorotipos O124, O143, e O164 (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Esse grupo também possui em sua superfície a expressão de um antígeno, chamado antígeno K, que possibilita a aderência das bactériasàs células para desempenhar seu mecanismo de patogenicidade (BLACK; BLACK, 2021). No caso das E. coli enteroagregativas (EAEC), esse grupo está presente apenas em fezes huma- nas, e a diarreia é provocada em razão da liberação de toxinas e liberação de citocinas inflamatórias e agregação de células imunológicas (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). São classificadas dessa forma por se assemelharem a tijolos empilhados quando semeadas junto aos enterócitos (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). Você pode observar esse fenômeno na Figura 14, indicado pela flecha branca. Descrição da Imagem: na figura há uma imagem pro- veniente de microscópio eletrônico, na qual, as bactérias estão representadas em laranja, aderidas aos enterócitos, ilustrados em verde. A bactéria aderida à superfície da célula lembra uma estrutura de cálice. Na extremidade inferior direita, há a sigla “SEM” (Scanning Electron Mi- croscope), escrita em branco no interior de um quadro vermelho, ao lado um traço na horizontal com a escrita “1µm” abaixo, indicando o tamanho da bactéria. Figura 13 – Formação em pedestal em enterócitos provo- cada por cepas de E. coli Fonte: Tortora, Funke e Case (2019, p. 762). Descrição da Imagem: na imagem há a foto de uma lâmina em microscópio ótico, aumento de 1000x de uma amostra de células intestinais impregnadas com bactérias do tipo EAEC. O fundo da imagem é levemente esverdea- do, e as bactérias podem ser observadas em formato de bacilo. No centro da imagem há uma flecha branca indicando a formação de “tijolos empilhados”. Figura 14 – Morfologia da EAEC em “pilhas de tijolos”. Fonte: Braga (2013, p. 60). UNICESUMAR 102 As cepas de E. coli enterohemorrágica (EHEC), por sua vez, é muito conhecida dos médicos e profissionais da saúde. Algumas bactérias desse grupo também possuem a capacidade de produção e secreção da Shiga toxina, sendo chamadas, nesse caso, de E. coli produtora de Shiga toxina (STEC), sendo mais comumente associados a elas o sorotipo O157:H7 (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019) A toxina é capaz de desencadear episódios diarreicos severos, sendo as fezes ricas em material mucoso e sangue, após 3 a 4 dias do contato com a bactéria. As toxinas podem ser do tipo STX1, que é semelhante à produzida pela Shigella, e STX2, que promovem a inibição de proteínas celulares nos enterócitos, levando à apoptose (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). O nome dado ao sorotipo O157:H7 se refere à caracterização dos antígenos somáticos (O) e flagelar (H) na cepa da E. coli. Esse sorotipo específico é capaz de produzir as toxinas Shiga 1 e 2, habilidade que é obtida a partir de um plasmídeo por transferência lateral. Essa troca de plasmídeos pode transformar uma cepa inócua em letal, e são necessárias apenas 100 células patogênicas para iniciar uma infecção. A STEC já é a causa mais comum de insuficiência renal aguda em crianças nos EUA, devido a sua toxina causar a síndrome urêmica aguda (BLACK; BLACK, 2021). Um fato interessante e que desafia o tratamento contra este tipo específico de bactérias é o fato de a administração de antibioticoterapia piorar o estado do paciente, uma vez que os an- timicrobianos causarão a lise da bactérias, liberando essa toxina para o ambiente externo, e piorando os sintomas desencadeados por ela. Animais bovinos são os reservatórios clássicos desse grupo, podendo contaminar tanto as carcaças quanto o leite produzido pelas vacas. A liberação dessa toxina, mais especificamente a STX2, pode ainda causar a síndrome urêmica hemorrágica, causando trombocitopenia e anemia hemorrágica, e que posteriormente afeta o tecido renal por causar a destruição do endotélio e deposição de trombina, o que gera distúrbios glomerulares, e futura falência renal (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Você sabia que a E. coli é um microrganismo indicador? Uma vez que se encontre presente em água contaminada com material fecal, pode indicar indiretamente a presença de outros microrganismos patogênicos. No Brasil, a pesquisa dela em águas tratadas é análise mandatória de acordo com a Portaria GM/MS nº 888, de 4 de maio de 2021. UNIDADE 3 103 Com relação à E. coli enterotoxigênica (ETEC), o principal mecanismo de patogenicidade é a libe- ração também de uma enterotoxina, codificada por um plasmídeo, e que permite a expressão de pilis e fímbrias em sua superfície. A doença costuma acometer mais as crianças menores de 5 anos. Assim como os demais grupos (com exceção da EIEC), ela também não promove a invasão de outros órgãos, ficando confinada no lúmen intestinal, causando os sintomas diarreicos pela adesão e destruição tecidual do epitélio intestinal, e pela produção de toxinas termotolerantes (BLACK; BLACK, 2021). A E. coli é a principal bactéria encontrada em amostras que caracterizam a diarreia do viajante, “barriga de Deli” ou “vingança de Montezuma” (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021) quando analisadas, estando a ETEC em primeiro lugar, seguida da EAEC. A doença é mais grave em lactentes, crianças e idosos, os quais estão sujeitos à grave desidratação. É particularmente perigosa aos lacten- tes pelo fato de sua microbiota intestinal ainda não estar completamente formada, não contendo as bactérias benéficas que competem por nutrientes com as patogênicas. Os migrantes costumam se automedicar com antimicrobianos, mas essa conduta não é a mais indicada, uma vez que influencia muito no desenvolvimento de resistência bacteriana. A doença pode ser causada também por rota- vírus, protozoários, como a Giardia e Entamoeba, e outras bactérias como a Salmonella, Shigella e Campylobacter (BLACK; BLACK, 2021). E, para finalizar o grupo das enterobactérias, vamos concluir esta parte teórica com os últimos integrantes deste grupo: os gêneros Campylobacter, Yersinia e Helicobacter. Algumas cepas de Campylobacter das espécies jejuni e fetus podem ser detectadas em alimentos e, também, na água, principalmente na superfície de aves cruas mantidas em água não clorada e leite cru, de forma que a falta de pasteurização ou má cozimento destes alimentos pode gerar processos infecciosos. A doença causada por essas bactérias geram diarreia, dores abdominais e febre, e o tratamento, assim como na maioria das enterites, também é a reposição hidroeletrolítica do paciente (BLACK; BLACK, 2021). A Yersinia enterocolitica é um microrganismo encontrado naturalmente em ambientes ma- rinhos, mas sobrevive facilmente em alimentos como frutos do mar e leite por longo período de tempo, devido a sua capacidade de crescer e se multiplicar em temperaturas de refrigeração. A bactéria produz uma enterotoxina que é responsável pelo dano tecidual e sintomas, que envolvem eventos diarréicos e dor abdominal acima do comum (BLACK; BLACK, 2021). Atualmente, a análise de Yersinia enterocolitica não é muito comum em amostras de fezes, mas usual em aná- lise de alimentos, uma vez que a pesquisa dessa bactéria tem importância principalmente em produtos lácteos e destinados a pacientes hospitalizados. Esta professora que vos fala analisa atualmente a presença de Yersinia em amostras de dieta enteral, e fico feliz em dizer que em três anos, nunca identifiquei amostras positivas. No entanto, a vivência no laboratório com essa bactéria é muito rica, visto que as provas bioquímicas que envolvem a sua identificação são muito diferentes das usualmente utili- zadas na rotina. UNICESUMAR 104 A Helicobacter pylori (Figura 15), por sua vez, não está associada à ocorrência de enterites, mas ao diagnóstico das úlceras pépticas. Além de ser um cofator para o câncer de estômago, essa bactéria tem a capacidade de converter ureia em amônia, substância que neutraliza o suco gástrico, explicando a razão desse microrganismo ser resistente em ambiente de pH ácido. A Helicobacter é capaz de infectar as células epiteliais do estômago, gerando lesões que podem se estender até as regiões do esôfago e duodeno, evoluindo para ulceração no caso de processos inflamatórios não tratados. A gastrite podeser tratada com inibidores da bomba de prótons (como o omeprazol) e a infecção, que não se tem ainda elucidada a via de entrada e saída, pode ser combatida com a administração de antimicrobianos como claritromicina e tetraciclina (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). Descrição da Imagem: na imagem na imagem há uma ilustração em 3D da bactéria H. pylori. O fundo da imagem é preto fosco, e a bactéria é ilustrada na cor laranja, em bastão no formato semelhante a um parafuso grosso. Em sua superfície existem inúmeros pilis na tonalidade laranja clara, e na extremidade posterior há a presença de flagelos, lembrando a estrutura de uma raiz, também em alaranjado. Figura 15 – Representação tridimensional da bactéria Helicobacter pylori. Fonte: Shutterstock ([2023h], on-line). UNIDADE 3 105 E como eu sou uma ótima amiga na hora do estudo, no Quadro 2 a seguir, eu resumi para você, alu- no/a, as principais bactérias que vimos nesta Unidade e seus mecanismos de patogenicidade, antes de entrarmos efetivamente nos métodos diagnósticos das infecções gastrointestinais. Produção de Toxinas Invasão tecidual Mecanismos de aderência Staphylococcus aureus Shigella spp E. coli enterohemorrágica (EHEC) Clostridium perfringens e Clostridium botulinum Salmonella spp Bacillus cereus E. coli enteroinvasiva (EIEC) E. coli enteroaderente (EAEC) Aeromonas spp Yersinia enterocolitica Vibrio cholerae e V. parahae- molyticus Campylobacter jejuni E. coli enteropatogênica (EPEC)E. coli enterotoxigênica (ETEC) e. coli enterohemorrágica (EHEC) Helicobacter pylori Como um/a bom/a aluno/a, e já preparando suas habilidades para seu futuro analista, você deve ter reparado que nesta unidade não tratamos das conhecidas parasitoses e viroses gastrointestinais. Sabendo que o Brasil é um país ainda em desenvolvimento, e que é muito comum os médicos solicitarem não apenas o bacteriológico de fezes, mas também as análises parasitológicas e virais por conta de nossa estrutura epide- miológica atual, te convido a ouvir alguns minutos sobre essas doenças para aprender um pouco mais sobre elas e descobrir o porquê de serem tão importantes no cenário brasileiro. Quadro 2 – Mecanismos de patogenicidade de enterites e gastroenterites Fonte: adaptado de Murray; Rosenthal e Pfaller (2021); Black e Black (2021); Sommer e Bäckhed, (2013). https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/14617 UNICESUMAR 106 Para estudarmos sobre a pesquisa e identificação destas bactérias em material clínico, nada mais comum que começarmos pelos requisitos envolvendo a amostra. Todos os procedimentos citados a partir daqui fazem parte do Manual de Procedimentos Básicos em Microbiologia para o Controle de Infecção Hospitalar (BRASIL, 2000), mas é importante ressaltar que os laboratórios aderem a metodologias diversas para o processamento de amostras, dependendo da demanda, dos materiais e fornecedores disponíveis e do perfil epidemiológico de determinada região. O material para a coprocultura deve ser coletado no início da fase aguda da doença, porque há maiores chances de existirem altas concentrações dos microrganismos nas amostras. A coleta pode ser realizada diretamente em frascos estéreis contendo meios de transporte, como o Cary Blair ou solução salina tamponada (que contém constituintes para equilíbrio osmótico e controle de pH), e esse é o primeiro ponto onde o profissional da saúde pode fazer a diferença. Na hora de instruir os pacientes, é importante explicar que a coleta deve ser o mais simples pos- sível, sem necessidade de grandes quantidades de amostra (normalmente, o volume que preencha uma colher de sobremesa já é suficiente para a realização da coprocultura). Além disso, é importante que o paciente feche bem o frasco, e que encaminhe imediatamente a amostra para o laboratório, do contrário, a amostra deverá ser armazenada sob refrigeração (mecanismo não indicado porque a variação de temperatura pode injuriar os microrganismos na amostra). No ambiente hospitalar, é possível realizar a coleta de swab retal, utilizando material estéril após umedecê-lo em salina estéril, e realizando a coleta diretamente no esfíncter retal. Os meios de transporte não possuem nutrientes, pois a finalidade destes meios é apenas manter o material clínico em condições adequadas para sua posterior análise. Por isso, apenas ativos como cloreto de sódio, tampões e antioxidantes são adicionados as suas formulações. Os médicos também podem solicitar contagem de leucócitos nessas amostras, e neste caso, apenas fezes frescas e não processadas devem ser utilizadas. Essas análises costumam nortear os profissio- nais em relação às enterites, uma vez que, em caso de suspeita de intoxicações isoladas, a presença de leucócitos é incomum. Dentre os materiais inadequados para análise incluem-se os materiais de trato digestivo transporta- dos fora da refrigeração, swabs secos, amostras contaminadas com urina ou papel higiênico e amostras em frascos não fornecidos pelo laboratório. A técnica da coprocultura é relativamente simples, sendo sua execução modificada dependendo do microrganismo que se deseja procurar. Como as enterobactérias são mais comumente encontradas UNIDADE 3 107 como patogênicas em amostras de fezes, a prática mais comum envolve o uso de meios de cultura que pretendam isolar esses microrganismos, sendo mais aplicado o seguinte procedimento: 1- Se o material for as fezes, semear diretamente uma alçada (utilizando a alça bacteriológica) diretamente em meio de cultura MacConkey e ágar Salmonella/Shigella (SS). Se o material clínico for proveniente de swab, ele pode ser diretamente semeado neste meio de cultura. Em caso de fezes sólidas, o analista precisa preparar uma suspensão a 10% deste material (1g de amostra para 10mL de salina estéril), e depois, realizar a semeadura. Se houver intenção de pesquisa da Campylobacter, o material deve ser semeado também em meio Karmali (que é composto de antibióticos que inibem outras enterobactérias e microrganismos da flora normal). Além disso, é importante realizar também a transferência de material para um caldo de enriquecimento, como o caldo selenito, que possui consti- tuintes que facilitam o crescimento de alguns organismos, como a Salmonella, Shigella, EPEC e EIEC. 2- As placas de MacConkey e SS são incubadas a 35ºC +/- 1ºC por 18 a 24 horas, as placas contendo meio Karmani a 42ºC em ambiente com 5% de gás carbônico, e o caldo selenito por 12 a 18 horas a 35ºC. 3- Após o período de incubação, analisar a presença de colônias suspeitas: Em ágar MacConkey, colônias lactose positiva e negativa devem ser selecionadas. Em ágar SS, colônias pequenas e produtoras ou não de ácido sulfídrico (revelado pela coloração preta da colônia, como na Figura 16) devem ser selecionadas. 4- As colônias selecionadas devem ser repicadas (ou seja, transferidas com auxílio de uma alça bacteriológica) para os meios de cultura de identificação bioquímica. Paralelo a isso, semear uma alçada proveniente do caldo selenito também em ágar SS e MacConkey e submetê-los à incubação em tempo e temperatura citados no item 3. Esta etapa é importante porque o caldo pode recuperar células injuriadas que não tiveram a capacidade de crescer diretamente em meio de cultura. Depois da incubação, proceder com o cultivo de colônias suspeitas em meio de cultura para identi- ficação bioquímica. Descrição da Imagem: na imagem há uma foto de um analista, calçan- do luvas cirúrgicas brancas, que segura em sua mão esquerda uma placa de ágar SS, fundo amarelo, contendo colônias pretas em sua superfície. Figura 16 – Ágar SS com colônias pro- dutoras de ácido sulfídrico. Fonte: Shutterstock ([2023i], on-line). UNICESUMAR 108 Dependendo do perfil de resultados nos testes bioquímicos, a bactéria suspeita se enquadra em deter- minados grupos de bactérias. Não trataremos da identificação bruta, afinal, existem diversos protocolos de execução, e, ainda, testes miniaturizados (diversas reaçõesbioquímicas que ocorrem paralelamente, condicionadas em mesmas condições de temperatura e umidade) que fornecem resultados pautados em bases de dados onde inúmeras bactérias estão registradas de acordo com seu perfil bioquímico. Os ensaios bioquímicos mais comumente aplicados são a fermentação da glicose e lactose, prova da motilidade, descarboxilação da lisina, produção de ácido sulfídrico e gás, prova da oxidase, produção de indol e desaminação de aminoácidos, como a fenilalanina. Essas provas, geralmente, envolvem a mudança de coloração ou aspecto do meio. Na Figura 17, você pode observar a prova bioquímica do citrato, no qual o meio de cultura avalia a utilização de citrato como única fonte de carbono. O meio possui citrato e indicador de pH (azul de bromotimol), e a metabolização do citrato aumenta o pH do meio, alterando a coloração do meio de verde para azul (Figura 17). É importante observar também que, algumas especificidades das amostras direcionam para a pesquisa de determinados patógenos, como a existência de sangue e muco ser pré-requisito para pesquisa de E. coli EHEC. A faixa etária do paciente e a requisição médica também são norteadores importantes para a realização da coprocultura. Ademais, protocolos específicos para pesquisa de Bacillus cereus, Staphylococcus aureus e Vibrio spp. também podem ser realizados, mas nesses casos, meios de culturas específicos como o MYP (manitol, gema de ovo), Baird-Parker e TCBS (ágar tiossulfato, citrato, bile e sacarose) devem ser utilizados, respectivamente. Além disso, testes adicionais como pesquisa da toxina no soro, no caso de investigação de doen- ças causadas por clostrídios e sorotipagem, no caso dos diversos tipos de E. coli, também devem ser considerados. Para a E. coli EHEC já existem meios de cultura comercialmente disponíveis que iden- tificam especificamente o sorotipo O157, como o Chromagar™ O157, que torna a colônia da E. coli numa coloração rosa pálida (Figura 18). Métodos de detecção molecular (PCR) também podem ser utilizados, em casos mais graves, para definição de terapia farmacológica adequada. Descrição da Imagem: A figura apresenta uma foto contendo três tubos de ensaio. Os dois primeiros (da esquerda para a direita), tem meio de cultura na sua base, na coloração verde escura e tampas laranjas. O terceiro e último tubo, na extrema direita, possui tampa laranja e meios de cultura na base do tubo na coloração azul. Figura 17 – Reação em ágar Citrato de Simons. Fonte: Shutterstock ([2023j], on-line). UNIDADE 3 109 Não é incomum que o corpo clínico decida pela análise de materiais de consumo suspeitos, como água e alimentos, no caso de ocorrências mais graves ou que tenham importância epidemiológica. Estas medidas também podem ser tomadas por órgãos regulamentadores, como a Anvisa, para monitora- mento e controle de surtos. Nos dias de hoje, as regulamentações que cuidam do monitoramento da água e alimentos, comercializados e distribuídos no território brasileiro, são a RDC nº 331, de 23 de dezembro de 2019, que dispõe sobre os padrões microbiológicos para os alimentos e sua aplicação (BRASIL, 2019a); a Instrução Normativa nº 60, de 23 de dezembro de 2019 (BRASIL, 2019b), que es- tabelece as listas de padrões microbiológicos para alimentos; e a Portaria GM/MS nº 888, de 4 de maio de 2021 (BRASIL, 2021), que dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade. Chegando ao fim desta unidade, não é nada difícil dizer o porquê de ser tão importante o conhe- cimento profundo e o interesse genuíno na área dos distúrbios gastrointestinais, não é mesmo? Fica evidente a necessidade de mais profissionais que entendam o paciente integralmente, desde as suas dores e medos, até as potenciais causas de suas enfermidades. Se voltarmos ao caso estudado lá no início desta unidade sobre a explosão de cólon, podemos concluir, primeiro, que o conhecimento sobre a microbiota normal de sistemas, como o digestório, pode ser algo determinante na conduta médica de uma situação. Ou você pensou que saber que bactérias fermentam açúcares no trato gastrointestinal não seria importante? Em ambos os artigos analisados foi concluído que nos dois casos, a explosão de cólon foi devido ao acúmulo de gases na parte distal do intestino, ge- rados pela fermentação do manitol, o qual é utilizado na preparação de pacientes que serão submetidos à colonoscopia. Em posse desse conhecimento, você pode instruir pacientes e grupos clínicos quanto à importância da preparação para realização de procedimentos, como a colonoscopia, prevenindo, assim, acidentes ou desfechos indesejáveis que impactam diretamente na vida de outro indivíduo. Descrição da Imagem: na imagem há uma foto do ágar cromogênico contendo inúmeras colônias brancas, azuis e rosas. Na placa há uma escrita denominada “Coliformes” indicando serem estas as colônias azuis. Há também a escrita “Proteus” que indica as colônias brancas e “E coli O157”, a escrita que indica as colônias rosas pálidas Figura 18 – E. coli EHEC em Chromagar™ O157. Fonte: Duran et al. (2019, p. 7341). UNICESUMAR 110 Mais do que isso, conhecer sobre as bac- térias e suas particularidades acrescenta ainda maiores habilidades e segurança nas análises clínicas, uma vez que intercorrên- cias também podem acontecer na rotina laboratorial. Por experiência própria, não foram raras as vezes que eu tive de recolher cacos de vidro espalhados pelo chão quando tubos contendo amostras de Salmonella e Escherichia coli simplesmente “explodiam” em decorrência da produção de gás e me- tabólitos a partir dos nutrientes dos meios de cultura (um dos mantras do laborató- rio, inclusive é “jamais incubar caldos de enriquecimento completamente fechados. Tubos completamente fechados explodem”). Além disso, o compromisso com o ma- nejo correto da amostra e o cuidado com a rotina laboratorial vão muito além de simplesmente liberar um resultado analí- tico. Por exemplo, um papel importante de laboratórios clínicos na comunidade é, in- clusive, a detecção de surtos diarreicos, isso porque, quando aplicável, esses casos po- dem ser notificados às autoridades de Saúde Pública, influenciando no desenvolvimento de planos de contenção, investimento em infraestrutura e saneamento básico, trans- formando um relatório laboratorial numa ferramenta poderosa de respaldo científico para o aprimoramento da saúde em deter- minadas populações e regiões. 111 MICROBIOLOGIA DO TRATO GASTROINTESTINAL Diagnóstico Doenças do estômago e intestino Doenças da boca Agente etiológico Formas de contaminação Invasão tecidual Produtores de toxinas Contaminação e Tratamento Condição da amostra Meios de cultura para Enterobactérias Mecanismos de aderência Meios de cultura para outros microrganismos 112 1. As enterites ou inflamações do intestino são distúrbios gastrointestinais de importância epi- demiológica e de saúde pública. Assinale a alternativa que contenha um bacilo Gram positivo, anaeróbio estrito, patogênico e causador de eventos diarreicos em ambientes hospitalares: a) Lactobacillus spp. b) Listeria monocytogenes. c) Staphylococcus aureus. d) Clostridium difficile. e) Escherichia coli. 2. As doenças gastrointestinais podem ser associadas a epidemias e pandemias, devido ao seu mecanismo de infecção e alta resistência dos microrganismos ou devido ao estado imunológi- co do paciente. Assinale a alternativa que contenha o microrganismo da epidemia/pandemia gastrintestinal citada, e o respectivo mecanismo de contaminação. a) Epidemia/pandemia de peste negra, causada pela Yersinia pestis, e de contaminação oral fecal. b) Epidemia/pandemia de cólera, causada pelo Vibrio cholerae, e de contaminação fecal-oral. c) Epidemia de cólera, causada pelo Vibrio cholerae, e de contaminação aérea por perdigotos e fluidos corporais. d) Epidemia/pandemia de peste negra, causada pela Yersiniaenterocolitica, e de contaminação fecal-oral. e) Epidemia/pandemia de cólera, causada pela Salmonella enterica subespécie Choleraesuis, de contaminação fecal-oral. 3. Os ensaios croprocológicos exigem muita seriedade e habilidade técnica do analista labora- torial. Com relação à coprocultura, assinale a alternativa correta: a) Os ensaios de coprocultura excluem a necessidade de etapas de enriquecimento, uma vez que a carga bacteriana em distúrbios diarreicos é sempre elevada. b) Os ensaios de coprocultura costumam aplicar meios de cultura seletivos e diferenciais e, normalmente, as etapas de enriquecimento auxiliam na recuperação de microrganismos injuriados. c) Os ensaios de coprocultura costumam aplicar meios de cultura seletivos e diferenciais e, normalmente, as etapas de enriquecimento auxiliam na recuperação de microrganismos da microflora intestinal. d) Os ensaios de coprocultura necessitam de etapas de enriquecimento, mas o uso de meios diferenciais e seletivos é opcional, uma vez que, em sua maioria, os distúrbios gastrintestinais são causados por bactérias Gram positivas. e) Os ensaios de coprocultura excluem a necessidade de etapas de enriquecimento, uma vez que as condições amostrais das fezes garantem a preservação correta da amostra. 4 Nesta unidade, revisitaremos os conceitos de infecções sexualmente trans- missíveis, entendendo seus impactos no mundo todo ao longo do tempo. Serão relembrados, também, a estrutura dos órgãos genitais masculinos e femininos, os fatores que contribuem para o desenvolvimento de doenças do aparelho genital, incluindo itens de pré-disponibilidade e comporta- mentos de risco. Aprenderemos sobre os micro-organismos patogênicos mais comuns, seus mecanismos de patogenicidade, fatores de virulência e quais os sinais e sintomas gerados no curso de uma infecção sexual- mente transmissível. Além disso, veremos os métodos diagnósticos e suas peculiaridades e as exigências que devem ser seguidas na busca por bons resultados analíticos. Por fim, sedimentaremos a missão primordial que o analista de laboratório desempenha diante do combate dessas patologias, assim como a sua influência positiva e direta na sociedade. Aspectos Microbiológicos, Clínicos e Laboratoriais Das Infecções Sexualmente Transmissíveis Me. Suelen Eloise Simoni UNICESUMAR 114 Imagine que você está de férias da microbiologia… Você deixou seu laborató- rio organizado, os controles de qualidade estavam todos conformes, e tudo que você mais quer é se esquecer um pouco das bactérias e relaxar a cabeça. Assim, você pega um avião para realizar aquilo que é sonho para muita gen- te: ir à Florença, na Itália! Em seu primeiro passeio, você escolhe conhecer a Piazza della Signoria e encontra esta estátua: Descrição da Imagem: na figura, há uma fotografia de uma escultura em bronze, com tons verdes escuros e acinzentados. A escultura é de um homem atlético nu, em pé, de cabelos encaracolados e utilizando um elmo grego na cabeça, cuja perna direita está esticada e a esquerda levemente dobrada. Em sua mão direita, ele segura uma faca de um gume longa, na horizontal, e, na mão esquerda, com seu braço levantado, a cabeça de uma mulher decapitada, de cabelos longos. Em seu torso, a escultura possui uma faixa na diagonal, com origem no ombro direito que termina próximo à cintura esquerda. Abaixo dela, há uma base retangular, posicionada na vertical, e, em seus lados, constam estátuas menores de deuses e deusas gregos. Figura 1 – Perseu com a cabeça de Medusa, Benvenuto Cellini, 1545 / Fonte: Shutterstock ([2023a], on-line). Se eu dissesse que a sua tentativa de se esquecer, complementarmente, da microbiologia pode fracassar se você procurar a fundo a história dessa escultura? Você poderia imaginar que o estudo dos pequenos organismos pudesse influenciar tanto a sociedade, a ponto de aparecer e dar significância até para monumentos artísticos renascentistas como esse? Ao final desta unidade, além de desvendar a doença que esse brilhante escultor teve, você irá se impressionar com o desfecho dessa história. UNIDADE 4 115 O criador da escultura, Benvenuto Cellini, foi um artista que se envolveu em vários escândalos sexuais e violentos, e conviveu com uma doença infecciosa desde os 29 anos de idade – mesmo que haja uma correlação entre a evolução dela e os sintomas neurológicos, não temos dados suficientes para afirmar que o seu comportamento era fruto de uma sequela. No entanto, é sabido que o artista era profundamente resistente às medidas de controle de sua própria doença, o que conferiu, a sua vida, alguns desdobramentos impressionantes – mas o que tudo isso tem a ver com a microbiologia? Até o momento, estudamos infecções, por vezes, autolimitadas ou que não oferecem dano a longo prazo para a vida em sociedade de forma tão pronunciada, porém, quando precisamos estudar as doenças transmitidas sexualmente, muitos dos indivíduos que possuem essas patologias podem negligenciar a própria saúde em detrimento de diversa causas, como vergonha, medo e desinformação ou indiferença, como no caso do ilustre personagem citado nesta unidade. Sugiro que continuemos nesse clima de contextualização histórica antes de entrarmos completa- mente no mundo da microbiologia. Procure em bases de pesquisa (por exemplo, PubMed e MEDLINE) dados sobre a primeira epidemia conhecida de infecções sexualmente transmissíveis (ISTs), associando seus conhecimentos prévios acerca do assunto em relação à forma de contágio e como a realidade descrita em suas pesquisas pode ter contribuído para a disseminação dessa condição. Então, pelos seus achados, você já é capaz de dizer qual é a principal forma de combate às ISTs? Qual o papel profissional e social que o analista de laboratório teria diante desse problema de saúde pública e de qual maneira você poderia agir para auxiliar pacientes e outros profissionais que se deparam com essa problemática? O espaço a seguir está inteiramente disponível para você registrar suas principais conclusões e acessá-las sempre que necessário. UNICESUMAR 116 Como vimos na Unidade 2, os sistemas genitais feminino e mas- culino estão intimamente ligados com o sistema urinário e, por isso, algumas infecções que acometem a parte distal da uretra podem ser causadas por micro-organismos patogênicos da região ge- nital. Com relação ao sistema feminino, essa proximidade oferece mais riscos, motivo pelo qual começaremos por ele. Os ovários, direito e esquerdo, possuem, em seu interior, os folículos ovarianos responsáveis pela liberação dos óvulos durante o período fértil da mulher. De cada ovário, sai uma tuba uterina, em que, normalmen- te, em casos de gestação, ocorre a fertilização pelo espermatozoide. As tubas uterinas convergem em uma estrutura muscular lisa e mucosa, o útero, local de desenvolvimento do óvulo fertilizado, quando fixado ao endométrio (em úteros não gestacionais, o en- dométrio descama mensalmente, dando origem à menstruação). Em seguida, tem-se a vagina, tecido mucoso que se estende até o colo do útero, abertura distal e estreita que se comunica com a área externa. Essa conformação anatômica permite a passagem do fluxo menstrual e o recebimento de espermatozoides durante o ato sexual (BLACK; BLACK, 2021). Mais que isso, a estrutura celular de algumas regiões permite a pro- dução de inúmeros nutrientes que influenciam o estabelecimento de microbiota, importante e protetora. Você consegue responder qual é o principal nutriente e qual gênero é mais importante para a defesa do trato genital feminino? É claro que me refiro aos Lactobacillus, nutridos pelos glicídios produzidos pelas células vaginais. Exter- namente, o aparelho genital feminino é composto por clitóris, dois pares de dobras de pele, denominadas de grandes e pequenos lábios, e glândulas de Bartholin, estruturas responsáveis por secretar muco. Já o aparelho genital masculino (Figura 2) é constituído pelos testículos,que, além de produzirem espermatozoides (arma- zenados no epidídimo), ainda liberam testosterona na corrente sanguínea. As vesículas seminais e a próstata são responsáveis pela liberação de substâncias que se misturam aos espermatozoides pelos ductos ejaculatórios e deferentes, constituindo o sêmen, responsável por lubrificar o sistema genital feminino e liberado pelo pênis (a partir do óstio externo da uretra) durante a relação sexual. Assim como o aparelho genital feminino, o masculino possui alguns mecanismos de defesa, como a produção de liso- zima e espermina, enzimas que destroem os patógenos invasores (BLACK; BLACK, 2021). UNIDADE 4 117 Sacro Cóccix Epidídimo Testículo Escroto Óstio externo da uretra Prepúcio Glande do pênis Pênis Uretra Próstata Sínfise púbica Bexiga urinária Ducto (vaso) deferente Diafragma urogenital Ânus Glândula bulbouretral (de Cowper) Reto Ducto ejaculatório Vesículas seminal Descrição da Imagem: a figura apresenta um desenho do aparelho genital masculino, observado a partir de um corte sagital, de forma que os órgãos são vistos de lado. Do lado esquerdo, estão alguns itens anatômicos mais próximos das costas, como o sacro, osso em forma de “C” que possui, em sua extremidade final, o cóccix, um osso em formato triangular invertido. Anterior a essa região, corado de vermelho e também em formato curvo, há o fim do aparelho intestinal, caracterizado pelo reto e pelo esfíncter do ânus. Na região central da imagem, há uma cavidade de paredes com vilosidades musculares, representando a bexiga. Entre o reto e a bexiga, há a vesícula seminal. Abaixo da bexiga, entre a sínfise púbica (região óssea da púbis) e o reto, há a próstata. Um canal que atravessa a próstata, que se comunica às vesículas seminais e, conforme assume caminho descendente, se une ao ureter e termina na uretra, a qual fica central ao corpo esponjoso e cavernoso do pênis. Na extremidade peniana, há a glande e, recobrindo o órgão, o prepúcio, uma camada de pele fina e elástica. Abaixo do pênis, há o escroto, uma bolsa que abriga o testículo, parte em formato oval, que possui, em sua extremidade superior, o epidídimo, parte da gônada de calibre fino em formato curvado. Do epidídimo, parte um vaso de calibre fino, que se comunica diretamente com as vesículas seminais. As partes ósseas da imagem são representadas em branco, os tecidos musculares lisos, em vermelho, e os tecidos adiposos de preenchimento, em amarelo. Figura 2 – Aparelho genital masculino. / Fonte: Black e Black (2021, p. 1.623). Você sabia que as glândulas mamárias, por nutrirem a prole, são consideradas parte do aparelho genital feminino? A produção de leite ocorre dentro dessas glândulas mamárias durante a gestação, que se desenvolvem durante a puberdade e constituem de células de gordura e ductos transpor- tadores. Diferentemente dos outros materiais biológicos, exames de imagem ou teciduais (como biópsia) são os mais adequados para identificação de distúrbios da glândula mamária (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). No Brasil, o Ministério da Saúde e os órgãos municipais possuem um forte programa de incentivo à prevenção de câncer de mama em mulheres, intensificado todos os anos pelo chamado “Outubro Rosa”. UNICESUMAR 118 Nem sempre a existência de uma doença genital está di- retamente ligada à atividade sexual, sendo que os hábi- tos de higiene influenciam diretamente na saúde desses órgãos. Além disso, a utilização de medicamentos, como antimicrobianos, pode afetar na microbiota, reduzindo, naturalmente, as defesas do organismo. Na vaginite bac- teriana, por exemplo, inúmeras bactérias oportunistas podem colonizar e infectar as regiões externa e interna do aparelho genital feminino, facilitadas por fatores prediti- vos, como gravidez, uso de contraceptivos orais e diabetes melito, condições que alteram os níveis hormonais de pro- gesterona e estrógeno e que levam a modificações do pH vaginal (BLACK; BLACK, 2021). A Gardnerella vaginalis, uma bactéria pleomórfica (ora bacilo, ora cocobacilo) e Gram variável, se prolifera nas situações em que a concentração de Lactobacillus diminui, reduzindo pH vaginal e auxiliando nas inte- rações bióticas entre esta bactéria e os demais anaeróbios (como Bacteroides e Peptostreptococcus), agravando a vaginite (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). O principal sintoma clínico do distúrbio é a presença de corrimento turvo e espumoso e, entre as caracterís- ticas importantes observadas em esfregaços de materiais biológicos (normalmente coletados por swab), estão, prin- cipalmente, o pH da amostra vaginal acima de 4,5 e o teste de Whiff ou teste das aminas, que consiste em submeter a amostra a uma gota de hidróxido de potássio a 10% e observar a geração de odor característico de aminas (o cheiro lembra muito o odor de peixe podre). Além dis- so, microscopicamente, a presença das chamadas “clue cells” também auxilia e direciona os analistas em direção a essa triagem bacteriológica. Estas células perdem a sua característica morfológica original, pela presença de alta concentração de cocobacilos de G. vaginalis aderidas ao seu redor, tornando-se de aspecto pontiagudo e granular (Figura 3) (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). A vaginose bacteriana pode provocar partos prematuros e, por isso, o tratamento deve ser realizado durante a gestação, por meio do uso de antimicrobianos, como o metronidazol (BLACK; BLACK, 2021). UNIDADE 4 119 Explorando, especificamente, as ISTs, uma das primeiras co- nhecidas é a infecção causada pela bactéria Chlamydia tra- chomatis, um patógeno intra- celular obrigatório que possui duas conformações em seu ci- clo, uma extracelular infectan- te, chamada de corpúsculo elementar, e uma intracelular não infectante (mas metaboli- camente ativa), denominada de corpúsculo reticular. Como exemplo, o ciclo da bactéria é ilustrado na Figura 4. Célula epitelial vaginal Clue cell Bactéria Gardnerella vaginalis Núcleo da célula epitelial Célula normal Descrição da Imagem: a figura apresenta uma fotografia de um material vaginal em microscópio. No centro da imagem, há duas células: a superior em formato quase quadrangular, de bordas indefinidas e textura quase granular, na qual não é possível enxergar nenhuma estrutura nuclear, mas que contém quatro traços pretos, um com a descrição “Clue cell” e os outros três com “Gardnerella vaginalis”; e a célula inferior é uma estrutura de bordas bem delimitadas, com presença de núcleo proeminente, em que, também, há três traços pretos com as informações “Célula epitelial vaginal”, “Núcleo da célula epitelial” e “Célula normal”. Figura 3 – Lâmina contendo “clue cell”, característica de vaginose bacteriana. / Fonte: Tortora; Funke; Case (2019, p. 802). UNICESUMAR 120 Alguns sorovares da C. trachomatis (L1, L2 e L3) podem causar o chamado linfogranuloma venéreo, resultando no inchaço e no endurecimento de linfonodos infiltrados por esses micro-organismos, que obstruem a circulação do sistema linfático, causando tumefação de órgãos genitais externos em homens e estenose anal em mulheres (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Além disso, in- 1 2 3 4 5 6 7 8 EB Ancoragem Descrição da Imagem: a figura apresenta um desenho que indica o ciclo metabólico da Chlamydia tracho- matis. A célula humana (hospedeira) é representada por uma esfera de bordas pretas e centro amarelo, contendo uma pequena esfera em seu interior na co- loração castanho, representando o núcleo. A bactéria é ilustrada no formato de uma esfera vermelha, in- dicada pela sigla EB (sigla em inglês para corpúsculo elementar). Cada etapa do ciclo está desenhada em um retângulo de bordas pretas e centro rosa pálido, e cada mudança de fase do ciclo é indicada por uma flecha azul, tendo oito fases representadas. Na fase 1, a célula bacteriana em sua forma de corpúsculo elementar se liga à célula do hospedeiro, por meio das proteínas de aderência presentes na membrana. Na fase 2, ocorre umapenetração ativa dessa bactéria para o interior da célula hospedeira. Na fase 3, essa internalização é possível devido à formação de uma estrutura chamada fagossoma, local no qual a bactéria fica armazenada, quando no citoplasma da célula humana. Na fase 4, a bactéria inicia a sua fase de replicação celular por fissão binária (semelhante a outras bactérias). Na fase 5, o número de bactérias torna-se elevado, assim como o seu tamanho, e elas transformam-se em corpúscu- los reticulares, e este fato se dá pela capacidade de a bactéria utilizar a adenosina trifosfato e algumas proteínas da célula do hospedeiro, o que as classifica como parasitas. Nas fases 6 e 7, a forma de corpúsculo reticular é capaz de mobilizar lisossomas das células do hospedeiro e, dessa maneira, estas estruturas voltam a se reorganizar como corpúsculos elementares, forman- do uma estrutura chamada inclusão, na qual, em seu interior, há conformações elementares e reticulares simultaneamente. Na fase 8, quando composta apenas de corpúsculos elementares, a inclusão é extrusada da célula do hospedeiro por exocitose, liberando unidades infectantes disponíveis para parasitar mais células. Figura 4 – Ciclo metabólico da Chlamydia trachomatis. Fonte: adaptada de Murray, Rosenthal e Pfaller (2021, p. 355). UNIDADE 4 121 fecções recorrentes por essa bactéria podem estar ligadas diretamente ao risco de desenvolvimento de câncer de colo de útero nas mulheres e, ainda, de inflamação das tubas uterinas, levando à formação de cicatrizes e, consequentemente, à esterilidade (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Os sorovares D, E, F, G, H, I, J e K são potenciais causadores de uretrite não gonocócica (UNG), uretrite pós-gonocócica (UPG), cervicite, doença inflamatória pélvica (DIP), endometrite, paratracoma, con- juntivite de inclusão e pneumonia do recém-nascido (BLACK; BLACK, 2021). As formas de tratamento envolvem longos dias de administração antimicrobiana (cerca de 21 dias) para acometimentos graves, enquanto tratamentos à base de azitromicina ou doxiciclina por 7 dias são suficientes para casos ge- nitais e oculares (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). A gonorreia, por sua vez, gera manifestações clínicas ainda mais evidentes, que, também, podem ser evitadas com o uso de métodos de proteção durante a relação sexual. A bactéria Neisseria gonorrhoeae (Figura 5), um diplococo Gram-negativo, é o agente etiológico e seu principal fator de virulência é a presença de pili de aderência, que se liga às células epiteliais genitais e urinárias mesmo diante do fluxo unidirecional da urina (BLACK; BLACK, 2021). Descrição da Imagem: a figura apresenta uma fotografia tirada de uma lâmina em microscópio. No fundo branco e disperso, há inúmeras células disformes, cor rosa-claro, contendo três ou mais núcleos em seu interior, de cor rosa avermelhada. Em duas dessas células, é possível ver inúmeras esferas pequenas e vermelhas, cerca de dez vezes menores que o núcleo da célula, representando os gonococos. Figura 5 – Lâmina de Gram contendo neutrófilos com unidades de Neisseria gonorrhoeae em seu interior. Fonte: Shutterstock ([2023b], on-line). UNICESUMAR 122 Os gonococos (forma como também são conhecidos) são produtores de enzimas como a protease celular clivadora de IgA (anticorpo presente em secreções e tipo produzido contra as proteínas de membrana da bactéria como defesa), de endotoxinas, que agridem as tubas uterinas, e de transferrinas, que sequestram o ferro das células do hospedeiro para fornecer o metal para a bactéria (BLACK; BLACK, 2021). A presença das chamadas proteínas Opa medeia a ligação entre a bactéria e as células epiteliais, e as proteínas Rmp, que estimulam anticorpos que interferem com a atividade bactericida do soro do hospe- deiro, facilitando a sobrevivência da bactéria (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Os sintomas envolvem a produção e a liberação de um líquido purulento, atacando os homens na parte distal da uretra e as mulheres, no cérvix, após 2 a 3 dias de período de incubação. No entanto, a maioria dos portadores dessa bactéria pode permanecer assintomática por até 15 anos, adicionando um risco ainda maior para aqueles com altos valores de morbidade (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Ademais, em ambos os sexos, um episódio de gonorreia não tratado pode evoluir para infecções sistêmicas, como quadros de endocardite gonocócica e meningite, e atingir regiões como os olhos (com destaque para a oftalmia neonatal), a faringe e as juntas (cerca de 1% das infecções gonorreicas podem desencadear problemas articulares, pela proliferação de gonococos no líquido sinovial) (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Dessa forma, sabe-se que os principais facilitadores para os altos índices de gonorreia são a existência de múltiplos parceiros(as) e a ocorrência da doença assintomática, que dificulta a ida do indivíduo ao médico e a obtenção do diagnóstico – tudo isso somado à atividade sexual desprotegida são fatores que atingem, principalmente, jovens na faixa etária entre 15 e 24 anos. O tratamento das infecções gonocócicas pode ser realizado com a administração de sulfonamidas e penicilinas, mas a capacidade de desenvolver resis- tência aos antimicrobianos oferece risco iminente aos pacientes e desafia o corpo clínico na escolha da terapia adequada (BLACK; BLACK, 2021). São muitas informações, não é mesmo? Tanto que imagino que você já tenha se es- quecido do pobre Benvenuto Cellini, criador da bela escultura de Perseus, que vimos no início desta unidade. Aproveito para acrescentar mais uma informação ao enigma da escultura: sabemos que o escultor tinha uma vida praticamente boêmia e, ainda muito jovem, foi acometido por uma doença de característica praticamente crônica, mas e se eu dissesse que, embora ele tenha contraído uma IST, foi justamente no período de con- valescência e cura que o artista criou aquela obra, você se arriscaria a dizer se alguma das que estudamos até agora seria a causadora? Antes de considerarmos todas as alternativas para esse enigma, discutiremos, a seguir, uma das doenças mais antigas do mundo e uma das ISTs mais conhecidas: a sífilis. Também chamada de cancro duro, a sífilis é causada pela bactéria Treponema pallidum (Figura 6), um espiroqueta móvel e muito exigente nutricionalmente, tanto que seu isolamento em laboratório de microbiologia comum costuma ser muito raro (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). UNIDADE 4 123 O T. pallidum é uma bactéria Gram-negativa fina, microaerófila ou anaeróbica, e móvel, de maneira que sua estrutura em espiral facilita a sua entrada em tecidos e o seu transporte entre os líquidos do corpo. Os primeiros casos de sífilis datam do século XVI, podendo a doença ser transmitida por relação sexual desprotegida, pela saliva e, também, pelo canal do parto (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Entre os mecanismos de patogenicidade, estão a aderência à fibronectina (proteína adesiva que tem uma forma solúvel que se dissemina pelo organismo) e presença de enzimas como hemolisina e hialuronidase, que facilitam a infiltração perivascular (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). A história natural dessa doença já é bem estabelecida e contém, principalmente, quatro fases distintas: • Primeira fase – incubação: varia entre 2 e 6 semanas, tempo em que o micro-organismo se dissemina pelo organismo, devido a sucessivas divisões celulares. • Segunda fase – estágio primário: formação de uma ferida (chamada de cancro) no local inicial de contato, de bordas bem definidas, endurecida, indolor e que, sobre microscopia, apresenta um número enorme de espiroquetas. Essas lesões podem aparecer em genitália, lábios e mãos. Por serem indolores, podem ocorrer internamente (como lesões no colo do útero) sem serem notadas, ou serem confundidas com outros processos infecciosos, como a herpes genital/bucal. Os ferimentos desaparecem com o tempo (BLACK; BLACK, 2021). Descrição da Imagem: a figura é uma representação tridimensional da bactériaTreponema pallidum, cujo formato é espiral, semelhante a um fio de telefone antigo. A imagem é em preto e branco, de forma que a bactéria apresenta coloração acinzentada e mais escura, repousando sobre uma superfície irregular em tonalidade cinza claro. Figura 6 – Representação gráfica tridimensional da bactéria Treponema pallidum. Fonte: Shutterstock ([2023c], on-line). UNICESUMAR 124 • Terceira fase – período secundário: a bactéria continua sua multiplicação, causando sintomas gripais comuns e exantemas (feridas semelhantes a queimaduras pequenas), principalmente na palma das mãos e na planta dos pés (Figura 7). Em exames vaginais de rotina, é possível observar lesões no colo do útero em mulheres, compostas por placas mucosas dolorosas e ricas em material microbiológico (por isso, nessa fase, é possível a infecção do bebê durante o parto) (BLACK; BLACK, 2021). As feridas na boca também são comuns e constituem uma importante fonte de transmissão do T. pallidum por meio do beijo. Essa condição pode durar até 5 anos e, tanto no estágio primário quanto no secundário, as lesões são altamente infec- ciosas (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Descrição da Imagem: na figura, há uma fotografia de uma mão, com o polegar voltado para cima, repleta de feridas vermelho-acas- tanhadas, de formato circular e que cobrem a palma da mão do indivíduo. Figura 7 – Lesões características de sífilis na fase secundária. / Fonte: Shutterstock ([2023d], on-line). • Quarta fase – estágio terciário: fase que gera danos permanentes no coração – a ação da bactéria promove deposição de cálcio, causando danos em válvulas cardíacas e vasos sanguí- neos; e no sistema nervoso, pois há espessamento das meninges, evolução para ataxia, para- lisia e, também, efeitos de ordem psiquiátrica. Lesões granulomatosas, chamadas de gomas, também ocorrem internamente, destruindo tecido neural e atacando a epiderme (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). UNIDADE 4 125 A disseminação por meio da placenta causa a denominada sífilis congênita, interferindo no desenvolvimento neural e cognitivo do bebê (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). O tratamento, em qualquer fase da doença, é o uso de penicilina G bizantina (aquela que conhece- mos por Benzetacil®), o qual revela ótimas taxas de cura, desde que seja realizado de modo correto. Infelizmente, a infecção não produz imunidade permanente e, por isso, as principais medidas para combater a disseminação da sífilis são o uso do preservativo e o tratamento de todos os doentes (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). O Haemophilus ducreyi, por sua vez, é uma bactéria Gram-negativa, causadora do cancro mole ou cancroide. As feridas, quando presentes, além de mucosas e dolorosas, afetam os órgãos genitais e sangram com muita facilidade, porém, assim como as ISTs descritas anteriormente, também possui uma forma inaparente, caracterizada apenas por uma ardência após a micção (BLACK; BLACK, 2021). Cerca de 1 semana após a infecção, a lesão pode se espalhar para as re- giões de virilha, levando ao aumento de linfonodos e vasos linfáticos (chamados de bubões), de tal modo que o intumescimento pode irromper pela pele e descarregar grande concentração de pus diretamente na pele (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). A alta incidência das ISTs, combinada com a severidade de alguns de seus sintomas e a possibilidade de ocorrência assintomática, tem motivado, desde algum tempo, esforços contínuos dos órgãos públicos para que medidas educativas sejam instauradas na sociedade, a fim de tentar cor- tar esse mal pela raiz. Você consegue se lembrar de alguma campanha pública que tenha abordado o assunto? Junte-se a mim para relembrar algumas das propostas estabelecidas ao longo dos anos, para ajudar a fixar ainda mais o conteúdo desta unidade. As uretrites não gonocócicas (UNG), ISTs inespecíficas, podem ser causadas pela Chlamydia trachomatis e pelos micoplasmas, micro-organismos curiosos, pois não possuem parede celular, de forma que sua infecção se dá pela fusão de sua membrana citoplasmática (que, diferentemente das outras bactérias, possuem esteróis na sua composição) com as células hospedeiras. As infecções podem evoluir para quadros de doença inflamatória pélvica (infecção que acomete os componentes superiores do aparelho genital, como útero, tubas uterinas e ovários), causando abortos espontâneos, nascimentos prematuros e gravidez ectópica (BLACK; BLACK, 2021). O Mycoplasma hominis faz parte da microbiota normal das mulheres e pode causar uretrite em ambos os sexos. Já o Mycoplasma genitalium (Figura 8) é um micoplasma conhecidamente patogênico e que, além da uretrite, está envolvido com casos de vaginite bacteriana. O diag- nóstico de ambos só é clinicamente útil quando realizado por meio de testes moleculares, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), porque seu isolamento em meios de cultura é bem https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/14618 UNICESUMAR 126 difícil, e os testes sorológicos existentes não possuem sensibilidade e especificidade satisfatória (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Descrição da Imagem: : a figura tridimensional representa a estrutura morfológica do Mycoplasma genitalium. Na imagem, a bactéria possui um formato semelhante a um pino de boliche, com a base mais larga e a extremidade mais fina, na cor vermelho intenso. O fundo da imagem possui uma coloração azul-esverdeada Figura 8 – Representação tridimensional do Mycoplasma genitalium. Fonte: Shutterstock ([2023e], on-line). A candidíase vulvovaginal é a principal causa que leva as mulheres com queixas sobre a saúde genital ao ginecologista. Não é uma infecção sexualmente transmissível, pois a Candida spp é membro da microbiota feminina, principalmente após a menarca e, diferentemente das ISTs, o tratamento do parceiro não diminui a sua incidência. A C. albicans e a C. glabrata são as espécies mais isoladas nesses casos, possuindo conformação de esporo (colonização assintomática) e em brotamento – esta última associada à invasão tissular e à geração de sintomas. A ocorrência desse distúrbio está ligada a fatores predisponentes, como uso de contraceptivos, gestação, sistema imunológico enfraquecido e hábitos de higiene inadequados. O diagnóstico pode ser realizado por exames a fresco, isolamento em meios de cultura específicos para fungos, como o ágar Sabouraud, e exames citopatológicos de Papanicolau (BRASIL, 2010). UNIDADE 4 127 Como já mencionado anteriormente, as ISTs são condições que, por vezes, geram cons- trangimento em alguns pacientes, seja pela localização das feridas ou pelo medo em relação ao diagnóstico e ao tratamento. Sabe quem não tinha medo algum da própria doença? Nosso querido amigo escultor Benvenuto Cellini, que, inclusive, com o curso da IST, pela falta de antibióticos à época, foi instruído a utilizar pequenas doses de mercúrio. Excêntrico como era, preferiu o tratamento alternativo para doenças pouco conhecidas até então, que era a aplicação de sanguessugas para “expurgar” a doença. Como se fosse pouco, Benvenuto, já enfraquecido pelos sintomas gerados pela doença instalada (feridas que “apareciam” e “sumiam” com frequência e dores articulares), ainda foi acometido pela malária. No entanto, a situação curiosamente reduziu os efeitos agressivos da IST que possuía. Reunindo seus conhecimentos até esse ponto, você está mais confiante para afirmar qual é a misteriosa doença dessa personalidade notável? Antes de concluirmos esse mistério, entrando um pouco na área da parasitologia e virologia, não existe possibilidade de tratarmos de doenças sexualmente transmissíveis sem citarmos a tricomoníase e o vírus HIV. O Trichomonas vaginalis é um tipo de protozoário não intestinal, infectante na forma de trofozoíto (Figura 9) e móvel, cuja infecção gera sintomas genitais, como corrimentos bem líquidos, coceira, dor ao urinar e sensação de queimação nas mulheres, enquanto homens costumam ser os reservatórios assintomáticos (MURRAY; ROSENTHAL;PFALLER, 2021). Descrição da Imagem: : na figura, há uma fotografia de um material clínico proveniente de swab vaginal. No centro da imagem, em roxo, há a estrutura morfológica do Trichomonas vaginalis, em formato oval. Na sua extremidade superior, há um único filamento, em rosa, que representa o axostilo, e, na extremidade inferior, existem cinco, representando os flagelos. O fundo da figura é branco e existem células do sistema imunológico na cor roxa, em formato esférico. Figura 9 – Trofozoíto do Trichomonas vaginalis. / Fonte: Murray, Rosenthal e Pfaller (2021, p. 723). UNICESUMAR 128 Os vírus, por sua vez, são as estruturas mais simples no mundo da microbiologia e não possuem o sistema metabólico suficiente para produção endógena de nutrientes. Assim, não são capazes de pro- duzir proteínas nem replicar seu material genético sem o auxílio de uma célula hospedeira. O vírus da imunodeficiência humana (HIV, sigla do inglês human immunodeficiency virus) (Figura 10), constituinte notório do grupo dos retrovírus, é uma estrutura esférica, revestida por um envelope de glicoproteínas, contendo duas fitas idênticas de RNA localizadas no nucleocapsídeo e envoltas por um capsídeo bilipídico. O vírus possui as enzimas RNA polimerase, integrase e transcriptase reversa, e, em sua superfície, possui glicoproteínas de adesão, chamadas de gp41 (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). A transmissão do vírus HIV se dá por relações sexuais desprotegidas, contato da corrente circulatória com sangue ou fluídos contaminados com o vírus e, menos comumente, pelo canal do parto. O leite materno e a saliva possuem carga viral muito baixa para serem considerados vias principais de transmissão (BLACK; BLACK, 2021). Glicoproteína Capsídio Matriz Enzima transcriptase reversa Genoma (RNA) Enzima protease Enzima integrase Nucleocapsídio Envelope Descrição da Imagem: :a figura apresenta um vírus circular, que pos- sui nas bordas estruturas semelhan- tes à letra “T” na cor preta, indicada com um traço vermelho com a escrita “Glicoproteína”. A camada mais exter- na dessa esfera tem coloração rósea e está indicada por um traço verme- lho com o nome “Envelope”. A cama- da seguinte, de fora para dentro, é de coloração vermelha escura e está indicada com um traço vermelho e de nome “Matriz”. O centro da figura é verde e está preenchido com quatro estruturas distintas: duas esferas laranjas, que representam a enzima protease; duas esferas roxas, que representam a enzima transcriptase reversa; dois bastões vermelhos, que representam a enzima integrasse; e duas estruturas em fita, em formato senoidal na cor rosa, que represen- tam as duas fitas de RNA dessa uni- dade viral. Figura 10 – Representação gráfica da estrutura morfológica do vírus HIV. Fonte: Módena, Arruda e Acrani (2012, p. 28). Uma vez em contato com as células mucosas do aparelho genital, o vírus rapidamente chega ao intestino e passa a infectar as células do tecido linfoide associado à mucosa (MALT) ali presentes. Mediados por receptores CD4+ e receptores CCR5 para citocinas, presentes em monócitos, macró- fagos e linfócitos, infectam, também, essas células que, ainda, se tornam reservatórios para os vírus. Após um período, as glicoproteínas do tipo gp120 começam a ser expressas na cápsula do vírus, estrutura que permite a infecção apenas de linfócitos da linhagem CD4+, que sofrem morte celular programada (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). UNIDADE 4 129 Nos estágios iniciais após o contágio, o indivíduo infectado pode nem apresentar sintomas ou expres- sar apenas manifestações clássicas de gripe. Esse período é conhecido como “fase latente” e apresenta baixa concentração de vírus na circulação sanguínea, porém, a replicação viral continua a acontecer e a morte de linfócitos CD4+ torna-se tão intensa que o sistema imunológico enfraquece, levando o paciente à imunodeficiência (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Com a síndrome da imunodeficiência humana (aids ou SIDA) instalada, a infecção do hospedeiro, por micro-organis- mos oportunistas, é facilitada e distúrbios neurológicos podem ocorrer pela infecção da “micró- glia” (células de defesa presentes no sistema nervoso) e pela liberação de substâncias neurotóxicas (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Felizmente, desde 1980, o número de tratamentos para os portadores do HIV sofreu um aumento pronunciado, variando em mecanismos de ação e formas de administração, possibilitando quimio- terapias praticamente personalizadas para esses indivíduos. Como exemplos, existem os inibidores da transcriptase reversa, os inibidores de protease, os inibidores de ligação e fusão viral à célula do hospedeiro e os inibidores da integrase viral (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). As formas de diag- nósticos envolvem ensaios de triagem, como sorológicos (aglutinação em látex, anticorpos orais), indicativos (como hemogramas e contagens de linfócitos CD4+ e CD8+) e confirmatórios, sendo Entre abril e maio de 2022, foram confirmados mais de 250 casos da Monkeypox ou “varíola do macaco”, deixando a Organização Mundial da Saúde (OMS) e vários órgãos de controle de saúde em alerta. A doença é viral, classificada como zoonose e possui tempo de incubação de 1 a 5 dias, sendo que, após esse período, o indivíduo infectado pode apresentar crises de febre e dores de cabeça intensas, seguidas das características erupções cutâneas, localizadas na epiderme (principalmente em face e extremidades) e também em tecidos mucosos, como boca, genitálias e conjuntivas. Ainda, não é considerada uma IST, porém, o contato sexual com pessoas em fase ativa da doença pode desencadear a infecção (SOUZA; SOUZA; FRONTEIRA, 2022). Para conhecer melhor a forma como ele se replica dentro do linfócito TCD4+, assista ao vídeo A Replicação do HIV, do canal Professor Ruela Microbiologia, pelo QR Code . Observe as estruturas virais presentes no vídeo e na Figura 10, e como elas se relacionam com o parasitismo viral na célula hospedeira. apigame:�https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/18694 UNICESUMAR 130 a eletroforese em gel ou Western Blot, que identifica proteínas virais, o mais utilizado. Este ensaio consiste na migração diferencial das proteínas virais, presentes no soro do indivíduo, sob aplicação de uma corrente elétrica. A migração das proteínas é revelada com um reagente fluorescente ou de cor, de forma que, ao comparar a um padrão controle positivo característico, é possível saber se há ou não a presença de vírus no organismo (BRASIL, 2018). Ficou curioso sobre como esse teste funciona? Tenho cer- teza de que ele se tornará mais interessante quando você assistir a essa técnica. Dica de amigo: essa análise é uma das mais utilizadas em imunologia. Por isso, preste bas- tante atenção, porque você pode combinar seus conheci- mentos em microbiologia e imunologia em um só. Acesse Western Blot/Eletroforese sorológico para HIV REALIDADE AUMENTADA Depois de estudar e anotar tudo até aqui, você já sabe do que sofria o escultor Benvenuto Cellini? Darei uma última pista para a resolução desse enigma, antes de tratarmos sobre os métodos diagnósticos para ISTs: a doença do escultor evoluiu para uma fase terciária, e, na época, se ouviam rumores de que ele se encontrava em estado terminal de vida. Alguns compradores de arte se aproveitaram disso, e, após algumas negociações, trataram de envenenar Benvenuto adicionando mercúrio na alimentação dele, por acreditarem que o metal, na comida, não seria percebido, uma vez que o escultor já exibia alguns sintomas neurológicos e comportamentais muito curiosos. Você já é capaz de afirmar qual IST acometia Benvenuto com essa última dica? UNIDADE 4 131 Para os ensaios clínicos, uma variedade de amostras pode ser utilizada e, no Quadro 1, você pode obser- var quais são os materiais coletados e indicados para cada tipo de pesquisa ou quantificação bacteriana: Tipo de cultura/suspeita clínica Aparelho genital feminino Aparelho genitalmasculino Vaginose bacteriana Fluido cervical e vaginal Não aplicável Trichomonas vaginalis Fluido vaginal Fluido prostático Neisseria gonorrhoeae Fluido cervical, anal Fluido uretra, anal Chlamydia trachomatis Raspado cervical, uretral Raspado uretral Treponema pallidum Lesões genitais Lesões genitais Haemophilus ducreyi Úlcera da área perianal/geni-tal, nódulo inguinal Úlcera da área perianal/geni- tal, nódulo inguinal Mycoplasma hominis Canal endocervical ou uretra Não aplicável Título: Carta para além dos muros Ano: 2019 Sinopse: o documentário apresenta uma linha cronológica sobre a des- coberta do HIV, as consequências e sequelas da aids, os estigmas e os preconceitos envolvidos, e o que médicos, vítimas e seus familiares têm a dizer sobre a epidemia dessa infecção sexualmente transmissível, a qual teve início no século XX e, infelizmente, persiste poderosa até os dias atuais. Quadro 1 – Amostras recomendadas de acordo com o tipo de micro-organismo pesquisado em trato genital masculino e feminino. Fonte: adaptado de Brasil (2010). UNICESUMAR 132 Nos casos de vaginite bacteriana, a Gardnerella vaginallis pode ser positiva em 50% de mulheres sadias e assintomáticas, ou seja, com micro-organismo confirmado, porém sem processo infeccioso instalado. Por isso, a cultura de materiais vaginais dificilmente é indicada para diagnóstico nesses casos (BRASIL, 2010). Os critérios mais utilizados para caracterização de vaginose bacteriana são: • Presença de corrimento fluido. • Teste de aminas (com hidróxido de potássio 10%) positivo no fluido vaginal. • pH vaginal > 4,5. • Presença de células epiteliais características “clue cell”. No caso da pesquisa por Chlamydia trachomatis, como citado anteriormente, o cultivo em linhagens celulares ainda é o método de referência para o diagnóstico, mas, além de caro, é menos prático e dispendioso em tempo. O material mais indicado seria a coleta de raspados celulares da região do endocérvix e, por isso, a identificação diagnóstica em mulheres, normalmente, pode ocorrer durante os exames preventivos de rotina (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Ainda assim, a micros- copia por método da imunofluorescência direta pode ser utilizada a partir de amostras coletadas de swab ou escova endocervical, materiais que podem ser submetidos a análises sorológicas, além dos métodos de detecção do micro-organismo por PCR (BRASIL, 2010). As amostras obtidas para diagnóstico de gonorreia devem ser submetidas à cultura quase ime- diatamente, pois o gonococo é muito sensível a condições ambientais e sofre lise rapidamente. O material coletado pode ser submetido a cultivo direto (swab semeado diretamente em meio de cultura) em meios específicos contendo cistina, aminoácidos, pirimidinas, vitaminas e amido, como o Thayer-Martin (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). No caso de visualização de culturas de Neisseria gonorrhoeae de crescimento característico (colônias pequenas pigmentadas de branco/ creme), pode-se seguir o protocolo de testes bioquímicos, que envolve: • Coloração de Gram. • Prova da catalase. • Teste da oxidase. • Prova da degradação da glicose. • Prova da degradação da maltose. • Prova da degradação da lactose. A Neisseria gonorrhoeae é um coco Gram-negativo, catalase positiva e oxidase positiva e degrada apenas a glicose (BRASIL, 1997). Quanto ao Treponema pallidum, é muito raro que o analista consiga observar sua estrutura mor- fológica em técnicas bacterioscópicas tradicionais, como o Gram, devido à bactéria ser muito fina. Por isso, preferencialmente, deve-se optar por técnicas de observação em campo escuro, utilizando reagentes fluorescentes especiais. Materiais, como exsudatos, podem fornecer leituras satisfatórias, em caso de amostras obtidas nas fases primária e secundária da doença ou em situações de sífilis congê- nita. No entanto, a análise é possível somente a partir de materiais recém-coletados e imediatamente UNIDADE 4 133 semeados na lâmina de observação. Além disso, é necessário um microscópio específico (com con- densador de campo escuro) (Figura 11) e o analista deve passar por muito treinamento (WHO, 2016). Descrição da Imagem: a figura é uma fotografia tirada em microscópio de fundo escuro, na qual é possível observar as espiroquetas dispersas, em branco, no campo de visão sobre um fundo preto e opaco. Existem oito espiroquetas no total. Figura 11 – Microscopia em campo escuro para identificação de Treponema pallidum./Fonte: Public Domain Files (2012, on-line). Essa bactéria tem replicação celular dificultada em laboratório, porque as moléculas que fazem parte do ciclo do ácido tricarboxílico (ciclo vital para a sobrevivência da bactéria) são retiradas da célula do hospedeiro, sobretudo, purinas, pirimidinas e aminoácidos (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Dessa maneira, o isolamento dessa bactéria, na microbiologia, é quase impraticável. Técnicas de imunofluorescência direta (pesquisa de anticorpos que se ligam a antígenos marcados com reagentes fluorescentes) também pode ser realizada, mas a sua execução se torna difícil, pela ne- cessidade de insumos que, muitas vezes, se encontram indisponíveis (RATNAM, 2005). A coloração de Warthin-Starry, baseada na fixação do micro-organismo pela prata, ainda que muito amplamente apresentada, tem baixa sensibilidade e especificidade (THEEL; KATZ; PILLAY, 2020). De maneira mais pronunciada, os testes imunológicos são os mais amplamente utilizados para diagnóstico da sífilis. Os chamados testes treponêmicos consistem em identificar anticorpos do tipo imunoglobulina M (IgM) no organismo do paciente, cerca de 10 dias após o aparecimento da UNICESUMAR 134 lesão primária (WHO, 2016). Esse grupo de anticorpos é escolhido, pois, além de aparecerem durante a fase primária, também estão presentes na fase secundária ou no período latente, fazendo com que o diagnóstico para sífilis seja possível mesmo na ausência de sintomas (JANIER et al., 2020). O teste de anticorpos treponêmicos fluorescentes com absorção (FTA-Abs) é um desses ensaios nos quais, em uma lâmina fixada com T. pallidum, reagem com o soro do paciente e, em casos positivos, os anticorpos da ordem IgM se ligam ao antígeno (complexo antígeno-anticorpo). Uma espécie de imunoglobulina humana, a antigamaglobulina, marcada com um reagente fluorescente, se liga à porção do anticorpo desse complexo formado, fato que é revelado quando observado em microscópio, como na Figura 12. Descrição da Imagem: na figura, há uma fotografia tirada a partir do microscópio. Disperso no campo de observação, existem inúmeras bactérias, em espiral, na cor verde. O fundo da imagem é preto e opaco. Figura 12 – Resultado positivo para ensaio FTA-Abs na pesquisa de anticorpos contra Treponema pallidum.po escuro para iden- tificação de Treponema pallidum./Fonte: Public Domain Files (2012, on-line). Fonte: Scimedx Corporation (2022, on-line). UNIDADE 4 135 Ensaios imunoenzimáticos e testes de hemaglutinação também podem ser realizados como testes iniciais para o diagnóstico da sífilis. O primeiro consiste na reação de um complexo anticorpo-an- tígeno, formado no local da reação junto a um substrato de cor, que, dependendo da coloração revelada, indica se há a presença de anticorpos ou não. O teste de hemaglutinação consiste na observação de ligação entre anticorpos, presentes no soro de paciente com hemácias que contêm, em sua superfície, cepas de T. pallidum fixadas. O resultado dessa ligação é observável pela geração de um coágulo, configurando teste positivo (LUO; XI; XIAO, 2021). Na universidade em que me formei, contavam uma história sobre um professor que fazia uma brincadeira durante as aulas práticas: após a aula sobre sífilis e seus diagnósticos, ele coletava material da parte interna da bochecha de alguns alunos e realizava uma lâmina de observação direta em cam- po escuro em um microscópio próprio para isso. Mesmo sabendo que a sífilis pode ser passada pelo beijo, os alunosse voluntariavam para ter seus materiais clínicos coletados, confiantes de que nenhum resultado incomum apareceria. No entanto, após alguns segundos trancado na sala escura de obser- vação (microscópios de campo escuro exigem essas adaptações para funcionarem corretamente), os alunos começavam a ouvir risadas contidas, mas sugestivas e em tom de chacota, vindas do professor. Ele, então, preparava a lâmina para que todos dessem uma olhada, sendo que muitas lâminas se apresentavam carregadas de espiroquetas. Antes que os pobres voluntários tivessem um ataque do coração, o professor explicava que aquilo era completamente normal. Algumas bactérias da nossa microbiota oral são espécies de espiroquetas, e não se diferenciam morfologicamente do Treponema pallidum; dessa forma, eles podem ser facilmente confundidos com o causador da sífilis, por meio da microscopia direta. Essa história serve apenas para alertar que não se faz diagnóstico de sífilis por observação direta em amostras provindas de secreções orais! A possibilidade de um resultado falso-positivo para esses casos é enorme. Para o diagnóstico de neurossífilis ou o acompanhamento terapêutico de indivíduos em trata- mento, o ensaio VDRL (do inglês Veneral disease research laboratory), um teste não treponêmico, pode ser indicado. Ele acontece com a reação entre o soro do paciente e uma suspensão antigênica padronizada da bactéria, e, em casos positivos, é possível observar a formação de grânulos (agluti- nação) no fundo do meio de reação (WHO, 2016). Como é possível perceber, tanto as técnicas diagnósticas quanto o conhecimento aprofundado sobre a fisiopatogenia das doenças, assim como a condução de uma terapia adequada, podem forne- cer dados esperançosos e otimistas àqueles acometidos pelas ISTs. No entanto, a disseminação dessas doenças, de forma exponencial, é preocupante, devido ao desenvolvimento de resistência bacteriana e à subnotificação de casos (pouca procura pelo consultório médico nos casos mais “assustadores”, como feridas nos órgãos genitais), o que faz com que os acometidos espalhem a doença sem ao menos conhecer a própria condição de saúde. UNICESUMAR 136 Por falar em condições de saúde, posso considerar como resolvido o mistério do escultor Ben- venuto Cellini? Mesmo sem saber sobre resultados laboratoriais que, à época, também não existiam, concluímos que o nosso protagonista tinha sífilis. Além de sobreviver à tentativa, por parte de seus algozes, de assassiná-lo, a pequena concentração de mercúrio, adicionado a sua comida, ainda foi su- ficiente para suprimir a atividade bacteriana e curá-lo de vez da IST que o acometia. Essa vitória sobre as adversidades foi o que o motivou a criar a escultura de Perseus, que vimos no início desta unidade, sendo um símbolo de sua glória sobre a doença (assim como Perseus derrotou Medusa). O monitoramento laboratorial de ISTs é uma importante atividade, que não se restringe apenas ao diagnóstico de um paciente. O papel profissional do analista vai mais além: fornecer dados confiáveis aos índices epidemiológicos, que são importantes para traçar estratégias de combate mais eficazes, porque, apoiados nas taxas de diagnóstico e testagem de ISTs, órgãos componen- tes da saúde são respaldados na implementação de diversas medidas. O profissional de saúde, presente no laboratório, também é essencial, porque o diagnóstico bem realizado auxilia serviços sociais na investigação de casos de abuso sexual em populações expostas, tornando a missão social do analista tão importante quanto a sua missão profissional na sociedade. É considerável que esse processo ajuda tanto na proteção da vítima em casos confirmados quanto respalda judicialmente a busca pelo responsável do ato e, assim, se fazer valer a justiça. Por fim, não foi por acaso que, nesta unidade, em específico, eu optei por não trazer imagens impactantes de órgãos genitais e outras regiões acometidas por ISTs. A forma como esta uni- dade foi escrita, com a ausência de fotografias impressionantes, é justamente a maneira como a sociedade está posicionada quanto às ISTs: sem o apelo visual, tem-se a falsa sensação de que o problema não existe. É possível sentir, na própria pele, a dificuldade que a saúde tem, hoje, para tratar do assunto com mais clareza. A subnotificação das ISTs não é um problema restrito ao Brasil, e, ainda, contribui muito para desinformação, temor e preconceito em relação a essas patologias. Nunca se esqueça de que: o que os olhos de médicos e profissionais da saúde não veem, certamente, o coração, as articulações, as células neurais e os diversos órgãos vitais podem sentir. 137 Para finalizar, sugiro que você expresse todos os seus sentidos para se lembrar, com boas sensações, de tudo que estudamos até aqui. Anote, desenhe e rabisque o quanto quiser o Mapa da Empatia a seguir. Deixei algumas sugestões de reflexão, mas você não precisa se limitar em responder somente a elas. Seja criativo! PENSAR Como me sinto em relação aos conhecimentos adquiridos nessa unidade? Existe alguma maneira que eu posso contribuir ainda mais ao lidar com pacientes acometidos pelas ISTs? VER Como enxergo o cenário das ISTs hoje e como posso me ver no futuro atuando na área de pesquisa dessas doenças? OUVIR DORES O que você costuma ouvir sobre as ISTs antes de estudar essa unidade? O que se confirmou? O que foi refutado? FAZER Como você vai se dedicar a partir de hoje para aprimorar seus conhecimentos em microbiologia e ISTs? O que você pode fazer diferente daquilo que já conhece para ser um analista laboratorial de excelência? Quais são os maiores obstáculos no diagnóstico das ISTs? Qual a minha maior dificuldade em relação a esse assunto? GANHOS Qual é o impacto positivo que eu posso deixar na sociedade ao ser um analista laboratorial de qualidade? 138 1. É de conhecimento geral que a microbiota bacteriana é importante para muitos sistemas anatômicos no organismo humano. Observe a sentença a seguir: “Os __________ são micro-organismos da microbiota vaginal que desempenham importante função de __________ contra agentes causadores da vaginite bacteriana como a ______”. Assinale a alternativa que contém os termos que preenchem corretamente a sentença: a) Lactobacillus; proteção; Listeria monocytogenes. b) Monobacillus; proteção; Gardnerella vaginalis. c) Lactobacillus; proteção; Gardnerella vaginalis. d) Monobacillus; nutrição, Gardnerella vaginalis. e) Lactobacillus; nutrição; Listeria monocytogenes. 2. Assinale a alternativa que apresenta corretamente o agente etiológico do linfogranuloma venéreo e do cancro mole: a) Chlamydia trachomatis e Haemophilus ducreyi. b) Chlamydia trachomatis e Haemophilus pneumoniae. c) Haemophilus pneumoniae e Neisseria gonorrhoeae. d) Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae. e) Neisseria gonorrhoeae e Haemophilus ducreyi. 139 3. A gonorreia é uma infecção sexualmente transmissível, que acomete homens e mulheres. Sobre o agente etiológico, assinale a alternativa correta: a) O agente causador é a bactéria Neisseria gonorrhoeae, um bacilo Gram-negativo que possui como principal fator de virulência a presença de pili em sua superfície. b) O agente causador é a bactéria Neisseria gonorrhoeae, um bacilo Gram-negativo que possui como principal fator de virulência a produção de hialuronidase. c) O agente causador é a bactéria Neisseria gonorrhoeae, um diplococo Gram-positivo que possui como principal fator de virulência a presença de pili em sua superfície. d) O agente causador é a bactéria Staphylococcus agalactiae, um diplococo Gram-positivo que possui como principal fator de virulência a presença de receptores de membrana específicos para linfócitos CD4+. e) O agente causador é a bactéria Staphylococcus agalactiae, um diplococo Gram-positivo que possui como principal fator de virulência a produção de enzimas aderentes às células genitais. 4. O cultivo do Treponema pallidum é dificultadoem laboratório de microbiologia, em decor- rência de suas necessidades nutricionais complexas. Assinale a opção que contém métodos diagnósticos alternativos às análises microbiológicas tradicionais: a) Os ensaios que podem ser aplicados são a coloração de Warthin-Starry e o PCR, porque possuem alta sensibilidade e especificidade. b) Os ensaios podem ser do tipo treponêmicos, como o FTA-Abs e não treponêmicos, como o VDRL. c) Os ensaios podem ser apenas do do tipo treponêmicos, como o VDRL. d) Os ensaios podem apenas do tipo não treponêmicos, como o FTA-Abs. e) O ensaio que pode ser aplicado é o PCR, que possui baixa sensibilidade e especificidade. 140 5 Nesta unidade, visitaremos o sistema respiratório para conhecer os componentes e as funções dele e as principais estruturas envolvidas com os processos patológicos. Estudaremos as principais faringites bacterianas, os agentes etiológicos e as virulências, assim como as patologias do sistema respiratório inferior, assim, não nos restrin- giremos, apenas, a doenças de alta incidência. Analisaremos os fa- tores de risco, os modos de transmissão e os métodos diagnósticos possíveis de execução na microbiologia. Esta unidade ajudará você a intensificar os seus conhecimentos na rotina laboratorial, além de sensibilizá-lo, ainda mais, para a profissão de analista laboratorial. Aspectos Clínicos, Epidemiológicos e Laboratoriais de Infecções Bacterianas do Trato Respiratório Me. Suelen Eloise Simoni 142 Em julho de 1976, mais de dois mil veteranos de guerra se reuniram nas salas de reunião do Hotel Bellevue, na Filadélfia, para o Congresso da Legião Americana. Eram dias quentes, e os antigos solda- dos contavam, apenas, com o sistema de ar-con- dicionado, água fresca e roupas leves para o alívio do calor. Já nos primeiros dias de reunião, alguns participantes do evento começaram a desenvol- ver quadros febris e sintomas de pneumonia. Em pouco mais de uma semana de encontro, mais de 200 membros da legião estavam contaminados e, dos internados, 34 deles vieram a óbito. Seria uma arma biológica? Uma nova epidemia? Quem seria o paciente zero e o que faria a doença se alastrar tão rápido nessa comunidade? Os membros do Centro de Controle e Preven- ção de Doenças dos Estados Unidos (CDC) já estavam de cabelos em pé em relação ao surto de pneumonia. Não só pela cobrança e pelo temor da população para a resolução do mistério, mas, também, pelas preocupações em conter a doença e evitar uma grande catástrofe microbiológica. A investigação de surtos, principalmente, de or- dem respiratória, é imprescindível, devido ao potencial de contágio da maior parte das doenças transmitidas pelo ar. Recentemente, tivemos a experiência com a pandemia da Covid-19, na qual o desconheci- mento do vírus, associado ao alto poder de dis- seminação dele, um potencial causador de efeitos agudos e crônicos no organismo, deixou o mundo todo em alerta e em estado de intensa insegu- rança. Acreditamos que não precisamos refletir muito a respeito da função de um profissional da UNICESUMAR UNIDADE 5 143 saúde frente às doenças respiratórias, uma vez que vivemos em uma realidade repleta de heróis des- conhecidos que atuaram no diagnóstico, no tratamento direto de pacientes e no desenvolvimento de vacinas para o combate direto, frente a esse problema de saúde pública seríssimo. Assim, convidamos você a, realmente, imergir nesse universo da microbiologia respiratória e a se engajar ainda mais nesse âmbito da área da saúde tão importante para a vida em comunidade. Agora é com você: imagine que você é um componente do Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), ou faz parte de um grupo de estudos epidemiológicos de algum órgão governamen- tal. Então, são dadas, a você, as funções de investigar e de documentar as possíveis causas e origens para essa misteriosa doença de ordem respiratória que acometeu os pobres veteranos de guerra. Você deve apresentar um relatório com toda a sua pesquisa, a fim de demonstrar o que o levou a chegar em determinada conclusão. Para isso, daremos uma pequena ajuda. Leia a revisão sistemática construída por Silva-Filho e colaboradores em 2017, com o acesso do QR Code a seguir. Por meio da leitura, você pode ter uma ideia das infecções respiratórias que possuem mais incidência, prevalência e importância clínica. Associe a sua pesquisa aos seus conhecimentos prévios e novos do assunto para defender a sua tese. Use o espaço Diário de Bordo para registrar os seus dados. Para acessar, use seu leitor de QR Code. Ao contemplar a revisão sistemática, ficou evidente que a maior parte das infecções respiratórias é de origem viral, não é mesmo?! Quem nunca foi parar em um atendimento de pronto-socorro para ouvir, do corpo clínico, que todos aqueles sintomas de coriza, febre, tosse produtiva e cansaço não eram, “apenas, uma virose”, certo?! Assim, neste material, veremos que, nem sempre, as doenças respiratórias são de origem viral. Assim como visto anteriormente, a participação das bactérias no desvendar dos mistérios médicos é bem pronunciada nessas patologias. Ao saber do que foi relatado, você acrescentaria mais alguma pesquisa para entregar o seu relatório final, a respeito do inexplicável surto de pneumonia que ocorreu na Flórida? Para ajudar, tente elucidar as seguintes questões: • Teria algum fator de risco associado ao surto que ocorreu naquela situação? • A maneira através da qual o agente etiológico se disseminou tem importância para a ocorrência dele? • Que mecanismos de patogenicidade que um microrganismo poderia apresentar para ser tão agressivo? https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/18706 144 Você pode usar o espaço a seguir para registrar as suas conclusões e para contemplar os questionamentos anteriores. Garantimos que, ao se iniciar este material com essa reflexão, não será nada complicado estudar esse tema a partir de agora. O trato respiratório superior é recoberto por células caliciformes, ou “goblet”, estruturas em forma de cálice, ciliadas e secretoras de muco e lisozima (defesa natural). Esse conjunto previne a entrada de partículas e patógenos e, ainda, mantém o epitélio respiratório, sempre, lubrificado. Na Figura 1, você poderá observar a estrutura organizacional desse epitélio. As células em forma de cálice, coradas, fortemente, em roxo, são as células caliciformes, e, no interior delas, há uma alta concentração de muco a ser expelido. Na parte superior, essas células são revestidas pelos cílios numerosos em formato de fio, que ficam em constante movimentação com a entrada e a saída de ar, e nos quais ficam aderidas bactérias e partículas estranhas, o que impede que esses elementos adentrem no sistema respiratório (BLACK; BLACK, 2021). UNICESUMAR UNIDADE 5 145 A função primordial do sistema respiratório é o transporte de oxigênio até a corrente sanguínea, para a distribuição dele em todos os órgãos do corpo, além de coletar o dióxido de carbono gerado nos processos de respiração celular para expulsá-lo do organismo através dos pulmões. Os componentes do sistema respiratório superior são: cavidade nasal, faringe, laringe, traqueia e brônquios. O ar entra pelas narinas, é transportado através da faringe (que possui conexão com a tuba au- ditiva), e, depois, é encaminhado para a laringe (aqui, estão as cordas vocais), que possui a epiglote, saliência de tecido que impede a passagem de um alimento para a traqueia (tubo de parede rígida que compõe esse sistema). A traqueia se divide em dois brônquios primários (um esquerdo e um direito), os quais dão origem aos bronquíolos. Até a laringe, há uma variabilidade de microrganismos que são parte da microbiota do sistema respi- ratório superior, como o Staphylococcus epidermidis, espécies de corinebactérias e Staphylococcus aureus. Como defesa do organismo, além do muco e do movimento das células ciliadas, pelos que revestem a superfície das cavidades nasais impedema passagem de grandes partículas. O reflexo da tosse e do espirro, também, remove bactérias e patógenos, além de, no caso de serem deglutidos, a maioria sofre destruição no sistema gástrico (BLACK; BLACK, 2021). Descrição da Imagem: na figura, há uma foto de uma lâmina com um corte histológico do epitélio respiratório. Na foto, há uma ca- mada de células na diagonal, em forma de cálice e coradas da cor roxa. Na superfície desses cálices, há inúmeros fios de cor castanha, semelhantes a fios de lã, que ilustram a morfologia dos cílios. Abaixo dessas células, no sentido horizontal, há uma camada de peque- nas esferas, também, coradas da cor roxa, que representam as fibras elásticas. Todas essas estruturas pousam sob uma superfície de coloração rosa claro. O fundo da figura apresenta uma coloração branca. Figura 1 – Células caliciformes do epitélio respiratório. / Fonte: Shutterstock ([2023a], on-line). 146 Com relação ao trato respiratório inferior, é composto pelos bronquíolos (que se dividem a partir dos brônquios), com a constituição da árvore bronquial, localizada nos pulmões. É importante se lembrar de que essas regiões são, completamente, estéreis em condições normais. Os canais microscópicos presentes nos bronquíolos conduzem o ar até aos alvéolos pulmona- res, estruturas semelhantes a nódulos, nas quais ocorre a troca gasosa, de forma que o oxigênio se difunde para o sangue, enquanto o gás carbônico passa da corrente sanguínea para o alvéolo, através de uma camada fina de epitélio. A pleura, membrana que reveste a superfície dos pulmões e as cavidades deles, também, produz um líquido seroso responsável pela lubrificação dessas regiões (BLACK; BLACK, 2021). No trato respiratório inferior, estão dispersos, também, macrófagos alveolares que auxiliam no combate a patógenos. Os componentes do sistema respiratório e as localizações anatômicas deles poderão ser vistos na Figura 2, a seguir: Faringe Traqueia Brônquios Bronquíolos PulmõesPleura Pulmões Alvéolos pulmonares Brônquios Laringe Cavidade nasal Diafragma Descrição da Imagem: Ina figura, há um desenho do tórax de um indivíduo, nos planos coronal e sagital, da cor salmão. No plano sagital, é possível observar as cavidades nasais, a faringe e a laringe, exatamente, nessa ordem. No plano coronal, estão representados a traqueia, na forma de um tubo branco; os brônquios (ramificações da traqueia, uma do lado direito e outra do lado esquerdo); os pulmões, que são semelhantes a um triângulo, na diagonal; os bronquíolos, que se dispersam pelo pulmão, em estruturas semelhantes a raízes; e os alvéolos pulmonares, que possuem forma esférica e se parecem com nódulos. Ainda, ao revestir os pulmões, há uma fina camada de pleura, da cor azul, e, abaixo deles, há o diafragma. Figura 2 – Representação gráfica dos sistemas respiratórios superior e inferior. / Fonte: Enfermagem Florence (2019, on-line). UNICESUMAR UNIDADE 5 147 As orelhas e as estruturas delas, também, possuem relevância para o sistema respiratório. Compos- ta pelas orelhas externa, média e interna, a orelha, também, fica exposta ao ataque microbiano, e infecções nas regiões média e externa podem refletir em complicações na faringe. As otites, infecções associadas a episódios de febre e à presença de pus, dão-se pela transferência de microrganismos da garganta para a região das orelhas, como o Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes e Haemophilus influenzae. As Pseudomonas aeruginosa são comuns em infecções em nadadores, pela resistência desse micror- ganismo ao cloro da piscina. O tratamento se dá pela administração tópica, ou oral, de antimicro- bianos, e a principal sequela, principalmente, em crianças, é fruto de episódios de otite maltratados, que prejudicam a audição e, consequentemente, a fala (BLACK; BLACK, 2021). A transmissão de infecções bacterianas no trato respiratório superior costuma acontecer pela inalação de gotículas provenientes de indivíduos infectados, principalmente, em épocas de frio e em locais fechados e de pouca circulação de ar. 148 A começar pela faringe, a maior parte das farin- gites é de origem viral, no entanto, a faringite estreptocócica merece atenção. O Streptococcus pyogenes, coco Gram positivo e beta hemolítico do grupo A, é o causador da faringite estrepto- cócica e pode ser adquirido a partir de indiví- duos com doença ativa, portadores sadios, e até cães e outros animais de estimação. A infecção inicia com uma inflamação local, que pode ser observada em exames de rotina feitos em um consultório médico. Costuma evoluir para a formação de lesões supurativas e inchaço dos linfonodos do pescoço, e, comumente, causa febre alta, calafrios e dificuldade de deglutição (BLACK; BLACK, 2021). O gênero dos Estreptococos é, amplamente, estudado, e a especificação de todos os integran- tes dele é separada por características bioquí- micas, sorológicas e pelo padrão hemolítico. Antes mesmo de entrarmos no universo das bacté- rias, o que você acha de aquecer os seus conheci- mentos ao conhecer um pouco mais das doenças respiratórias virais? Nesses minutinhos de conversa, devemos nos familiarizar com as principais famílias associadas ao sistema respiratório, com os meca- nismos que esses agentes utilizam para infectar o epitélio e os desdobramentos mais importantes que envolvem as doenças de etiologia viral. É só clicar no play! Os padrões sorológicos são classificados dentro do critério dos grupamentos Lancefield, que vão de A até W. Os padrões hemolíticos são obtidos pela semeadura da bactéria em água-sangue, e, nela, é observado o tipo de hemólise (quebra das hemá- cias) no meio de cultura. Podem ser classificados como hemólise total, ou beta; hemólise parcial, ou alfa; e hemólise inexistente, ou, também, chamada de gama hemólise (Figura 3). Os beta hemolíticos são classificados de acordo com os grupamentos de Lancefield, uma divisão criada baseada nos antígenos de superfície específicos (carboidratos) de cada bactéria, e é essa caracte- rística, inclusive, que permite que testes rápidos de imunoensaio possam ser aplicados, facilmente, na triagem de pacientes com faringite. Enquanto isso, os gama e alfa hemolíticos são divididos de acordo com as propriedades bioquímicas (MUR- RAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). UNICESUMAR https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/14619 UNIDADE 5 149 O S. pyogenes é do grupo A de Lancefield, e pos- sui, na membrana, dímeros de N-acetilglucosamina e ramnose. A produção e a expressão da proteína M é o que associa as cepas à patogenicidade e à virulência dentro dessa espécie. Além dela, na superfície do S. pyogenes, existem a proteína F e os ácidos lipoteicoicos, responsáveis por facilitar a ancoragem da bactéria ao se ligarem à fibronectina das células do hospedeiro (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). A bactéria produz, ainda, toxinas termolábeis, que agem como superantígenos, a fim de sensibilizar células do sistema imune, como macrófagos e neutrófilos, através da indução na liberação de citocinas pró-inflamatórias. Enzimas bacterianas, como estreptolisina O e S clivam as células sanguíneas, os leucócitos e as plaquetas. A liberação de estreptoquinase desfaz os coágulos sanguíneos e facilita a disseminação da bactéria pelo organismo (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). O tratamento de faringites deve ser realizado assim que possível, uma vez que a proteína M possui similaridades moleculares com células do tecido cardíaco, dessa forma, ao produzir anticorpos contra a proteína bacteriana, o sistema imune pode, involuntariamente, atacar o próprio orga- nismo. Além disso, a família de exotoxinas responsável pela manifestação da escarlatina pode estar ligada a outras doenças estreptocócicas, como fasceíte necrosante e síndrome do choque tóxico (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Agora, faremos um exercício rápido de resgate de conhecimento: volte para a Unidade 2 e encontre o distúrbio renal ligado a infecções estreptocócicas,e como se daria esse mecanismo de patogenicidade. Se você buscou, corretamente, no seu material, encontrou que a glomerulonefrite pode ser causada por infecções sistêmicas e prévias pelo S. pyogenes, o que é, completamente, possível no caso de amigdalites ou faringites estreptocócicas não tratadas da forma correta. O tratamento de faringites supurativas, mesmo em casos não confirmados para S. pyogenes, costuma acontecer à base de amoxicilina, associada, ou não, a clavulanato de potássio, a depender da gravidade dos sintomas. Pode ser administrada oralmente, ou através de injetáveis (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Beta Alfa Gama Descrição da Imagem: na figura de fundo branco, há uma foto de uma placa de Petri redonda, composta por ágar sangue. A placa possui um fundo vermelho, e, nela, estão semeadas três estrias de bactérias. A primeira, à esquerda, é um estriamento contínuo, no qual, ao redor das bactérias, existe um halo de hemólise de coloração amarela. Bem no centro desse estriamento, há um quadro vermelho com a escrita “beta” em letras brancas. No segundo estriamento, ao centro, o halo de hemólise é esverdeado, e, no centro, há um quadro vermelho com a escrita “alfa” em letras brancas. O terceiro estriamento fica à direita da placa, e não apresenta uma formação de halo, e, no centro, há um quadro vermelho com a escrita “gama” em letras brancas. Figura 3 – Padrão de hemólise em ágar sangue. Fonte: Portal Ped (2022, on-line). 150 É importante se lembrar, também, de que a faringite viral é a mais comum de ocorrer, e, dessa forma, o uso de antibacterianos não é eficaz no tratamento da patologia. Outra infecção importante, e de acometimen- to inicial, na faringe, é a difteria, doença causada por cepas toxigênicas da bactéria Corynebacte- rium diphtheriae. No Brasil, de 2010 a julho de 2022, foram contabilizados 83 casos conhecidos da doença, com a maioria deles concentrados na região Nordeste (BRASIL, 2022). O principal mecanismo de patogenicidade dessa bactéria é a produção de uma exotoxina capaz de inibir a produção de proteínas essenciais, o que leva, à morte, as células do hospedeiro. A bactéria é um bastonete Gram positivo, de estrutura clavifor- me (mais espessa em uma das extremidades), e pode fazer parte da microbiota normal do ser humano. Está presente no nariz, na garganta, no sistema urinário e na pele, no entanto, não é pro- dutora de toxinas, portanto, não prejudica o indivíduo (BLACK; BLACK, 2021). A doença inicia com febre e inflamação, em detrimento da infecção das células epiteliais da faringe, de forma que uma membrana fina e de aparência acinzentada se forma no fundo da garganta, rica em fibrina, com células de defesa mortas e carga bacteriana, o que impede, muitas vezes, a passagem de ar para os pulmões (MUR- RAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Manifestações clínicas no tecido cardíaco e no sistema nervoso podem ser observadas nos casos de difteria grave, em decorrência da ação da exotoxina. A toxina, também, chamada de tipo A-B (assim como as toxinas tetânica e botulíni- ca), possui duas subunidades: a subunidade B é responsável por se ligar às células eucarióticas, por intermédio de receptores do tipo EGRF (fa- tor de crescimento epidermal); e a subunidade A possui uma região catalítica responsável por interferir na produção proteica da célula (TOR- TORA; FUNKE; CASE, 2019). A transmissão da bactéria, assim como na maioria das doenças respiratórias, acontece via aérea, por meio de gotículas provenientes de indivíduos infectados, e possui, também, uma forma cutânea, a partir da infecção de feridas já existentes na pele. O tratamento, geralmente, envolve a administração de antimicrobianos e inativadores da toxina, mas a forma mais eficaz é a vacinação. A vacina DTP (que previne, tam- bém, o tétano e a coqueluche) contém o toxoide diftérico, uma forma atenuada da toxina capaz de gerar uma reação fraca na produção de anti- corpos, por isso, são necessárias doses de reforço a cada 10 anos (de acordo com o esquema vacinal brasileiro) (BLACK; BLACK, 2021). A coqueluche, doença bacteriana causada pela Bordetella pertussis, apesar de ter uma baixa incidência, também, tem importância clí- nica. A patologia acomete, majoritariamente, as crianças, sobretudo, as menores de um ano, e concentra cerca de 61% dos casos confirmados no Brasil nessa faixa etária. Desde 2015, observou-se uma queda substancial de casos, com uma inci- dência de 0,1/100.000 habitantes em 2021. Em 2022, foram confirmados, até o mês de julho, mais de cem casos. É um distúrbio que inicia no trato respiratório superior, mas que tem os sintomas mais pronunciados assim que a bactéria invade o sistema respiratório inferior (BRASIL, 2022). O agente etiológico é um bacilo Gram ne- gativo, aeróbio obrigatório, geralmente, encap- sulado, e que ataca, especificamente, as células ciliadas presentes na traqueia (Figura 4), a fim de impedir o movimento ciliar delas e provocar a destruição celular através da toxina traqueal. A primeira fase da doença, chamada de fase catarral, é caracterizada por sintomas inespe- cíficos, como febre e coriza, que precedem um UNICESUMAR UNIDADE 5 151 estágio mais sério, composto por crises e surtos de tosse seca intensa e frequente. O estágio seguinte, a fase de tosse paroxística, é o mais característico da doença, e marcado por uma tosse incessante (como forma de reflexo pelo acúmulo de muco), o que causa cansaço extremo e dores torácicas. En- tre uma tosse e outra, o paciente costuma emitir um som de suspiro intenso, o que, também, ajuda o médico a fazer o diagnóstico clínico da doença (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). B. pertussisB. pertussisB. pertussis Células Células ciliadasciliadas Células ciliadas Descrição da Imagem:na figura, há uma representação gráfica tridimensional do epitélio respiratório, ilustrado através de células ciliadas. Os cílios são alongamentos semelhantes a fios cilíndricos, e da cor branca. Aderidos a eles e entre eles, estão pequenos bacilos da cor laranja, que representam a bactéria Bordetella pertussis. Figura 4 – Células de Bordetella pertussis aderidas às células ciliadas do epitélio respiratório. Fonte: Tortora, Funke e Case (2019, p. 721).. O diagnóstico costuma ser clínico, mas os méto- dos microbiológicos têm uma possível aplicação a partir de amostras obtidas de swabs específicos (inseridos pelas narinas até a garganta, para cole- tar o material enquanto o paciente tosse), semea- dos em meios de cultura. No entanto, a Bordetella pertussis é um microrganismo fastidioso, e que requer condições muito específicas para o cultivo. Por essa razão, o diagnóstico laboratorial costuma ser realizado por meio de testes moleculares. O tratamento com antimicrobianos costuma reduzir o potencial de contágio, mas a decisão terapêutica principal é o uso de antitussígenos para a amenização da fase paroxística (TORTO- RA; FUNKE; CASE, 2019). No entanto, a forma mais eficaz de combater a coqueluche é a ampla vacinação, de forma que, quanto maior a cober- tura vacinal, menor o índice do coeficiente de incidência (BRASIL, 2022). A infecção nos seios nasais, ou sinusite, tem, como agentes etiológicos principais, o S. pyoge- nes, o Staphylococcus aureus e a Moraxella ca- tarrhalis. O edema gerado nessas regiões impede a circulação e a drenagem dos líquidos sinusoides, 152 a fim de acumular muco e promover uma proli- feração bacteriana. Ainda, nos casos agudo e crô- nico, o uso de antimicrobianos, como penicilina, pode ser administrado (BLACK; BLACK, 2021). Já as bronquites, infecções que acometem brônquios e bronquíolos, mas não alvéolos, estão ligadas a inúmeros fatores, como poluição do ar, inalação de poeira de carvão, tabagismo e hereditariedade. Nesses casos, os indivíduos apre- sentam tosse com escarro de caráter mucoso, rica em carga bacteriana e células imunológicas. Por se tratarem de infecções mais profundas, o manejo e o cuidado delaspodem ser mais complicados. Além disso, alguns agentes etiológicos diferentes podem aparecer (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). As bronquites (assim como algumas pneumonias) podem ser causadas por micoplasmas, bactérias sem parede celular que promovem a infecção pela fusão da membrana citoplasmática delas com as células hospedeiras. O Mycoplasma pneu- moniae é um patógeno extracelular, o qual se adere às células do trato respiratório por um complexo de proteínas adesinas, as quais in- teragem com os cílios das células respiratórias, estas que sofrem perda da característica móvel e destruição. Além disso, a liberação de citocinas pró-inflamatórias, do fator de necrose tumoral alfa e de interleucinas IL-1 e IL-6 é estimulada, a fim de levar mais fagócitos e células imunológicas ao local de infiltração microbiana (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Com relação às infecções do trato respirató- rio inferior, duas patologias merecem destaque: as pneumonias e a tuberculose. A tuberculose é uma velha conhecida de todos, afinal, a doença abrange os contextos científico, social e cultural, uma vez que já foi considerada o “mal romântico” do século 19 pelos poetas e escritores brasileiros da época (GOMES, 2017). A doença, ainda, é um im- portante problema de saúde mundial, e tem, como estimativa, cerca de dez mi- lhões de casos espalhados pelo mundo a cada ano, com, aproximadamente, um milhão de mortes (WHO, 2020). UNICESUMAR Eu acho que gostaria de morrer de Tuberculose, por que as mulheres me veriam e diriam: "Olhem aquele pobre Byron. Quão interessante ele parece morrendo." Lord Byron UNIDADE 5 153 O coeficiente de incidência da doença, no Brasil, é próximo dos 30 casos a cada 100 mil habitantes, com um número de óbitos que ronda a faixa dos quatro mil, incluindo um índice de mortalidade de 2,2 óbitos por cem mil habitantes (BRASIL, 2021). Dentre os critérios sociais que envolvem o aco- metimento, a população carcerária, assim como idosos e crianças, está entre os indivíduos mais suscetíveis (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). O Mycobacterium tuberculosis é o agente etiológico, um bacilo fino e aeróbio obrigatório que não é corado pelo Gram. Ainda, é utilizada uma técnica corante diferente para um ensaio bacterioscópico. Pode ser chamado de Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR), devido ao fato de a parede celular ser rica em conteúdo lipídico, denominado de ácido micólico, característica que confere, à bactéria, uma alta resistência a sanitizantes. Por fim, trata-se de um potente agente pró-inflamatório que auxilia no mecanismo de patogenicidade desse microrganismo (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). A inalação do bacilo é a forma de transmissão, e, quando ele chega nos pulmões, é fagocitado pelos macrófagos, ali, presentes. Em uma fase inicial, na qual o sistema imune falha ao combater a bactéria, o bacilo se multiplica no interior dos macrófagos, por impedir a formação completa do fagossoma (estrutura rica em lisossomos digestivos), com a geração de respostas quimiotáticas (transdução de sinal no interior dos leucócitos, o que leva mais células imunes ao local da infecção) e de um agregado de bactérias, células e tecido conjuntivo que se torna, futuramente, um tubérculo, uma espécie de nódulo na região do pulmão (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Esses bacilos são capazes de destruir espécies reativas de oxigênio (principal ação dos fagócitos) e de biossintetizar ácidos mi- cólicos que conferem mais resistência à bactéria, e utilizam ácidos gordos (colesterol) como fonte de energia, o que permite a adaptação em ambientes pobres em carboidratos (FORRELLAD et al., 2013). " " 154 Enquanto estão presentes no tubérculo, os bacilos possuem uma baixa capacidade de multiplica- ção, por isso, podem permanecer por longos períodos de forma latente, inativados por calcificação, em caso de cura, ou, finalmente, liberados em fases ativas da doença. Quando liberadas, as bactérias atingem os sistemas linfático e circulatório, e se disseminam, por vezes, em outros órgãos (chamada de tuberculose miliar), mas a atividade de multiplicação é muito maior nos pulmões. Assim que novos macrófagos são infectados, uma resposta inflamatória intensa e aguda é gerada, a fim de liberar uma grande quantidade de líquido no tecido pulmonar, o qual origina mais sintomas, como tosse prolon- gada, dor no peito, febre e fadiga. Quando as lesões tuberculosas se rompem em regiões próximas a vasos sanguíneos, é possível que o indivíduo evolua para um quadro de tosse, e acompanhada por sangue, uma marca bem característica da doença (BLACK; BLACK, 2021). Pacientes com o vírus HIV ativo são acometidos pela bactéria na forma de doença oportunista, devido ao baixo número de linfócitos no sistema circulatório. Em fases avançadas da virose, os testes usuais para tuberculose (testes tuberculínicos) se apresentam negativos, o que contribui para a subnotificação da doença nesses indivíduos e o agravamento do quadro pulmonar. Ainda, esses pacientes são reservatórios do bacilo, assim, tornam-se potenciais fontes de transmissão (HAVLIR; BARNES, 2005). A coloração, pela técnica de Ziehl-Neelsen, é a maneira encontrada para a realização da bacterios- copia frente a uma suspeita de tuberculose. Nela, uma solução de fucsina é adicionada ao esfregaço bacteriano na lâmina de vidro, e é deixada por cerca de cinco minutos para o aquecimento. Após esse período, a lâmina é enxaguada e, nela, é pingada uma mistura de ácido clorídrico 30% e de álcool etí- lico absoluto. Ainda, nessa etapa, todas as bactérias que não têm lipídios na própria parede celular são descoradas, assim, sobram, apenas, as unidades de Mycobacterium spp da cor rosa, fixadas à lâmina. Depois, o corante azul, de metileno, é adicionado para conferir um contraste visual à lâmina, o que acaba colorindo células epiteliais e leucócitos de azul (OSANTE; RUIZ, 2016). O aspecto da lâmina com teste positivo para micobactérias fica semelhante ao da Figura 5. Descrição da Imagem: na figura, há uma foto de uma lâmina microbiológica vista em microscópio, com um aumento de 400x. Nela, existem células disformes e coradas da cor azul escuro, dispostas por toda a lâmina, com a representação de células epiteliais e leucócitos. Entre essas células, é possível observar bacilos alongados e finos de coloração rosa, que representam a bactéria Mycobacterium tuberculosis. Figura 5 – Lâmina corada pela técnica de Ziehl-Neelsen para bacterioscopia de Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR). Fonte: Shutterstock ([2023b], on-line). UNICESUMAR UNIDADE 5 155 O tratamento para a tuberculose costuma atingir níveis satisfatórios de controle, pois alcança até 85% de sucesso (BRASIL, 2021). Atualmente, a terapia dura, em média, seis meses, e é composta por rifampicina, isoniazida, etambutol e pirazinamida, drogas de primeira linha. O tempo longo da terapia é devido a uma possível presença de tubérculos dormentes, bactérias dentro de macrófagos; e de granulomas em regiões anatômicas de difícil alcance (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Título: Osmose Jones - Uma Aventura Radical pelo Corpo Humano Ano: 2001 Sinopse: Já imaginou se você pudesse ver, ainda mais de perto, como as suas células corporais funcionam frente a um patógeno? O filme mostra a rotina de um leucócito aventureiro que precisa lutar sem medir esforços para combater um vírus muito perigoso e esperto. Comentário: Você pensou que essa cinéfila que vos fala não indicaria nada para esta unidade? Queridos alunos, este filme guarda um espaço especial no meu coração. Quando eu era, ainda, pequena, e nem imaginava que entraria para a área da saúde, esse já era um dos meus filmes favoritos. Entretanto, quando comecei a estudar microbiologia e imunologia, a figura do Osmose Jones, sempre, vinha na minha memória e trazia um pouco de leveza para os aprendizados. Espero que o mesmo efeito ocorra em você! Divirta-se! DESTAQUE A vacina BCG (“Bacilo de Calmette &Guérin”), criada em 1921, por Léon Calmette e Alphonse Guérin, e produzida a partir de uma cultura de cepas não virulentas de Mycobacterium bovis, voltada para a imunização contra as tuberculoses pulmonar e miliar, está no calen- dário vacinal brasileiro, com uma aplicação de dose única indicada para crianças de até quatro anos de idade, um fator primordial para o controle da doença no território nacional (BRASIL, 2021). 156 Já as pneumonias, marcadas pela inflamação do tecido pulmonar, podem ser causadas por inúmeros microrganismos, como fungos, vírus e bactérias, com sintomas semelhantes, indepen- dentemente do agente etiológico, os quais incluem tosse produtiva, dores agudas no peito e na região das costas, taquipneia (aumento da frequência respiratória), febre e calafrios. De modo geral, os microrganismos são capazes de atingir regiões mais inferiores do sistema respiratório, através da aspiração de secreções de orofaringe, inalação de aerossóis que contêm bactérias, ou dissemina- ção via corrente sanguínea. Ainda, é importante se lembrar de que, para que uma infecção assim ocorra, a carga bacteriana deve ser concentrada. A virulência do patógeno, geralmente, é alta, e as defesas do hospedeiro, normalmente, encon- tram-se enfraquecidas (BRASIL, 2010). O pneumococo, maneira através da qual o Streptococcus pneumoniae, também, é conhe- cido, é um coco Gram positivo organizado em duplas (Figura 6), catalase negativa composta por uma cápsula densa (responsável pela di- ferenciação sorológica), que torna o patógeno, altamente, resistente à fagocitose. A cápsula de polissacarídeos, na forma purificada, também, é o composto fundamental para a produção da vacina contra o pneumococo. O S. pneumoniae é alfa hemolítica (hemólise parcial), devido à produção de uma pneumolisina que destrói as células sanguíneas, com a produção de um pigmento de coloração esverdeada. Por ser um microrganismo de exigências nutricionais im- portantes, costuma crescer em laboratório, apenas, em meios de cultura suplementados com sangue ou derivados (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Descrição da Imagem: na figura, há um desenho tridimensional da bactéria Streptococcus pneumoniae. Ao fundo, há uma base da cor rosa, que representa o epitélio respiratório. Várias esferas organizadas em pares e da cor roxa estão dispostas na figura, de forma que, na parte em que se encontram, o envoltório se torna reto. Figura 6 – Representação tridimensional do pneumococo. / Fonte: Shutterstock ([2023c], on-line). UNICESUMAR UNIDADE 5 157 A pneumonia pneumocócica costuma envolver brônquios e alvéolos, a fim de deixá-los reple- tos de células sanguíneas e neutrófilos. Após colonizar a região da orofaringe, ao se aderir ao epitélio através de adesinas, a bactéria é capaz de atingir pulmões, mas, também, a tecidos neurais, ao estimular a secreção de ativos causadores de febre, a qual costuma iniciar de forma abrupta e elevada (39 °C a 41 °C). A pneumolisina se liga ao colesterol da célula do hospedeiro, cria poros e destrói o epitélio ci- liado do sistema respiratório. Ainda, a habilidade de produzir peróxido de hidrogênio intensifica ainda mais essa reação. A presença de fosforil- colina na parede celular favorece a ligação dessas estruturas a fatores ativadores de plaquetas, o que diminui a fagocitose. Ainda, a presença da bac- téria influencia na liberação de interleucinas e o fator de necrose tumoral alfa desencadeiam os sintomas de pneumonia (MURRAY; ROSEN- THAL; PFALLER, 2021). O tratamento costuma ser simples, no en- tanto, uma grande parte dos sorotipos de S. pneumoniae é resistente a penicilinas, e já se tem documentado, também, resistência frente à eritromicina, a tetraciclinas e a cefalosporinas. Por essa razão, normalmente, a terapia é com- posta por uma associação de antimicrobianos, principalmente, após o diagnóstico confirma- tório para pneumococo e com a realização de testes de susceptibilidade bacteriana (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). No entanto, a vacinação dos grupos de risco, os quais, no Brasil, costumam ser os idosos e as crianças com menos de dez anos, é oferecida pela rede pública. A PNCC 10 (Pneumocócica 10 valente) previne a infecção por 10 sorotipos de S. pneumoniae, de proteção direta contra os sorotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, e, para o sorotipo 19A, com proteção do tipo cruzada (BRASIL, 2021). Ainda, no grupo dos Gram positivos, o Sta- phylococcus aureus, resistente à meticilina, também, denominado de MRSA, ainda, pode ser um agente etiológico de pneumonias, mesmo que raramente. Essa bactéria é resistente a uma diversidade de beta-lactâmicos e induz a produ- ção de uma citocina, chamada de PVL (do inglês, Panton-Valentine Leukocidin), que desencadeia a destruição de leucócitos e ocasiona a necrose de tecidos. Por essa razão, pneumonias causadas por esse agente etiológico costumam ter um prog- nóstico bem pessimista (ADLER et al., 2006). A pneumonia causada por Bacillus anthracis pode ocorrer pela inalação do microrganismo, a fim de gerar, tipicamente, hemorragias medias- tinais. Esse microrganismo esporulado e Gram positivo faz a produção de três tipos de antígenos: o antígeno protetor (PA), o fator de edema (EF) e o fator letal (LF). A proteína PA se liga às células do hospedeiro pelo receptor ATR (do inglês, Anthrax Toxin Receptor), enquanto o EF é responsável por interferir com mecanismos intracelulares de células infectadas, ao impedir a fagocitose desse microrganismo. O LF inativa membros da família MAPKK, um grupo de enzi- mas que regula processos oxidativos, o que leva à destruição de macrófagos. A frequência dele é muito rara, mas costuma ser letal, devido à alta resistência do microrganismo a antimicrobianos usuais (PILO; FREY, 2018). O Haemophilus influenzae, também, é uma bactéria importante para o estudo das pneumo- nias bacterianas, com as populações idosa e infantil como principais grupos de risco. Tam- bém, causador de meningites, o cocobacilo Gram negativo, quando encapsulado, sobretudo, o tipo b (Hib), é um agente etiológico em emergên- cia nos países em desenvolvimento, ou naqueles nos quais a vacina para a bactéria, ainda, não é disponível (WHO, 2002). 158 A bactéria coloniza o trato respiratório su- perior, ainda, nos primeiros meses de vida, e pode se disseminar em sinus e orelha média. Os principais fatores de virulência nos sorotipos encapsulados são a liberação de endotoxinas e a produção do polissacarídeo antifagocítico, o PRP (do inglês, polyribitol phosphate), estrutura contra a qual o sistema imune produz anticorpos, de maneira que é aumentada a possibilidade de desenvolvimento de meningite e de epiglotite (infecção da epiglote e risco de anafilaxia) (MUR- RAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). A Burkholderia pseudomallei, bacilo Gram negativo localizado dentro do gênero Pseu- domonas, é a causadora da Melioidose, doença que, normalmente, apresenta-se como uma pneumonia que pode evoluir para um quadro necrosante. Marcada por febre alta, dor torácica intensa e mialgia generalizada, costuma acometer mais os lóbulos superiores do pulmão, e pode se espalhar por todo o organismo, a fim de formar abscessos e sepse severa. Diferente da maioria das pneumonias, a transmissão dela pode se dar por via respiratória, mas, também, pela ingestão da bactéria, ou pelo contato dela com ferimentos epidérmicos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). O gênero Chlamydophila (mencionado em al- gumas literaturas, também, como Chlamydia), composto por agentes Gram negativos e intra- celulares obrigatórios, também, é capaz de causar pneumonias. A clamidiose, psitacose, ornitose, ou febre dos papagaios, é uma zoonose causa- da pela C. psittaci, e pode ser transmitida por inalação, quando há o contato de humanos com aves, em geral, ou o contato direto com um in- divíduo infectado. No processo, há a formação de corpúsculos elementares que conferem uma alta resistênciaao microrganismo. Os sintomas costumam ser febre alta, tosse, e, em algumas si- tuações, delírios e desorientação, caso o sistema nervoso seja acometido. Já a pneumonia causada pela Chlamydophila pneumoniae possui uma sintomatologia semelhante à da H. influenzae, mas, de forma mais branda, e após o período de convalescença, é observada a presença de anti- corpos de memória contra o microrganismo (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Não pense que eu me esqueci do nosso misté- rio microbiológico da vez: os militares america- nos apresentaram a enigmática doença respirató- ria. Até o momento, estudamos bactérias com um alto potencial contagioso e com reservatório no homem e em animais. Entretanto, se descobrimos que bactérias que utilizam a água como reser- vatório natural possuem potencial para causar doenças respiratórias, como você justificaria o contágio? Você acha que seria possível? Esse tipo de microrganismo, exatamente, foi responsável pelo surto de pneumonia em 1976, na Flórida. Como relatei, o congresso dos vetera- nos de guerra ocorreu em dias muito quentes de maio, e com, apenas, o ar-condicionado da sala de reuniões como alternativa frente a altas tempe- raturas, o grupo de legionários jamais imaginaria que, na água de circulação dos aparelhos refrige- radores, habitava uma bactéria de alta letalidade. A protagonista do nosso estudo lá do início desta unidade é a Legionella pneumophila, um microrganismo Gram negativo (mesmo que se core, fracamente, pela técnica), oxidase positiva que realiza replicação celular dentro dos macró- fagos, e de forma facultativa, diferente de todos os organismos que estudamos até agora. O mi- UNICESUMAR UNIDADE 5 159 crorganismo é muito conhecido, também, na área parasitológica, por ter a capacidade de parasitar em alguns protozoários e amebas (Figura 7). A doença é caracterizada por febre alta, normalmente, acima de 40 °C, acompanhada por sintomas tradicionais das pneumonias, como tosse produtiva e dor no peito. Chamada, também, de Doença dos Legionários, em função do surto relatado no estudo de caso, ela é catalogada, comumente, na América do Norte e na Europa (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Descrição da Imagem: na figura, há uma foto de uma lâmina microscópica com um aumento de 400X. O fundo da figura é da cor rosa claro, e, no centro, existem duas células arredondadas e unidas entre si, pelas extremidades laterais. A célula da esquerda é de colo- ração rosa, bem escura, e possui quatro vacúolos no citoplasma, de coloração branca e pálida. Na extremidade inferior, há um núcleo corado, fortemente, de azul. A célula da direita possui um vacúolo e um núcleo azul, também, na extremidade inferior. Dispersas no citoplasma das duas células, estão correntes de bacilos Gram negativos, corados da cor rosa, que formam uma estrutura semelhante a uma parede de tijolos. Na célula da esquerda, há uma flecha da cor vermelha, na extremidade superior da estrutura, que indica a corrente de bactérias. Figura 7 – Cadeias Legionella pneumophila em fase de multiplicação dentro de protozoários da espécie Tetrahymena pyriformis. / Fonte: Public Domain Files (2012, on-line). Estudos recentes indicam que a inalação de gotículas de água onde a bactéria está presente é a forma através da qual atinge o organismo humano. O reservatório natural dela é aquático, como rios, lagos e piscinas (devido a uma alta resistência ao cloro), e, ainda, na água presente em sistemas de refrigeração de ar-condicionado, o que os torna locais de climatização artificial (hotéis, hospitais, escolas) como foco de contaminação. Não existem, no entanto, muitos dados de epidemiologia na América do Sul, mas, no Brasil, os poucos estudos que envolvem a bactéria revelam que trabalhadores de unidade de terapia intensiva costumam apresentar resultados sorológicos positivos frente a esse pa- tógeno (MAZIERI; GODOY, 1993). Laboratorialmente, deve-se suspeitar da pneumonia causada por 160 L. pneumophila, sempre, que o esfregaço de material clínico tem uma grande quantidade de neutrófilos, mas sem identificação da bactéria, e na situação de falha terapêutica de antimicrobianos, usualmente, utilizados para tratar de pneumonias, como aminoglicosídeos e beta-lactâmicos (CHEDID, 2002). Os fatores de virulência que envolvem a L. pneumophila são o lipopolissacarídeo da parede celular, que age ao aderir, firmemente, às células do epitélio respiratório, assim como as proteínas porinas, que, além de tornarem a célula do hospedeiro permeável, ligam-se a componentes do sistema complemento. Genes codificadores (dos tipos Icm, mip e ompS) transcrevem proteínas de resistência ao fagossoma do macrófago, incluindo fatores de secreção que estão envolvidos com a infeção celular (STEINERT; HENTSCHEL; HACKER, 2002). A legionelose é associada à Síndrome do Prédio Doente, doença reconhecida pela OMS em 1982, e caracterizada por um conjunto de doenças causadas por patógenos e partículas químicas presentes em prédios climatizados artificialmente, sem uma devida circulação de ar. No Brasil, a Resolução nº 9, de 16 de janeiro de 2003, dispõe sobre os Padrões Referenciais de Qualidade do Ar Interior em ambientes climatizados artificialmente, de usos público e coletivo, a fim de estabelecer valores de referência para parâmetros físico-químicos (velocidade do ar, concentração de gás carbônico, índices de umidade e temperatura) e microbiológicos que consistem na contagem total de fungos e na identificação de fungos patogênicos. A aplicação da legislação é realizada por Planos de Manu- tenção, Operação e Controle (PMOC) adotados por empresas, e que estabelecem os procedimentos e a periodicidade de verificação da integridade e dos estados de limpeza e de conservação dos sistemas de climatização (BRASIL, 2003). Pneumonias, também, podem ser causadas por enterobactérias, sobretudo, pela Klebsiella pneumo- niae, principalmente, em pacientes com imunidade prejudicada e em ambientes hospitalares. É um microrganismo que, normalmente, coloniza o trato respiratório superior, e a infecção causada por ele se inicia com tosse, dor torácica, febre e dispneia (falta de ar). Os principais fatores de virulência dessa bactéria são a presença da cápsula polissacarídica, que dribla o sistema imune e a fagocitose; de fímbrias na superfície celular, que favorecem a adesão às células do hospedeiro; resistência capsular frente ao soro bactericida produzido pela via do sistema complemento; e produção de aerobactina, responsável por quelar o ferro da célula infectada, um fato primordial para o crescimento (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Alguns sorotipos são resistentes a antimicrobianos de amplo espectro, classificados, assim, como KPCs (Klebsiella Pneumoniae produtora de carbapenemases). Essa habilidade é associada à transferência de genes plasmidiais, e o tipo mais comum, no território brasileiro, é a KPC-2. Os indivíduos mais suscetíveis incluem aqueles de idade avançada, em ventilação mecânica, em hos- pitalização prolongada, com imunossupressão e sob o uso de dispositivos invasivos. A principal linha terapêutica para indivíduos com infecções causadas por KPC é a polimixina B e E, ainda que UNICESUMAR UNIDADE 5 161 com cautela, devido à alta nefrotoxicidade desses agentes (OLIVEIRA, 2018). Então, querido (a) aluno (a), você sentiu falta de estudar a respeito de algum agente causador de doenças respiratórias? Tenho a certeza de que você deve estar se perguntando o seguinte: em que momento seria abordado o vírus Sars-Cov-2, responsável pela pandemia da Covid-19? A doen- ça, que foi, inicialmente, descrita em Wuhan, na China, ainda, não possui a origem elucidada, com o primeiro caso confirmado no Brasil em 26 de fevereiro de 2019. Depois disso, a contaminação foi exponencial, e o número de óbitos pela patolo- gia atingiu mais de 600 mil em território nacional (BRASIL, 2022). O vírus tem a capacidade de ligar a porção proteica S da estrutura aos receptores tipoECA-2 presentes em pneumócitos tipo II no pulmão humano, o que promove a entrada do vírus na estrutura celular e a futura replicação (GALLAGHER; BUCHMEIER, 2001). A infecção das células pulmonares pode causar uma síndrome gripal leve, mas a mani- festação mais preocupante é a Síndrome Respi- ratória Aguda Grave, que ocasiona a saturação de oxigênio a níveis inferiores a 93%, taquip- neia, linfopenia e edema alveolar (BAGGIO et al., 2021). Além disso, a doença pulmonar pode gerar fibrose e a formação de microtrom- bos, incluindo sequelas de ordem cardíaca. A severidade da doença está ligada à infecção de células imunológicas e à liberação de altas con- centrações de substâncias pró-inflamatórias, como interleucinas dos tipos 2, 7 e 10, como fator de necrose tumoral, o que atrai mais célu- las imunes para o local da infecção. A presença de leucócitos gera uma lesão inflamatória que modifica a estrutura dos alvéolos, a fim de im- possibilitá-los de realizarem as trocas gasosas necessárias para uma oxigenação satisfatória (CARVALHO et al., 2021). Não nos aprofundaremos nos métodos de tratamento e de diagnóstico da Covid-19 porque você, certamente, estudará, com mais profundidade, o tema na disciplina de Imu- nologia. No entanto, você pode recorrer, rapi- damente, ao seu material de microbiologia se precisar entender questões da fisiopatologia dessa doença, tudo bem? Para o diagnóstico das doenças respiratórias, o cuidado começa na coleta. Para a pesquisa de doenças que acometem o sistema respiratório superior, o material clínico costuma ser a secre- ção da orofaringe, coletada através de swabs. O profissional de coleta deve ser treinado e sensi- bilizado, uma vez que a presença de saliva gera interpretações de resultado duvidosas, por con- ter uma flora bacteriana variada e numerosa. O processo de coleta ocorre de acordo com a Figura 8, seguidos os seguintes passos: • O paciente deve abrir bem a boca, e, ao usar um abaixador de língua, o profissio- nal de coleta realiza esfregaços na amídala e na faringe, sem tocar a ponta do swab estéril na língua, nos dentes ou em outras regiões da cavidade oral. • O profissional deve passar o swab, prefe- rencialmente, em regiões com hiperemia (vermelhidão), placas ou pus, a fim de re- movê-los. • É ideal que sejam coletados menos de dois swabs, que devem ser enviados, imediata- mente, ao laboratório, para uma análise. Ainda, previne-se a secagem do material. • Frente a um impedimento de envio ime- diato, meios de cultura de transporte po- dem ser utilizados para a preservação da amostra por até 24 horas. • Esses materiais são indicados para o diag- nóstico de faringite estreptocócica e de infecções por Mycoplasma pneumoniae. 162 A coleta realizada na nasofaringe, isto é, um material coletado através do nariz, e por um sis- tema que atinge a região da garganta, é ideal para o diagnóstico de coqueluche, de doenças por micoplasmas, ou meningococo (trataremos desse microrganismo nas infecções do sistema nervoso). Amostras obtidas de secreções nasais costumam ser úteis para o diagnóstico de doenças respiratórias superiores causadas por MRSA, ou como um indicativo indireto de pneumonias causadas por esse agente etiológico. Além disso, coletar materiais desses sítios anatômicos auxilia o corpo médico a realizar uma pesquisa de porta- dores do microrganismo (BRASIL, 2010). Descrição da Imagem: na figura, há um desenho de uma coleta de material proveniente da orofaringe. Um indivíduo, com a boca aberta, está desenhado lateralmente, de forma que é possível enxergar a cavidade bucal dele em um plano sagital. Um profissional da saúde, calçando luvas azuis, realiza a coleta. Com a mão esquerda, o profissional segura o abaixador de língua, um objeto em forma de bastão e da cor branca. Com a mão direita, o profissional da saúde realiza a coleta, assim, utiliza um swab, um objeto semelhante a um cotonete de hastes compridas. A ponta do swab atinge o fundo da garganta do indivíduo em um ponto paralelo ao queixo. Figura 8 – Coleta de material da orofaringe. / Fonte: Shutterstock ([2023d], on-line). Para o diagnóstico de tuberculose, ou de pneu- monias, os materiais clínicos podem ser diversos. Para coletas de escarro, além de o profissional da saúde prestar atenção no tratamento da amostra, deve, extensivamente, fazer a instrução ao pacien- te, uma vez que, nesse caso, o indivíduo participa, ativamente, da coleta. É ideal que o escarro esteja livre de saliva (uma vez que esse tipo de material não representa o processo infeccioso), além de coletado no primeiro horário da manhã, com o paciente, ainda, em jejum, após uma escovação dentária sem o uso de cremes, ou pastas dentais. O paciente deve respirar profundamente e forçar a tosse, a fim de transferir o material, diretamente, UNICESUMAR UNIDADE 5 163 para um frasco estéril e de boca larga. No caso de uma pesquisa de micobactérias, deve-se coletar uma amostra por dia, durante três dias (BRASIL, 2000). Materiais, como sangue, lavado brônquico, aspirado traqueal e líquido pleural, podem, também, ser utilizados para pesquisas diretas de microrganismos, para a realização de testes sorológicos e moleculares. O aspirado transtraqueal, coleta realizada por médicos especializados, é o mais indicado para o diagnóstico de pneumonias, uma vez que o procedimento evita a contaminação com o trato respira- tório superior (BRASIL, 2000). O lavado brônquico, ou lavado bronco-alveolar, é o material indicado para o diagnóstico de pneu- monias em pacientes imunossuprimidos, ou submetidos à ventilação mecânica. Nesse material, a contagem microbiana costuma ser alta, por isso, um valor de corte deve ser adotado para diferenciar infecção de colonização (geralmente, superior a 10⁵ UFC/mL) (BRASIL, 2003). Ainda, algumas observações que envolvem a rotina laboratorial podem ser importantes, como: DESTAQUE • A coleta e a cultura devem ser realizadas antes da instituição do tratamento anti- microbiano. • Culturas quantitativas e semiquantitativas podem ser utilizadas, ainda que a primeira aumente a especificidade de diagnósticos nosocomiais. • Resultados negativos para uma cultura de amostras provenientes do trato respi- ratório inferior podem respaldar a descontinuação do tratamento antimicrobiano. Materiais provenientes de orofaringe são os, mais comumente, recebidos no laboratório, para uma pesquisa de patologias associadas ao trato respiratório superior. A rotina mais comum é a semeadu- ra da amostra coletada em ágar chocolate e ágar MacConkey, incubados em uma atmosfera de, no máximo, 5% de gás carbônico. A semeadura do swab é feita por estrias descontínuas, e as placas são incubadas na temperatura de 35-37 ºC e avaliadas, inicialmente, após 18-24 horas. Caso não haja crescimento, podem ser reincubadas, a fim de ser feita uma leitura final em 48 horas. Perante suspeitas de faringites estreptocócicas, a cultura do microrganismo em ágar, ainda, é o padrão ouro (BRASIL, 2010). As amostras podem ser semeadas, diretamente, em ágar sangue, assim, as colônias se apresentam redondas, brancas, com halo de beta hemólise ao redor (Figura 9). 164 Após o crescimento, testes bioquímicos tradi- cionais podem ser realizados para a identifica- ção da bactéria. Cada laboratório costuma adotar uma metodologia, segundo parâmetros e bases de dados oficiais. Reações sorológicas por aglu- tinação, com a utilização da antiestreptolisina O como antígeno, também, podem ser utilizadas como teste, mas só são válidas para o diagnóstico e o suporte de glomerulonefrites difusas e febre reumática, algo contraindicado para faringites agudas. Testes rápidos para uma pesquisa direta do patógeno, também, costumam ter sensibilida- de reduzida, e é comum que resultados positivos para a cultura sejam negativos para testes rápidos, uma vez que a quantidade de antígeno provenien- te da orofaringe pode ser insuficiente para ser Descrição da Imagem: na figura, ametade de uma placa de Petri é apresentada, e contém uma estrutura gelatinosa ao fundo, da cor vermelha, que representa o ágar sangue. Dispersas nesse material, há colônias bacterianas redondas e brancas em estria contínua, e, ao redor delas, é possível observar um galo translúcido que revela a hemólise. Figura 9 – Streptococcus pyogenes em placa com um meio de cultura ágar sangue. / Fonte: Shutterstock ([2023e], on-line). identificado no teste rápido e satisfatória para o crescimento no meio de cultura (BRASIL, 2010). Para os casos de suspeita de difteria, a iden- tificação microbiológica direta da bactéria Cory- nebacterium diphtheriae é difícil, além disso, de- vido ao calendário de vacinação incluir a vacina DTP para a prevenção da patologia, é incomum que laboratórios de rotina disponham de mate- rial específico para a detecção do microrganismo. Mesmo assim, meios de cultura, como o meio de Loeffler, que contém soro coagulado, podem ser utilizados para estimular o crescimento da bactéria e ajudar na revelação dos grânulos meta- cromáticos nos testes bacterioscópicos, como o da coloração de Albert-Laybourn, que revela, na extremidade mais grossa dos bacilos claviformes, UNICESUMAR UNIDADE 5 165 os grânulos em vermelho, incluindo o restante do corpo da bactéria em verde, como na Figura 10. A identificação final da bactéria pode ser realizada por testes enzimáticos, mas os mais indicados são os testes moleculares, como MALDI-TOF, ou PCR (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Descrição da Imagem: na figura, há uma foto de uma lâmina bacterioscópica em microscópio, com um au- mento de 400X. Nela, inúmeras bactérias estão dis- persas na lâmina, e todas contêm uma extremidade arredondada e mais grossa, corada da cor vermelha, bem escura, enquanto o corpo se apresenta bacilar, fino e de coloração verde. Figura 10 – Corynebacterium diphtheriae corada pela técnica de Albert-Laybourn. / Fonte: Trento (2018, p. 10). Além disso, testes toxigênicos devem ser realizados com os isolados, para que possam atestar a presença da toxina diftérica. Há imu- noensaios, como o “Elek test”, que consiste na imunodifusão da toxina em um meio específico, a qual entra em contato com uma antitoxina, e a reação gera uma formação em ponta de lança, que pode ser, facilmente, observada a olho nu (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Para o diagnóstico laboratorial de doenças causadas por micoplasmas e clamídias (gênero Chlamy- dophila), como é de se esperar, devido à complexidade desses agentes, costumam ser utilizadas técnicas sorológicas para atestar a infecção por esses microrganismos, como imunoensaios, ou métodos de fluorescência. A Bordetella pertussis, também, é, raramente, identificada em laboratórios, na rotina comum, devido à dificuldade de se obterem amostras nasofaríngeas sem contaminação por outros microrganismos, e em detrimento da aplicação da vacina com antígenos (BRASIL, 2000). O Haemophilus influenzae, por sua vez, pode ser isolado a partir de materiais clínicos em ágar chocolate. Cresce muito bem nesse meio, mas sem produzir o halo de hemólise. Entretanto, pela alta frequência com a qual aparece colonizando o trato respiratório superior, não deve ser reportado rotineiramente (BRASIL, 2010). A semeadura de swabs de orofaringe ágar Macconkey (com ativos específicos para o crescimento de bactérias Gram negativas) auxilia na triagem de microrganismos, como Klebsiella pneumonia, mas, por ser uma colonizadora momentânea dessa região, é indicado que sejam reportados quando a amostra é proveniente de pacientes imunocomprometidos, ou de solicitação médica (BRASIL, 2010). Para a pesquisa de micobactérias, o laboratório deve estabelecer condições de biossegurança mais robustas, como instalações classificadas com nível de Biossegurança 3, que envolvem Equipamentos de Proteção Individual (EPIs), sala de análise e cabines de fluxo laminar, com a estrutura física do local bem específica e robusta (BRASIL, 2000). Isso não fica só no papel. Lembro-me muito bem de que, na época na qual eu, ainda, estava na graduação, meus professores de microbiologia solicitaram que todos os alunos providenciassem máscaras PFF2 (peça facial filtrante tipo 2) para a realização das aulas práticas de micobactérias. Justificavam que a eficácia de filtração de partículas nos protegeria dos potenciais aerossóis gerados pela manipulação da amostra. 166 A partir da amostra pura, é possível realizar uma coloração de Gram para que, inicialmente, seja feita a avaliação da qualidade do material. O analista deve analisar 10 campos no microscópio e observar a contagem de células epiteliais e o número de neutrófilos, a fim de classificar a amostra de acordo com o Quadro 1. As amostras classificadas como Grupo 5 são satisfatórias para uma semeadura em um meio de cultura e a continuação da análise. Grupos Contagem de células epiteliais Contagem de Leucócitos Grupo 1 ≥25 ≤10 Grupo 2 ≥25 10-25 Grupo 3 ≥25 ≥25 Grupo 4 10-25 ≥25 Grupo 5 <10 ≥25 Quadro 1 – Critérios para uma avaliação da qualidade do escarro. / Fonte: adaptada de Brasil (2010). Na Figura 11, você poderá observar uma lâmina com coloração de Gram realizada com um material adequado. Nela, as células epiteliais não serão observadas, com muco na amostra, com uma aparência de teia de aranha e leucócitos segmentados, neutrófilos e bastonetes. Descrição da Imagem: na figura, há uma foto de uma lâmina de microscópio com um aumento de 100X. Nela, podem ser observados filamentos mucosos da cor rosa, dispostos de forma que lembram os fios de uma teia de aranha. Inúmeros leucócitos estão dispersos na figura, na forma de células circulares de coloração rosa, bem clara, e núcleo, fortemente, corado de rosa. Os neutrófilos possuem dois núcleos, ou mais. Os linfócitos possuem um único núcleo arredondado. Por fim, os bastonetes têm um núcleo em forma de bastão. É possível observar um linfócito na extremidade direita inferior da figura, e um bastonete na extremidade direita superior. Figura 11 – Coloração de Gram em esfregaço a partir de escarro. / Fonte: Shutterstock ([2023f], on-line).. UNICESUMAR UNIDADE 5 167 Para o diagnóstico de tuberculoses, a amostra pode ser submetida à coloração de Ziehl-Neelsen. Ain- da, o analista laboratorial realiza a contagem dos BAAR (Bacilos Álcool-Ácido Resistentes) existentes na lâmina. A quantidade de campos a ser analisada depende, diretamente, da quantidade de BAAR contados em cada observação. A interpretação dos resultados é feita a partir da metodologia aplicada na rotina laboratorial, mas, no Quadro 2, será elencada uma sugestão (BRASIL, 2000): Número de BAAR contados em objetiva de 100X Resultado 0 Negativo 1 a 2 BAAR em 30 campos Recomenda-se repetir a coloração 1-9 BAAR em 100 campos + (raros) 1-9 BAAR em 10 campos ++ (alguns) 1-9 BAAR por campo +++ (frequentes) mais de 9 BAAR por campo ++++ (numersos) Quadro 2 – Interpretação de resultados de pesquisa de BAAR em microscopia. / Fonte: adaptado de Brasil (2000). A especificidade do método pode, porém, ser reduzida em função da possível presença de outros microrganismos que se coram, também, durante o processo, como os gêneros Nocardia spp e Rhodo- coccus spp. Além disso, é importante que se realizem um controle negativo (com a utilização de uma cepa de Escherichia coli) e um controle positivo (com a utilização de uma cepa de Mycobacterium tuberculosis) do processo. A semeadura em um meio de cultura sólido é importante para os passos seguintes da identificação de micobactérias, de forma que a amostra preparada é semeada (0,5 a 1,0 mL) em ágar Lowenstein-Jensen, um meio de cultivo complexo, com a adição de glicerol, lipídeos e ovos integrais (fontes de carbono e nitrogênio); composto verde malaquita, que é responsável por inibir o crescimento; e bactéria Gram positivas. A amostra semeada é incubada, então, a 37°C, no escuro, em uma atmosfera de 5-10% de gás carbônico, e a leitura deve ocorrer de sete em sete dias, a fimde totalizar oito semanas de incubação. As colônias de M. tuberculosis possuem aspecto granular, são ásperas, rugosas, e, levemente, amareladas, conforme Figura 12. 168 Métodos automatizados, como o BD Bactec MGIT 960, utiliza meios líquidos de enriqueci- mento (caldo Middlebrook 7H9) em frascos es- pecíficos, incluindo um inóculo da amostra que é submetida à incubação direta no equipamento, e por cerca de seis semanas. Ao longo do tempo, o equipamento realiza leituras simultâneas, baseado na produção de gases gerados pelo metabolismo bacteriano, e, em casos de presença da bactéria, o equipamento emite sinais que avisam, ao analista, a condição da amostra. Análises moleculares por PCR podem ser úteis e mais rápidas do que a pesquisa microbiológica tradicional. Um método em um sistema fechado, denominado de Xpert Descrição da Imagem: na figura, há uma foto de um indivíduo calçando luvas de látex brancas e segurando, na mão esquerda dele, um frasco de estrutura cilíndrica, transparente e de tampa dourada. No interior do frasco, há uma substância gelatinosa verde, clara, que representa o ágar Lowenstein-Jensen. Dispersas na superfície do ágar, existem colônias arredondadas da cor amarela que representam a bactéria Mycobacterium tuberculosis. No fundo da figura, é possível ver uma estante para tubos de ensaio, de metal e da cor branca, com 18 tubos semelhantes ao descrito, dispostos em quatro fileiras. Figura 12 – Semeadura de M. tuberculosis em ágar Lowenstein-Jensen. / Fonte: Shutterstock ([2023g], on-line). MTB/ RIF, tem sido aplicado, a fim de realizar a detecção do microrganismo em um período inferior a duas horas (BRASIL, 2010). Para uma pesquisa de patógenos causadores de pneumonia, é recomendado que a amostra recebida seja semeada em ágar de especificidade e constituintes nutricionais variados. A depender da quantidade de material clínico recebido, as amostras devem ser semeadas em ágar sangue, ágar MacConkey, ágar chocolate, e, no caso de suspeita de pneumonia por Legionella pneu- mophila, a utilização de ágar específico, como o ágar BCYE (do inglês, Buffered Charcoal Yeast Extract), é uma boa prática, ainda que métodos UNICESUMAR UNIDADE 5 169 de imunofluorescência, com anticorpos mo- noclonais, sejam mais indicados para a detecção dos microrganismos causadores de pneumonias (BRASIL, 2010). Apesar dos progressos que envolvem o en- tendimento de doenças, de diagnósticos e de terapia, as doenças respiratórias, sobretudo, as pneumonias, ainda, são uma causa importante e frequente de morte. Além disso, a grande parte de patologias que estudamos neste material pode conferir consequências crônicas à saúde, a fim de envolver órgãos vitais do corpo, como coração, rins e sistema nervoso, ao demonstrar que o conhecimento desse assunto é de suma impor- tância para a atuação de um profissional de saúde completo. Como no caso da Doença dos Legionários, que estudamos anteriormente, podemos destacar três desses fatores de risco: população vulnerável, por se tratarem de idosos; reservatório potencial (água do ar-condicionado) sem o devido cuidado; e bactéria causadora de um grande poder viru- lento. Agora, pare e pense: existem mais situações nas quais as mesmas condições podem ser ofe- recidas? Para isso, faça o seguinte exercício: liste as instituições da sua cidade que podem estar associadas a serviços de saúde, ou não, as quais, eventualmente, combinam esses fatores de risco em, apenas, um local. Que lugares você incluiria? Mais do que isso, que medidas de cuidado podem ser aplicadas para prevenir doenças respiratórias nesses locais citados? Para responder questionamentos relevantes, o conhecimento de infecções respiratórias vai além da sua função dentro do laboratório. Observar as contribuições pertinentes do ambiente, uma situação tão elementar, já é essencial para uma avaliação de risco frente a um patógeno. Por fim, o treinamento e as habilidades de manuseio e de análise da amostra conferem uma grande impor- tância ao profissional analista quando os fatores de risco não podem ser tratados. 170 Chegou a hora de revisar! Use o Mapa Mental a seguir para as suas anotações. Utilize os campos como guia para facilitar a sua revisão e anote tudo aquilo que achar importante para a memorização do conteúdo. MICROBIOLOGIA DO TRATO RESPIRATÓRIO Trato respiratório superior Trato Respiratório Inferior Fatores de risco associados Tipos de amostras para diagnóstico FARINGE ESTREPTOCÓCICA: Agente etiológico e fatores de virulência TUBERCULOSE: Agente etiológico e fatores de virulência PNEUMONIAS: Agente etiológico e fatores de virulência DIFTERIA: Agente etiológico e fatores de virulência LARINGITES E BRONQUITES: Agente etiológico e fatores de virulência 171 1. Os mecanismos de patogenicidade das faringites estreptocócicas são bem elucidados e difun- didos no meio médico. Com relação às principais complicações sistêmicas associadas a essa patologia, assinale a alternativa verdadeira: a) As complicações neurais e oculares são comuns após infecções sistêmicas por Streptococcus pyogenes. b) A ocorrência de febre reumática e de glomerulonefrite são patologias associadas a faringites estreptocócicas. c) Doenças de ordem gastrointestinal são comuns após faringites estreptocócicas. d) Pneumonia por Streptococcus pneumoniae é uma sequela comum após faringites estrepto- cócicas. e) Não existem doenças pós-faringite estreptocócica relatadas na literatura. 2. Assinale a alternativa que contém os causadores da difteria e da coqueluche, respectivamente: a) Streptococcus pyogenes e Corynebacterium diphtheriae. b) Bordetella pertussis e Corynebacterium diphtheriae. c) Corynebacterium diphtheriae e Bordetella pertussis. d) Bordetella pertussis e Streptococcus pyogenes. e) Bordetella pertussis e Streptococcus pneumoniae. 3. Assinale a alternativa que contém os critérios corretos para diagnósticos, em microbiologia, para o Mycobacterium tuberculosis: a) Laboratório de nível de biossegurança 3 ou 4; uso de Equipamentos de Proteção Individual (EPIs) mais robustos, como máscaras de alto potencial de filtração; treinamento dos analistas quanto aos riscos de contaminação e de preparo da amostra; verificação da qualidade do escarro fornecido como amostra; e disposição de meios de cultura, como ágar Lowenstein- -Jensen, para incubações superiores a sete dias. b) Laboratório de nível de biossegurança 3 ou 4; uso de Equipamentos de Proteção Individual (EPIs) usuais, como máscaras duplas e descartáveis; treinamento dos analistas quanto aos riscos de contaminação e de preparo da amostra; verificação da qualidade do escarro for- necido como amostra; e disposição de meios de cultura, como ágar Bordet-Gengou, para incubações superiores a sete dias. c) Laboratório de nível de biossegurança 2 ou 4; uso de Equipamentos de Proteção Individual (EPIs) mais robustos, como máscaras de alto potencial de filtração; treinamento dos analistas quanto aos riscos de contaminação e de preparo da amostra; verificação da qualidade do escarro fornecido como amostra; e disposição de meios de cultura pouco nutritivos para períodos de incubação curtos. 172 d) Laboratório de nível de biossegurança 2 ou 3; uso de Equipamentos de Proteção Individual (EPIs) mais robustos, como máscaras de alto potencial de filtração; treinamento dos analistas quanto aos riscos de contaminação e de preparo da amostra; e disposição de meios de cultura pouco nutritivos para períodos de incubação curtos. e) Laboratório de nível de biossegurança 2 ou 3; uso de Equipamentos de Proteção Individual (EPIs) usuais, como máscaras duplas e descartáveis; treinamento dos analistas quanto aos riscos de contaminação e de preparo da amostra; e disposição de meios de cultura pouco nutritivos para períodos de incubação longos. 6 Neste capítulo, você terá a oportunidade de aprender mais a res- peito dos tecidoscardíaco e neural e das relações deles com as doenças bacterianas. Você será capaz de entender que meios os microrganismos utilizam para acessar esses sistemas e as conse- quências de doenças infecciosas em sítios anatômicos tão vitais. Como futuro analista, você, também, estudará os principais métodos de diagnóstico e as particularidades em relação ao material clínico aplicado para a triagem de determinada patologia. Aspectos Clínicos, Epidemiológicos e Laboratoriais de Infecções Bacterianas de SNC e Sistema Sanguíneo. Me. Suelen Eloise Simoni 174 Conhecida a estrutura procariótica das bactérias, e sabido que, fundamentalmente, elas são despro- vidas de um grande maquinário celular, acompa- nhe a frase a seguir, retirada de uma reportagem: “Os pesquisadores concluíram que essa criatura, apesar de não ter um sistema nervoso central, é capaz de “aprender” com experiências e mudar de comportamento, de acordo com elas” (BLOB, 2019, on-line). Se disséssemos que essa criatura, que é capaz de memorizar e de solucionar labi- rintos, é uma bactéria, faria sentido com tudo o que você já aprendeu a respeito do tema? É, praticamente, impossível que tal função fosse desempenhada por uma bactéria, não é mesmo?! No entanto, por mais que as diferen- ças entre seres humanos e microrganismos seja grande, a natureza, sempre, lança mão de alguns truques que possam refutar essa condição. Isso ocorre pois a presença de sistemas complexos, como o nervoso e o cardíaco, contribui para a sobrevivência e a perpetuação da espécie huma- na, motivo que é, essencialmente, a razão para que organismos evoluam de maneira semelhante. Por mais que um sistema, altamente, funcio- nal, composto por inúmeras células, não seja, to- talmente, desenvolvido em alguns organismos, dezenas de habilidades são aprimoradas por eles, os quais mimetizam essas propriedades especiais de sobrevivência que possuímos. Em diversas si- tuações, como na da criatura descrita anterior- mente, isso é feito com sucesso, entretanto, nos casos nos quais essa adaptação não é possível, vários microrganismos utilizam fatores de viru- lência e o nosso maquinário vital para a própria sobrevivência, com a presença do parasitismo e de desdobramentos patológicos importantes. Convidamos você, agora, para ler a respeito dessa misteriosa criatura, e entender como a na- tureza é incrível e tem maneiras extraordinárias de se sobressair frente a desafios que aparecem. Leia a matéria completa do “Blob”, fungo curioso e protagonista desde o início do estudo, através do QRCode. Depois, reflita: quais são os siste- mas apresentados pela criatura que “imitam” a fisiologia humana? UNICESUMAR UNIDADE 6 175 Depois da leitura, é possível que alguns questionamentos ocorram, prin- cipalmente, aqueles relacionados ao potencial patogênico do Blob, pelo fato de ele ser um fungo muito habilidoso, no entanto, não é preciso se preocupar. Até o momento, é considerado, praticamente, uma ameba de vida livre, que tem preferência por locais de alta umidade e ausência de luz. No entanto, é sabido que algumas bactérias, mesmo sem ter a organização fantástica do Blob, possuem capacidade de desencadear processos clínicos notórios no organismo humano. Ao pensar nisso, pense um pouco nas seguintes questões: • Quais seriam os maiores pontos de vulnerabilidade nos sistemas complexos, como o nervoso e o circulatório, relacionados à suscetibilidade deles aos patógenos? • Quais seriam as principais habilidades importantes para que os procariontes afetem tais sistemas? https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/18717 176 Nesta unidade, dedicar-nos-emos ao estudo de dois sistemas vitais para a fisiologia humana: o circu- latório e o nervoso. Assim como qualquer organização do nosso corpo, os sistemas cardíaco e vascular dependem, diretamente, do conjunto de células nervosas para desempenhar algumas funções, mas devemos estudá-los separadamente, para facilitar o nosso processo de aprendizado. Partiremos para o sistema circulatório, responsável pela distribuição de oxigênio e de nutrien- tes para o organismo, principal meio de transporte para hormônios, enzimas, medicamentos, células imunes e microrganismos. Também, conhecido como sistema cardiovascular, o componente circulatório é formado por três itens principais: o sangue, o coração e os vasos sanguíneos. Dentre as estruturas mais relevantes para o estudo das infecções desse sistema, destacam-se as camadas cardíacas, como epicárdio, miocárdio e endocárdio, localizadas dentro do saco pericárdico e dispostas nessa ordem, de fora para dentro. Ainda, há o sangue, composto por plasma (água, sais e fatores de coagulação) e por uma parte sólida, formada por hemácias, leucócitos e plaquetas (BLACK; BLACK, 2021). É importantíssimo que você, aluno (a), atente-se às localizações das três camadas mais internas do coração, afinal, as doenças bacterianas que o acometem são denominadas de acordo com o local da infecção: endocardite e miocardite. Já estudamos um tipo de miocardite, decorrente de uma infecção bacteriana de vias respiratórias superiores, mas você se recorda dela? Trata-se da febre reumática, causada pelo ataque de com- ponentes imunes do nosso próprio sistema às células do miocárdio, que possuem um revestimento molecular muito semelhante ao da proteína M, presente na superfície do Streptococcus pyogenes. Como você já observou, e muito, esse microrganismo anteriormente, não o analisaremos a fundo neste material, mas recomendamos que você mantenha viva essa memória, ao adicioná-la ao Mapa Mental, no fim do estudo. O sistema cardiovascular não possui microbiota normal, por isso, é considerado estéril. Em uma situação de invasões na corrente sanguínea, por bactérias, essa condição é chamada de bacteremia. Se o sistema imune falha e não combate a presença desse microrganismo, a condição pode evoluir para septicemia, o que ocasiona um verdadeiro envenenamento do sangue. A entrada de agentes infecciosos pode acontecer através de ferimentos na pele e nos focos purulentos, como abcessos e placas (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). As septicemias podem ser causadas por uma variedade de microrganismos, como Staphylococcus au- reus, Streptococcus pneumoniae, espécies de Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Enterobacter e Serratia. A presença de bactérias na corrente sanguínea coloca o indivíduo em risco de choque séptico, caracterizado pelo colapso dos vasos e pela baixa pressão arterial. O principal mecanismo de patogenicidade exibido pelas bactérias, nesse caso, é a liberação de endotoxinas. Por essa razão, a ocorrência de septicemias, seguidas por choque séptico, são muito associadas aos Gram negativos. Os UNICESUMAR UNIDADE 6 177 sintomas costumam envolver febre alta, inflamação dos vasos linfáticos, ou linfangite, com a revelação de manchas avermelhadas na pele (Figura 1). Por fim, há falência circulatória, condição que pode, facilmente, levar o indivíduo a óbito (BLACK; BLACK, 2021). Descrição da Imagem: na figura, há uma foto de um indivíduo na qual a câmera foca, apenas, no antebraço direito, com o cotovelo indicado para baixo. Na parte interna do membro, em sentido horizontal, é possível observar um rash cutâneo e avermelhado em formato de faixa, o que caracteriza a manifestação clínica típica de linfangite. Figura 1 – Paciente com apresentação típica de linfangite. / Fonte: Murray, Rosenthal e Pfaller (2021, p. 679). Sabe-se, também, que a bacteremia, seguida de sepse, normalmente, ocorre em pacientes hospita- lizados, e o período de incubação dos microrganismos é muito menor, visto que a presença deles, na corrente sanguínea, facilita o acesso a diversos tecidos e sistemas. É comum que sintomas de sepse se iniciem após procedimentos médicos invasivos, o que indica uma possível infecção hospitalar. É possível notar características epidemiológicas nacionais importantes em relação à sepse, como a morte de até cinquenta mil pessoas por ano, umadistribuição de ocorrência similar entre homens e mulheres, e a população idosa como a mais vulnerável (ALMEIDA et al., 2022). Alguns quadros de sepse podem atingir crianças e neonatos, como no caso do desencadeado pela presença do Streptococcus agalactiae, um estreptococo do grupo B, beta hemolítico, e que possui, na membrana celular, uma proteína de superfície, chamada de antígeno C. O principal fator de virulência da bactéria é a presença da cápsula polissacarídica, que dificulta a fagocitose. Ao mesmo tempo, essa estrutura permite a produção de anticorpos de memória, fato que se relaciona, diretamente, a uma maior predominância de sepse em bebês, uma vez que o sistema imune deles é imaturo (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). 178 A bactéria faz parte da microbiota normal da vagina, o que facilita a infecção do bebê previa- mente, ou durante o parto. A prática de profi- laxia antimicrobiana, nesse caso, pode ser indi- cada, principalmente, se atestado que a gestante possui colonização pelo S. agalactiae. O trata- mento imediato, à base de penicilinas, também, contribui para uma redução da mortalidade de recém-nascidos por sepse, uma vez que os sin- tomas, como febre e desconforto respiratório, são sinais de alerta ao corpo médico, assim, me- didas farmacológicas e não farmacológicas de contenção são tomadas rapidamente (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). O diagnóstico de doenças causadas pelo S. aga- lactiae envolve a detecção do antígeno de superfí- cie em exames genitais de gestantes; testes de reação da polimerase nas mesmas amostras, e cultura em meios nutritivos, a partir do sangue de indivíduos nos quais há a suspeita de doença causada pelo mi- crorganismo (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). O Enterococcus faecium e o Enterococcus faecalis, também, são cocos Gram positivos e catalase negativa, assim como o S. agalactiae, e são associados a septicemias, devido à liberação de exotoxinas, uma vez que atingem a corrente sanguínea. Além disso, os componentes do grupo dos enterococos são conhecidos por exibir uma grande resistência aos antimicrobianos usuais e aos de amplo espectro, como a vancomicina. Dessa maneira, pacientes imunossuprimidos são os indivíduos mais acometidos por esse grupo (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). As infecções cardíacas, por sua vez, podem ser divididas em endocardite e miocardite. A endocardite é a infecção da parede mais interna do coração, local atingido a partir da corrente sanguínea, e a principal característica patológica tecidual dessa doença é a deposição de fibrina nas válvulas cardíacas (Figura 2), às quais as bactérias se aderem, com a formação de uma grande massa (também, chamada de vege- tação), responsável por deformar as válvulas e diminuir a flexibilidade delas, a fim de tornar o bombeamento entre átrios e ventrículos menos eficiente (BLACK; BLACK, 2021). UNICESUMAR UNIDADE 6 179 A insuficiência cardíaca congestiva é uma das consequências mais comuns da endocardite, carac- terizada, clinicamente, pela redução dos batimen- tos e pela força de contração cardíaca provoca- da pelo acúmulo de fluidos ao redor do coração (BLACK; BLACK, 2021). A forma subaguda da doença (com um desenvolvimento mais lento) pode ser causada por bactérias presentes na microbiota normal, mas que invadem a corrente sanguínea, devido a feridas em procedimentos invasivos, como tratamentos dentários. Dentre elas, alguns estrep- tococos alfa hemolíticos, espécies de enterococos e estafilococos podem estar envolvidos. Na forma aguda e mais agressiva, a patologia costuma ter, como agente etiológico, o Staphy- Aparência normal Vegetações de fibrina-plaqueta Descrição da Imagem: na figura, há uma foto de um coração humano real, visto internamente, com uma característica macroscópica (coloração e textura) preservada. A parte doente do órgão está na válvula cardíaca, na parte central da figura, na qual os nódulos disformes, de aspecto rugoso e corados de vermelho e amarelo, são indicados por três traços pretos e pela escrita “vegetações de fibrina-plaqueta”, em inglês. A parte saudável é indicada por dois traços pretos e pela escrita “aparência” normal, em inglês, e, nesse ponto, o tecido se apresenta avermelhado, liso e brilhante. Figura 2 – Coração com deposição de fibrina em válvulas cardíacas. / Fonte: Tortora, Funke e Case (2019, p. 681). lococcus aureus, que, se não combatido, pode levar o indivíduo acometido a óbito em poucos dias (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Dentre os fatores de virulência, a presença da cápsula, na bactéria, impede a fagocitose; a proteína A, de superfície, bloqueia a ligação de anticorpos à bactéria; e a produção de enzimas (coagulase, hialuronidase) interfere na coagulação sanguínea e realiza a hidrólise do tecido conectivo (MUR- RAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). O diagnóstico da doença é uma associação dos sinais clínicos e laboratoriais encontra- dos em exames de hemoculturas, tratados, mais adiante, neste material. O tratamento dos pacien- tes com endocardite consiste na administração 180 de antimicrobianos apropriados e definidos após testes de sensibilidade microbiana. Além disso, não é incomum que seja necessária a substituição de válvulas cardíacas naqueles indivíduos com a mani- festação da doença mais severa (BLACK; BLACK; 2021). A miocardite, por sua vez, é a inflamação do miocárdio, e, na maioria dos casos, o causador é o S. aureus. Evolui, facilmente, para a pericardite (inflamação do pericárdio, a membrana que reveste o coração). O índice de mortalidade para miocardites e pericardites é próximo de 100% em pacientes não tratados, o que torna essas patologias de importância médica, principalmente, em ambiente hospitalar. O diagnóstico, também, pode ser feito através de sinais laboratoriais, obtidos a partir de hemocultura, e a escolha do tratamento se dá de forma semelhante à das endocardites (BLACK; BLACK, 2021). De forma indireta, bacteremias podem ser determinantes para a ocorrência de doenças que acome- tem outros sistemas, como o respiratório, em situações nas quais amostras sanguíneas contaminadas não são destinadas para um tratamento adequado, ou quando tecidos contaminados ficam expostos em um ambiente. É o caso do Bacillus anthracis, o causador do antraz. O bacilo Gram positivo tem, na forma respiratória, o maior potencial patogênico, o qual só é possível de acontecer quando esporos do microrganismo ficam livres para ser inalados. Sabe-se que, quando presente na corrente sanguínea, a bactéria não está na forma esporulada, no entanto, ela, rapidamente, esporula se exposta no ar-am- biente, como no caso de carcaças de animais infectados que podem contaminar o solo. O grande agravante é que os esporos do B. anthracis ficam viáveis por até 60 anos (BLACK; BLACK, 2021). A peste bubônica, ou praga (também, chamada de peste negra, em decorrência de feridas escuras na pele, característica visual chamativa dessa doença), é causada pelo bacilo Gram negativo Yersinia pestis, produtora de enzimas que enfraquecem o sistema imune por evadir da resposta inflamatória, escapar da fagocitose. A pandemia de peste bubônica atingiu todo o continente europeu entre 1347 e 1353, e apresentou, ao mundo, os perigos de uma doença bacteriana desconhecida e, quase sempre, fatal (BLACK; BLACK, 2021). A peste conhecida na Europa como Black death UNICESUMAR UNIDADE 6 181 É uma zoonose, e o homem e os ratos são os principais acometidos pela doença, que é transmitida pela picada da pulga Xenopsylla cheopis infectada. O efeito patogênico, no inseto, dá-se pela multipli- cação excessiva da bactéria, seguida pela formação de uma obstrução no trato digestório do inseto, fato que faz com que ele tenha necessidade imediata de se alimentar. Através das picadas, ele faz uma “refeição”. No entanto, regurgita, rapidamente, o conteúdo sanguíneo sugado, pois contém uma grande concentração de Y.pestis na composição. Isso faz com que a bactéria tenha mais facilidadepara invadir a corrente sanguínea (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). A bactéria se direciona, então, para o sistema linfático humano, no qual parasita células imunes e se internaliza nos macrófagos. O período de incubação é de cerca de três dias, e os primeiros sinais da doença são dores no corpo, cefaleia e cansaço. Entretanto, a resistência à destruição imunológica e a produção de endotoxina, exibidas pela bactéria, tornam-na capaz de causar linfedema, febre e bubões doloridos (lesões de grande inchaço), formados por uma massa de gânglios linfáticos e ricos em conteúdo bacteriano. O enegrecimento de extremidades, como dedos das mãos e dos pés, também, é uma característica marcante da doença (Figura 3). Ainda, fígado, rins, baço e sistema nervoso podem ser acometidos, e se a doença não é identificada e tratada, a evolução dos sintomas é muito prejudicial, a fim de comprometer múltiplos órgãos e poder ocasionar o choque tóxico. A doença, mais uma vez, possui uma manifestação respiratória, chamada de forma pneumônica, a qual pode ser desenvolvida a partir de septicemia, ou inalação da bactéria (BRASIL, 2008). Descrição da Imagem: na figura, há a foto da mão direita de um indivíduo, com a palma virada para cima e com os dedos, levemente, dobrados, de forma que a ponta dos dedos encontra o centro da palma da mão. Há uma grande lesão, de aspecto endurecido e de coloração preta e escura, que vai da região do punho até a ponta dos dedos, e acomete, inclusive, as unhas. Figura 3 – Lesão de extremidade característica da peste bubônica. Fonte: Tortora, Funke e Case (2019, p. 687). No Brasil, os principais focos das pes- tes bubônicas animal e humana estão no Nordeste, norte de Minas Gerais e Rio de Janeiro. Essas regiões são passíveis de transmissão, em detrimento das condições ambientais, como temperatura, umidade, vegetação e fauna. O diagnóstico precoce é imprescindível, pois auxilia no tratamento adequado do paciente, mas, também, norteia as equipes epidemiológicas locais quanto a riscos de epidemias e a condutas tomadas como medidas de contenção. 182 O diagnóstico bacteriológico é possível ao se utilizar, principalmente, o exsudato, proveniente dos bubões, realizada, com ele, uma bacterioscopia (utilização de uma coloração azul de metileno), uma semeadura em ágar, sangue, com uma confirmação pelo teste do bacteriófago, que consiste em se colocar a colônia suspeita em contato com o vírus. No caso de inibição de crescimento a partir de uma incubação a 28°C, o teste é considerado positivo para Y. pestis. O diagnóstico, também, pode ser feito a partir da hemocultura, e, quando verificada a bacteremia, o prognóstico da doença costuma ser ruim (BRASIL, 2008). Doenças bacterianas transmitidas por picadas de carrapatos, também, não são desconhecidas, de maneira que os distúrbios causados por espécies de riquétsias foram descritos há muito tempo. Essas bactérias são cocobacilos Gram negativos, muito pequenos, e intracelulares obrigatórios. Sobrevivem no interior de macrófagos por destruir os fagossomas dessas células, por meio de fosfolipases, com o impedimento da degradação. A causadora da febre maculosa das montanhas rochosas, Rickettsia rickettsii (Figura 4), possui estruturas celulares que representam bem esse grupo (MURRAY; RO- SENTHAL; PFALLER, 2021). Descrição da Imagem: na figura, há uma foto de uma lâmina microscópica de fundo branco e em aumento de 400. No centro, há uma célula arredondada, de núcleo roxo e citoplasma translúcido, delimitada com uma fina membrana. Dispersas na célula, são observadas bactérias em forma de bastonetes e da cor rosa, de forma intracelular. No fundo, a imagem possui alguns borrões escuros que não impedem a visualização da célula. Figura 4 – Rickettsia spp com a infecção de uma célula humana. / Fonte: Murray, Rosenthal e Pfaller (2021, p. 345). UNICESUMAR UNIDADE 6 183 Os principais fatores de virulência que en- volvem esse gênero são a presença de proteína A na membrana, que é responsável por aderir bactérias às células endoteliais; e a destruição do fagossoma, o que permite a replicação bacteriana no interior da célula. A ação bacteriana ocasiona lesão celular e perfuração do endotélio circu- latório, o que pode gerar hipovolemia e hipo- proteinemia pela perda sanguínea (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Uma doença, denominada de tifo, é causada por uma riquétsia que cresce, apenas, no cito- plasma da célula, e inclui uma variedade de for- mas. Os tifos epidêmico e endêmico (murino) são os mais conhecidos. O tipo epidêmico, ou clássico, tem, como agente etiológico, a bactéria Rickettsia prowazekii, transmitida por piolhos. As fezes deles, através da abrasão, causada quan- do o indivíduo se coça, permitem que a bactéria tenha contato com o sistema sanguíneo, o que desencadeia febre, cefaleia e exantema de tronco. O tifo endêmico, causado pela Rickettsia typhi, e transmitido pela picada de pulgas, tem uma baixa mortalidade e é autolimitado, de manei- ra que os sintomas de febre, calafrios e cefaleia finalizam em cerca de duas semanas (BLACK; BLACK, 2021). Semelhante ao tifo epidêmico, em relação à forma de transmissão, a febre das trincheiras, também, é uma doença causadora de bactere- mias, e tem, como agente etiológico, a bactéria Bartonella spp, observada, pela primeira vez, na Primeira Guerra Mundial, em soldados que dividiam as mesmas roupas (impregnadas com inúmeros piolhos). Os sintomas envolvem fe- bres altas, dores intensas nas pernas e, até mesmo, confusão mental. O gênero, também, é respon- sável por causar a bartonelose (especificamen- te, a espécie B. bacilliformis), transmitida por flebotomíneos (um tipo de mosquito, causador, também, da Leishmaniose). Tem, como principal característica, a ocorrência de anemia hemolíti- ca em indivíduos imunocomprometidos infecta- dos (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). O diagnóstico de doenças causadas por riquét- sias costuma ser clínico e através de testes sorológi- cos, uma vez que o cultivo desses microrganismos, em um laboratório, é muito caro, com a necessida- de de ovos embrionados. Ainda, é, extremamente, perigoso, devido à alta patogenia de todas as espé- cies. O tratamento das patologias pode ser feito através da administração de antimicrobianos, como tetraciclina e cloranfenicol, no entanto, essas subs- tâncias, apenas, inibem a proliferação das bactérias. Por conta disso, a terapia costuma ser prolongada, e por tempo indeterminado, ao menos, até o mo- mento em que o corpo reúne forças para superar a infecção (BLACK, BLACK, 2021). A doença de Lyme, que tem, como agente etiológico, a espiroqueta Borrelia burgdorferi, também, é uma zoonose de importância mé- dica, transmitida pela picada de um carrapato. Um traço epidemiológico interessante dessa patologia é que a incidência aumentou, devido a modificações do ecossistema, isso porque os cervos-de-cauda-branca, animais que são reser- vatórios da bactéria, deixaram de ser caçados após a colonização inglesa do território norte- -americano, e, com o aumento dos reservató- rios, a doença, naturalmente, teve a ocorrência aumentada entre os humanos. Em todos os casos, no local da picada, é possível observar um exantema em forma de olho de touro, mas os piores desdobramentos, certamente, são as ocorrências de artrite e perda de mielina, que reveste as células nervosas, com sintomas semelhantes aos da doença de Alzheimer e da esclerose múltipla (BLACK; BLACK, 2021). 184 A brucelose, ou febre ondulante, zoonose causada por espécies da bactéria Brucella spp, não é trans- mitida pela mordedura de animais, no entanto, quando o indivíduo consome leite contaminado, ou inspira bioaerossóis que contêm a bactéria, pode ter o sistema circulatório dele invadido. A bacteremia ocasiona a formação de granulomas no sistema reticuloendotelial. Além disso, ciclos diários de febre alta durante a tarde, e baixa durante a noite, podem ocorrer devidoà liberação da bactéria pelos granulomas. Ainda, por ser importante, é uma doença de sintomas inespecíficos, a fim de acometer baço, fígado e linfonodos, contudo, é, potencialmente, passível de ser utilizada como uma arma biológica, devido ao potencial patogênico (BLACK; BLACK, 2021). As espécies B. abortus, B. melitensis, B. suis e B. canis são as mais conhecidas e de importâncias veterinária e humana. Esse bacilo Gram negativo pode ser identificado em um ambiente microbiológi- co, a partir de amostras de hemocultura, aspirado do fígado, do baço e do Líquido Céfalo Raquidiano (LCR). É considerado fastidioso (de crescimento dificultado e com altas exigências nutricionais) e se difere de outros microrganismos, como Bordetella spp, Acinetobacter spp e Moraxella spp, por provas bioquímicas, como crescimento em ágar Mac Conkey e prova da motilidade com resultado negativo. No entanto, a caracterização laboratorial desse microrganismo é dificultada, assim, necessita de estrutura física e analistas muito treinados para essa atividade (BRASIL, 2013). Como exemplo de doença que, também, é gerada por transtornos circulatórios, temos a gangrena, situação na qual o fornecimento de sangue é interrompido (isquemia) em decorrência de alguma lesão, ou ferida na pele. Esse processo pode ser acelerado por microrganismos anaeróbios, os quais contribuem para a necrose e a morte tecidual. Dentre eles, destaca-se o Clostridium perfringens, que, ao utilizar as substâncias presentes na lesão (como carboidratos), produz um gás que inflama ainda mais o tecido. Ainda, o microrganismo produz toxinas que consomem as células do local e degradam o colágeno, com a criação de um ambiente propício para a proliferação de mais bactérias. A dissemi- nação bacteriana, fatalmente, influencia na invasão desses organismos na corrente sanguínea, a fim de causar bacteremia e septicemia. O tratamento mais comum é a amputação, ou câmaras hiperbáricas, principalmente, se a lesão está presente em locais de armazenamento, ou de proteção de órgãos vitais (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). UNICESUMAR UNIDADE 6 185 É claro que existem mais condições cardíacas e vasculares causadas pelo vírus, como o Ebola, que interrompe a cadeia de coagulação sanguínea; ou protozoários, como o Trypanosoma cruzi. São diag- nosticadas, em sua maioria, por testes sorológicos e parasitológicos, mas elas serão, profundamente, abordadas em disciplinas, como Imunologia e Parasitologia. Fica evidente que, quando sistemas mais complexos são acometidos por infecções, o manejo do pa- ciente e as decisões médicas devem ser mais urgentes, não é mesmo?! Ao se estudarem as infecções do sistema nervoso central, essa afirmativa se torna, ainda mais, real, uma vez que o acometimento desse componente fisiológico interfere em, praticamente, todo o organismo humano. O Sistema Nervoso (SN) (Figura 5) é um conjunto de neurônios e células nervosas que trabalha em sintonia para o controle de funções corporais, como respiração, digestão e batimento cardíaco. Ele é composto pelo Sistema Nervoso Central (SNC) e pelo Sistema Nervoso Periférico (SNP). O SNC é constituído por encéfalo e medula espinhal, os quais são protegidos pelas meninges (membranas de tecido conjuntivo), as quais abrigam o LCR. O SNP é formado por nervos que se comunicam com o SNC através de sinais elétricos, formados por fibras nervosas, organizadas em gânglios, os quais são responsáveis pela transmissão sensorial (BLACK; BLACK, 2021). Cérebro Medula espinhal Sistema nervoso central (SNC) Sistema nervoso periférico (SNP) Descrição da Imagem: na figura, há um desenho de um corpo humano masculino em um plano coronal. É possível observar os ossos da pelve e o início dos fêmures do indivíduo, tonalizados na cor branca e localizados na região pélvica. Da cor amarela, está repre- sentado o cérebro, em formato oval, e localizado entre o topo da cabeça e o meio do nariz, o qual está interligado aos nervos do SNP, representados como filamentos cilíndricos, na horizontal, na cor amarela, que iniciam na medula espinhal (localizada bem ao centro do corpo, em linha vertical) e terminam nas extremidades visíveis. Figura 5 – Sistemas nervosos central e periférico. / Fonte: Tortora, Funke e Case (2019, p. 646). 186 O SN é protegido, fisicamente, pelos ossos e pelas meninges (tecido conjuntivo organizado em três camadas: dura-máter, pia-máter e aracnoide), incluindo o sistema cardiorrespiratório, que, também, é estéril, de maneira que a invasão de qualquer microrganismo ocasiona sintomas importantes e, muitas vezes, de ordem sistêmica. A entrada de patógenos se dá por traumas e através do sangue que tem um contato íntimo com a barreira hematoencefálica (Figura 6), conjunto de células endoteliais, pericitos e astrócitos, em forma de membrana, que possui estrutura espessa, resistente e não porosa. A função é a de realizar a seleção de oxigênio e de glicose para dentro do SN, além de bloquear a entrada de partículas maio- res, como bactérias. O SN é protegido, também, pelos fagócitos do sistema imune, denominados de células da micróglia. Bactérias, anticorpos e compostos químicos Células endoteliais BARREIRA HEMATOENCEFÁLICA: Pericitos Astrócitos Descrição da Imagem: a figura apresenta um desenho da barreira hematoencefálica, na qual todos os elementos celulares estão agru- pados em um círculo de bordas da cor azul, bem escura. O círculo está dividido ao meio, e por um traço, com o côncavo voltado para a esquerda. Do lado esquerdo, e de fundo rosa, há a escrita “vaso sanguíneo” com letras pretas, o que indica que se trata dessa estrutura. Círculos das cores amarela, verde e azul estão dispersos nessa região, e a escrita “bactérias, anticorpos e compostos químicos”, com letras pretas, indicam que se trata desses elementos. Ainda, pequenos círculos brancos representam o oxigênio e a glicose. No lado convexo do traço, há um conjunto de células ovais da cor rosa, com núcleos roxos, organizadas em fila e na vertical, o que representa as células endoteliais da barreira hematoencefálica. Logo atrás dessa estrutura, à direita, há um filamento da cor laranja que possui, nas extremidades inferior e superior, núcleos pontiagudos da cor azul. No lado direito, e para finalizar a figura, há um espaço de fundo cinza com a escrita “cérebro”, que indica que se trata desse órgão. Desenhadas em cima dele, há células em formato de boomerang, e da cor azul escuro, os astrócitos. Figura 6 – Estrutura organizacional da barreira hematoencefálica. / Fonte: Pesquisa FAPESP (2017, on-line). As infecções no SNC, geralmente, causam episódios de muita dor e desconforto, isso porque a presença das bactérias ativa nociceptores (receptores cerebrais de dor) durante o período da doença, fato que ocorre, por exemplo, nas meningites. As meningites bacterianas são caracterizadas por inflamação nas meninges, obstrução de vasos sanguíneos, aumento de pressão intracraniana, edema cerebral e UNICESUMAR UNIDADE 6 187 bloqueio da circulação do LCR. Assim, os sintomas clássicos de cefaleia, febre e calafrios estão, sempre, presentes (BLACK; BLACK, 2021). A transmissão, frequentemente, é endógena, ou seja, através da passagem de microrganismos já presentes no indivíduo, os quais invadem a barreira hematoencefálica após cirurgias medulares e traumas no SN (BLACK; BLACK, 2021). O diagnóstico laboratorial é muito importante para a resolução dos casos de meningite, a fim de ocorrer através do cultivo do LCR coletado em condições médicas muito específicas. Já vimos um exemplo de como ocorre essa coleta, incluindo as condições para que ela seja feita da maneira correta. Ainda, sugerimos que você se lembre delas e faça as suas anotações. No momento da coleta, o líquido, em condições normais, é límpido, e quase desprovido de cor, mas, em situações de infecção, apresenta-se turvo e espesso, devido à grande concentração de bactérias e de células de defesa (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019).O meningococo (Figura 7), maneira através da qual o agente etiológico Neisseria meningitidis é conhecido, dissemina-se a partir da nasofaringe para o sangue, e, em situações de fragilidade imune, alcança o SN. Esse coco Gram negativo, normalmente, organiza-se em pares, é catalase positivo, e, assim como o N. gonorrhoea, o maior fator de virulência é a presença da cápsula polissacarídica (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Além disso, a presença de pili, na superfície, é impor- tante para a fixação em endotélios não ciliados e para o combate à fagocitose pelos leucócitos. As proteínas porinas, na superfície, facilitam a absorção de nutrientes, e a produção de beta lactamases, também, contribui para que a bactéria persista no organismo mesmo sob administração de medica- mentos (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Descrição da Imagem: na figura, há uma foto de uma amostra em lâmina microscópica, vista com um aumento de 400 vezes. Nela, existem inúmeros leucócitos; células de citoplasma da cor rosa, bem clara; e um núcleo segmentado da cor rosa, e escuro. No centro da figura, há um leucócito com inclusões citoplasmáticas em forma esférica e na cor rosa, escuro. Essas inclusões representam a bactéria Neisseria meningitidis. O conjunto de bactérias, ainda, pode ser observado em mais três células, localizadas à esquerda, à direita, e, superiormente, na célula central. Figura 7 – Meningococo em lâmina microscópica. Material: líquido cefalorraquidiano / Fonte: Shutterstock ([2023a], on-line). 188 A infecção se dá pela internalização e pela proli- feração da bactéria nos macrófagos, a fim de pro- vocar a morte dessas células. A patologia, comu- mente, inicia-se abruptamente, com dores de cabeça intensas, febre alta e vômito, isso porque o N. meningitidis produz uma grande concentração de endotoxinas, e a bactéria, ainda, consome a glicose, enviada para o SN, para nutrir as células nervosas e imunes. Em casos mais extremos, pode acontecer a síndrome de Waterhouse-Frideri- chsen (coagulação intravascular e hemorragia), que leva o indivíduo infectado à morte (BLACK; BLACK, 2021). Crianças menores de um ano são mais pas- síveis de sofrer com as meningites meningocó- cicas, uma vez que ocorrem em indivíduos que não possuem anticorpos específicos contra o polissacarídeo presente na cápsula da bactéria (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2021). Dessa maneira, a aplicação da vacina menin- gocócica C é a principal forma de profilaxia, responsável pela diminuição do coeficiente de incidência da doença no Brasil, e é parte do calen- dário vacinal para crianças de três a cinco meses (MENINGITE, 2023). Em 2022, foi ampliada para crianças de até 10 anos, para trabalhadores da saúde, e para adolescentes de 11 e 12 anos de idade. O governo brasileiro, ainda, fornece a va- cina ACWY, que protege contra os sorotipos A, C, W e Y (BRASIL, 2022). Para adultos e crianças acima de dois anos, a meningite mais incidente é a causada pelo pneu- mococo, o Streptococcus pneumoniae. No Bra- sil, entre 2007 e 2020, foram notificados cerca de 12 mil casos de meningite pneumocócica, dos quais 83% dos casos ocorreram em maiores de cinco anos entre 2011 e 2020. Assim como na meningite meningocócica, a introdução da vacina (neste caso, a vacina pneumocócica 10-pentavalente) foi determinante para a redução da incidência da doença (MENINGITE, 2023). As meningites, nessa ocasião, foram geradas após infecções pulmonares, dos seios nasais, ou da orelha, provocadas pelo microrganismo (BLACK; BLACK, 2021). A Listeria monocytogenes, um bacilo Gram positivo e catalase positiva, pode ser transmiti- da aos seres humanos através do consumo de alimentos contaminados, como leite, carnes e vegetais. A bactéria é capaz de atravessar a bar- reira hematoencefálica, através da interação en- tre as proteínas da superfície e a glicoproteína das células. Uma vez circulante no SN, parasita ma- crófagos presentes na região. A listeriose deve ser investigada, principalmente, em gestantes, sem- pre que os sintomas de meningite são evidentes, isso porque, além de ser um dos grupos afetados por essa patologia, a bactéria é capaz, também, de atravessar a placenta, a fim de causar um dano fetal, ou aborto (BLACK; BLACK, 2021). É curioso como o comportamento das bactérias pode mudar, a depender da amostra na qual são isoladas. Para LCR, a cultura de L. monocyto- genes pode ser dificultada, devido ao reduzido crescimento em meios sólidos e à necessidade de vários dias de incubação. Já quando isolada a partir de alimentos, ela é uma das mais interessantes em um meio de cultura, como você poderá observar na Figura 8. Do lado esquerdo, será semeada uma cultura de Listeria monocytogenes NCTC 13372 em ágar Oxford-Listeria (OXA), a fim de se per- mitir a visualização da bactéria em colônias da cor pálida, acompanhadas por um precipitado preto e proveniente da degradação da bile-esculina do meio. Do lado direito, a bactéria será semeada em meio Ágar Listeria de Ottaviani & Agosti (ALOA), e evi- denciada pela colônia azul-esverdeada, cor gerada pelo composto cromogênico adicionado ao meio de cultura, que revela a produção da enzima β -gluco- sidase, produzida em todas as espécies de Listeria. UNICESUMAR UNIDADE 6 189 As encefalites, inflamação do encéfalo, podem, também, ser causadas por bactérias, por mais que a maioria dos casos esteja associada a uma infecção viral. Dentre as bactérias causadoras, destacam-se as dos gêneros Actinomyces sp, Brucella sp, Chlamydia sp, Listeria monocytogenes, Mycoplasma pneumoniae, Treponema pallidum e Leptospira sp. (LEWIS; GLASER, 2005). Com relação a doenças que, também, envolvem manifestações nervosas sistêmicas, talvez, o tétano seja uma das mais conhecidas. Causada por um bastonete Gram positivo esporulado e anaeróbio estrito, o Clostridium tetani, o tétano, é transmitido através da inoculação direta da forma esporulada da bactéria (endósporo) (Figura 9) na corrente sanguínea, por ferimentos ou soluções de continui- dade. Devido à alta resistência dessa bactéria em condições de baixa umidade e atividade desinfetante, o manejo de objetos cortantes, e sem a devida proteção, confere um risco a mais aos indivíduos. O C. tetani faz parte da microbiota de gado bovino. As fezes desses animais são a maneira através da qual a bactéria habita no solo e chega até os meios de inoculação, o que dá origem à transmissão acidental do tétano (BLACK; BLACK, 2021). Descrição da Imagem: na figura, há uma foto de duas placas de Petri e das respectivas tampas delas, apoiadas em uma superfície plana e metálica. A placa da esquerda possui uma superfície gelatinosa, na qual está semeada, por semeadura contínua, a colônia bacteriana de cor esbranquiçada e pálida. No fundo dessa placa, é possível observar um precipitado preto. Na placa da direita, há uma superfície gelatinosa de coloração amarela, na qual colônias azuis esverdeadas estão semeadas em uma semeadura contínua. Figura 8 – Listeria monocytogenes NCTC 13372 semeada em ágar OXA e ALOA. / Fonte: a autora.. 190 Entre 2009 e 2019, foi notificado o total de 2.984 casos de tétano no Brasil, concentrados, na sua maior parte, nas regiões Nordeste e Sudeste. Os indivíduos do sexo masculino foram os mais aco- metidos, independentemente da região analisa- da. Além disso, no mesmo intervalo de tempo, Descrição da Imagem: na figura, há um desenho de representação tridimensional dos endósporos do C. tetani. Células semelhantes a uma colher estão dispostas em um fundo branco. A célula é delimitada por uma membrana fina, e da coloração azul, bem escura, com uma extremidade mais fina e outra mais grossa e em formato esférico. Na extremidade arredondada, há uma esfera com as colorações laranja e vermelha, a qual representa o endósporo do microrganismo. Figura 9 – Representação tridimensional do endósporo de Clostridium tetani. / Fonte: Shutterstock ([2023b], on-line). “O tétano só é transmitido pela lesão, porinstrumentos enferrujados” é o maior conto que você deve ouvir durante a sua vida. Pela doença ser transmitida pelo en- dósporo do C. tetani, um prego novinho e prateado pode muito bem conter esporos da bactéria em toda a superfície dele. Fique atento! cerca de seiscentas pessoas vieram a óbito em decorrência da patologia. Assim, por mais que os números não sejam tão expressivos quanto os da meningite, são dados preocupantes, uma vez que a doença possui medidas de profilaxia, como a vacinação e o soro antitetânico. A primeira é aplicada a partir dos dois meses de idade, e, o segundo, logo após a ocorrência de acidentes que envolvem materiais perfurocortantes suspeitos (LIMA et al., 2021). A grande preocupação em relação ao tétano é que a toxicidade da bactéria é, praticamente, fatal quando ela não é detectada rapidamente. A tetanospasmina (neurotoxina termolábil) é produzida durante a fase estacionária do cres- cimento bacteriano, acumulada nos períodos de formação de esporos e liberada em grande concentração na lise da bactéria. Uma das su- UNICESUMAR UNIDADE 6 191 bunidades da toxina se liga, irreversivelmente, às glicoproteínas de neurônios motores, e, quando internalizada em endossomas, reduz a ação de proteínas inibidoras de neurotransmissores motores, de maneira que uma atividade sináptica excitatória e intensa ocorre, o que ocasiona a paralisia espástica (Figura 10). A contração é tão intensa que os ossos podem ser quebrados durante os espas- mos, e a doença evolui para a paralisia de órgãos, como pulmão e coração, a fim de levar o indivíduo à morte (BLACK; BLACK, 2021). Descrição da Imagem: na figura, há um desenho de um indivíduo em decúbito dorsal, com espasmo da coluna vertebral, de maneira que braços e pernas estão contraídos. Forçam para que a coluna se curve e o indivíduo fique em posição de arco (abdômen em posição mais alta e superior do que o restante do corpo), apoiado, apenas, pelos calcanhares e pelo topo da cabeça. Figura 10 – Representação gráfica do opistótono, sintoma do tétano. / Fonte: Shutterstock ([2023c], on-line).. O tratamento é a aplicação do soro antitetânico após as primeiras horas de suspeita de contami- nação, até porque esse é o único momento no qual o soro é indicado. Uma vez que a toxina atinge as terminações nervosas, não existem muitas medidas terapêuticas a serem tomadas já que a ligação entre toxina e células do hospedeiro é irreversível. Além disso, o soro não confere imunidade, assim, é necessária e mais confiável a aplicação da vacina antitetânica, DTP, que previne, também, contra a difteria e a coqueluche, como já vimos. Ainda, com relação a agentes etiológicos anaeróbios e formadores de esporos, o Clostridium botu- linum, causador do botulismo, também, é produtor de uma toxina neurotóxica, potencialmente, fatal. O botulismo pode ser transmitido através de alimentos contaminados (sobretudo, embutidos) e de ferimentos. A toxina botulínica é produzida por meio de um bacteriófago que carrega a infor- mação genética necessária para a sintetização, e, quando infecta uma célula viável de C. botulinum, confere, à bactéria, a capacidade de produção de até oito tipos de toxinas (MURRAY; ROSENTHAL; 192 PFALLER, 2021). A toxina tem tropismo para as células nervosas na porção sináptica, e, por ser di- ferente dos efeitos do tétano, o bloqueio da liberação de acetilcolina (neurotransmissor essencial para a transmissão de impulsos nervosos), por ação da toxina, provoca paralisia flácida progressiva, não apenas, na musculatura esquelética, mas, também, nos pulmões e no coração, o que ocasiona as insuficiências respiratória e cardíaca (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). O tratamento consiste em ser dado suporte cardiorrespiratório ao paciente, até que ocorra a regeneração da porção sináptica dos nervos, uma vez que o uso de antimicrobianos não é eficaz contra a toxina. As infecções de tétano e de botulismo não conferem imunidade ao indivíduo, uma vez que a quantidade de toxinas liberadas não é, suficientemente, alta para a produção de anticorpos. O diag- nóstico para a doença é obtido pela análise de sintomas clínicos, história e achados laboratoriais confirmados no soro, nas fezes ou em restos de alimentos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2019). Anteriormente, tivemos o nosso primeiro contato com um grupo de bactérias aeróbias obrigatórias que se diferenciavam das Gram negativas e positivas por conta da constituição da parede celular. Você se lembra desse grupo? São as micobactérias, que possuem a parede celular constituída por ácidos micólicos, os quais conferem, a essa estrutura, uma composição rica em gorduras, o que altera, assim, a maneira através da qual o organismo interage com alguns itens diagnósticos e de triagem, como os corantes para coloração de Gram. É necessário, então, que o laboratório disponha de outras técnicas de pesquisa. Os denominados Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR) são conhecidos, principalmente, pelos acometimentos respiratórios, no entanto, o Mycobacterium leprae, ou bacilo de Hansen, causador da lepra, ou da hanseníase, é um microrganismo que faz parte da história do mundo de maneira pronunciada, e possui parte da fisiopatologia no SN. Por mais que, na atualidade, o número de infectados seja, praticamente, inexpressivo, em 2020, foram reportados cerca de 130 mil casos à Organização Mundial da Saúde (OMS), sendo que 15% deles correspondiam aos casos ocorridos na América. O Brasil apareceu como responsável por 93,6% de todos os casos confirmados no continente, e ocupou o segundo lugar entre os países com o maior número de casos (OMS, 2021). Pela relevância epidemiológica, a doença foi incluída na Lista Nacional de Notificação Compulsória de Doenças, Agravos e Eventos de Saúde Pública, assim, é obrigatório que os profissionais de saúde reportem os casos do agravo (BRASIL, 2022). A hanseníase é transmitida pelo contato direto, assim, o indivíduo pode se contaminar através da inalação de aerossóis que contêm bactérias; e do contato da pele lesionada com feridas, ou com fluidos respiratórios contaminados. Uma vez no organismo, a bactéria se aloja nos gânglios linfá- ticos; sobrevive aos macrófagos e aos processos de fagocitose; e, através da circulação, atinge a pele e as células de Schwann, que são as responsáveis pela fabricação da bainha de mielina – envol- tórios dos axônios que aceleram o impulso nervoso. São observados o acúmulo de metabólitos e o UNICESUMAR UNIDADE 6 193 desligamento mitocondrial nessa região, com a geração de lesão celular e de uma resposta nervosa insuficiente (MEDEIROS et al., 2016). Esses bacilos de 1 a 8 μm de comprimento podem ser vistos isoladamente, ou em aglomerados, denominados de globias, no citoplasma de macrófagos, o que caracteriza as células de Virchow (YONEMOTO et al., 2022) (Figura 11). Descrição da Imagem: na figura, há uma foto de uma lâmina microscópica corada pela técnica de Ziehl-Neelsen, vista a partir de um aumento de 400 vezes. Por toda a extensão da lâmina, um esfregaço tecidual da cor azul é observado, e, disperso nele, existem inúmeras células em forma de bastão, vermelhas e rosas, o que caracteriza o M. leprae. Figura 11 – Corte histológico da pele com infiltração de bacilos M. leprae em um gânglio nervoso. Fonte: Public Domain Files (2014, on-line). Dentre os mecanismos de patogenia já analisados e estudados, destaca-se a liberação de interleucina 17, que aumenta a apoptose celular (AARÃO et al., 2016); de interleucina 10, que desencadeia uma reação de hipersensibilidade do tipo III, que auxilia na sobrevivência (ANTUNES et al., 2019) e reduz a atividade de macrófagos (DE SOUZA et al., 2017); e de interleucina 17, que aumenta a inflamação e a desmielinização, ao ocasionar lesões neurais mais graves (DE SOUZA et al., 2017). A bactéria é conhecida por ter um período de incubação longo (pode durar de dois a cinco anos). Por essa razão, a pessoa infectada inicia a apresentação de sintomas após