Relatório Cromatografia docx (1)

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ – UNIVALI
AMANDA DE CAMPOS
SAMUEL PAULO COELHO
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA:
CROMATOGRAFIA EM COLUNA ABERTA E CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
ITAJAÍ
2022
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1 INTRODUÇÃO
A cromatografia é uma método que utiliza a separação de componentes dentro de
uma mistura, para analisar e identificar substâncias presentes na amostra.
Funciona utilizando as características químicas de duas fases imiscíveis, chamadas
de fase móvel e fase estacionária.
Para esta técnica, substâncias puras foram utilizadas para gerar padrões
visualizados na identificação de compostos.
A substância na mistura assumirá o mesmo comportamento quando ela está pura,
podendo ser comparada a estes padrões já tabelados.
Neste estudo serão tratados dois diferentes tipos de cromatografia, a Cromatografia
em Coluna Aberta e a Cromatografia em Camada Delgada e diferentes compostos
encontrados nas misturas utilizadas, as clorofilas e o β-Caroteno.
Na técnica de cromatografia em coluna aberta ocorre a separação dos compostos a partir de
diferentes fases de estado, uma líquida, que é uma mistura de solventes, feita
especialmente para aquela operação, buscando a melhor capacidade de adsorção e
solubilidade para os componentes envolvidos no processo, e outra sólida que geralmente é
a sílica. Nesta técnica, a mistura que será separada, é colocada no topo da coluna iniciando
com a fase móvel menos polar. As substâncias envolvidas na mistura, eluirão em
velocidades diferentes em meio a sílica, separando-as dentro da coluna. (RIBEIRO; NUNES,
2008)
Na cromatografia em camada delgada a fase móvel (eluente) se desloca por uma camada
fina de sílica-gel (fase estacionária), enquanto este processo ocorre, cada um dos
componentes encontrados na fase móvel se separa de acordo com sua solubilidade e
capacidade de adsorção. Este é um método muito utilizado devido ao baixo custo, eficiência
e a facilidade de operar e chegar a um resultado. É válido destacar também, que este é um
método utilizado para uma análise qualitativa e não quantitativa da composição da mistura.
(DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998)
As clorofilas são os pigmentos naturais mais abundantes nas plantas, eles são responsáveis
pela coloração esverdeada encontrada nas maiorias dos vegetais no planeta. Elas são
extraídas das plantas com auxílio de um álcool, e são utilizadas como aditivos em produtos
alimentícios para dar cores e propriedades físico-químicas específicas para alguns
alimentos. (STREITI; CANTERLEI; CANTOII; HECKTHEUER, 2015)
O β-caroteno é um pigmento natural abundantemente encontrado em alimentos alaranjados
como a cenoura, podem ser encontrados também em vegetais verde-escuros, nestes a
presença do carotenóide se esconde pela presença maior das clorofilas descritas no
parágrafo anterior. Este pigmento é responsável por cerca de 70% da vitamina A que o ser
humano consome. (NAVES, 1998)
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1.1 Objetivos
1.1.1 Objetivo geral
Aplicar os conhecimentos sobre cromatografia em coluna aberta e cromatografia em coluna
delgada.
1.1.2 Objetivos específicos
● Extrair pigmentos de microalga Spirulina por cromatografia em coluna aberta;
● Analisar a presença de β-caroteno na amostra de Spirulina por cromatografia em
camada delgada e calcular o seu fator de retenção.
2 METODOLOGIA
2.1 Materiais e reagentes
2.1.1 Reagentes
● Cápsulas de Spirulina;
● Solvente Hexano;
● Solvente Acetona;
● Padrão de β-caroteno.
2.1.2 Equipamentos
● Placa agitadora;
● Barra de agitação magnética;
● Bastão magnético;
● Balança;
● Centrífuga.
2.1.3 Vidrarias
● Cuba cromatográfica;
● Sílica gel;
● Suporte universal;
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● Garras;
● Coluna de cromatografia;
● Béqueres;
● Tubo Falcon;
● Pipetas analíticas;
● Fase estacionária para CCD;
● Algodão;
● Capilar de vidro;
● Bastão de vidro.
2.2 Métodos
2.2.1 Preparo da amostra
Para o preparo da amostra foram pesados aproximadamente dois gramas de Spirulina. Essa
spirulina foi posta em contato com 10 mL de uma solução de hexano:acetona na proporção
80:20 (v/v) em um béquer.
Em seguida, a mistura foi levada à chapa de agitação com a barra magnética pelo tempo de
10 minutos. Passado esse tempo, a amostra foi colocada em um tubo falcon e submetida a
uma agitação de 3000 rpm por 10 minutos em centrífuga com o intuito de separar o
sobrenadante com os pigmentos do precipitado.
2.2.2 Cromatografia em coluna aberta
Primeiramente, para a execução da cromatografia em coluna aberta é necessário rechear a
coluna com sílica gel (fase estacionária polar), colocando previamente um pequeno tufo de
algodão no fundo da coluna para que não saia sílica no extrato e para que não ocorra o
entupimento da coluna. O preparo com sílica gel consiste em dispor a sílica dentro da coluna
de modo a deixá-la bem empacotada utilizando o auxílio de um bastão de vidro.
Assim que a coluna está pronta e bem empacotada, é preciso ativá-la com a solução de
Hexano:Acetona (80:20 - v/v). E a partir desse momento não é permitido deixar a coluna
sem solvente, pois se ela secar poderá quebrar. O esquema de uma coluna aberta de
cromatografia está na Figura 1.
Figura 1: Esquema de coluna aberta para cromatografia.
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Fonte: Degani, Cass e Vieira (1998)
Com a sílica completamente ativada, é colocado nela o extrato de Spirulina que está no tubo
falcon. E então começa a separação dos compostos com base na sua polaridade e afinidade
com a fase móvel e com a fase estacionária, sendo que a fase móvel aplicada foi o próprio
solvente empregado na ativação da coluna e que possui característica apolar.
Para o recolhimento das frações, os componentes que foram se separando iam para
béqueres, e posteriormente armazenados em frascos adequados.
2.2.3 Cromatografia em camada delgada (CCD)
Na realização da CCD foi preparada uma cuba cromatográfica com a utilização de um
béquer, uma Placa de Petri e a solução de hexano:acetona (80:20 - v/v).
Antes de colocar a amostra na coluna delgada, foram estipulados com o auxílio de uma
régua os pontos de início e fim da corrida cromatográfica. A Figura 2 exemplifica a
disposição desses pontos. Na parte inferior foi deixado 1 cm: 0,5 cm para imergir na fase
móvel e 0,5 cm para colocar a amostra e o padrão. E na parte superior foi deixada uma
margem de 0,5 cm da extremidade na fase estacionária para CCD.
Figura 2: Organização das margens pré-estabelecidas na CCD.
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Fonte: Autores.
Com o auxílio de dois capilares foram retiradas duas pequenas alíquotas, uma do
sobrenadante do extrato de Spirulina preparado e uma da solução padrão de β-caroteno.
Cada alíquota foi colocada na fase estacionária para CCD no limite inferior de 0,5 cm
estipulados anteriormente de forma que as duas ficassem lado a lado para efeitos de
comparação.
Após isso, a fase estacionária de CCD com as duas amostras foi colocada na cuba
cromatográfica e a corrida começou a ser contada no momento em que a fase móvel
alcançou as amostras e terminou quando atingiu o limite superior.
No momento em que a fase móvel atingiu o limite superior, a fase estacionária de CCD foi
retirada da cuba cromatográfica para que a fase móvel não levasse tanto o padrão quanto a
amostra para fora do sistema, o que impossibilitaria a interpretação dos resultados.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Cromatografia em Coluna Aberta
Como a fase móvel possuía características apolares, os compostos que tinham essa
propriedade eluíam junto com a fase móvel e saíam da coluna primeiro. Por possuir cadeia
carbônica longa e ausência de grupos funcionais polares, o β-caroteno presente no extrato
preparado saiu primeiro da coluna. A Figura 3 traz a estrutura do β-caroteno.
Figura 3: Estrutura química do β-caroteno.
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Fonte: Autores.
Ao contrário dele, as clorofilas a e b, cujas estruturas estão na Figura 4, do extrato, ficaram
retidas na coluna, uma vez que as duas clorofilas têm características polares e assim
tiveram maior interação com a fase estacionária de sílica gel.
Figura 4: Estrutura química da clorofila A e da clorofila B
Fonte:Streitet al. (2005)
A separação desses compostos polares e apolares pode ser visualizada na Figura 5, a qual
mostra a coluna já no momento em que ocorre a eluição do β-caroteno e o recolhimento da
fração em um béquer.
Figura 5: Coluna cromatográfica aberta com separação evidente das frações (a) e
recolhimento em béquer (b).
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(a) (b)
Fonte: Autores.
Após um tempo de eluição foi percebido uma separação inicial da fração polar em dois tons
de verde. A Figura 6 apresenta essa separação visualizada na coluna.
Figura 6: Evidência de fracionamento das espécies polares.
Fonte: Autores.
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Analisando as estruturas da Figura 4, a clorofila b apresenta um grupo funcional aldeído, o
que confere uma característica um pouco mais polar, e portanto ela é a que está com a
coloração verde mais escura e mais retida na coluna, e a clorofila a por não ter esse grupo
funcional conseguiu se separar.
Ademais, pelo fato de a diferença de polaridade não ser tão grande de uma estrutura para
outra, é muito provável que ocorra a coeluição dos dois compostos.
Após separar todo o β-caroteno do extrato, e se fosse desejado retirar as frações de
clorofilas, seria possível fazer a mudança de fase móvel para um reagente mais polar, que
carregaria esses componentes através da fase estacionária. Porém, mesmo colocando uma
fase estacionária mais polar, ainda seria difícil retirar as clorofilas da coluna pois como a
fase estacionária já é polar, haveria uma competição da fase estacionária e da fase móvel
pelas interação com as clorofilas.
O ideal para a separação das clorofilas, caso fossem o principal composto de interesse,
seria a aplicação de uma fase estacionária apolar, como a sílica quimicamente ligada, e de
uma fase móvel polar, como um metanol ou etanol. Deste modo a interação com a fase
móvel seria maior e as clorofilas eluiríam primeiro e o β-caroteno é que ficaria retido na
coluna.
Vale lembrar que mesmo mudando as fases móvel e estacionária é muito provável que as
clorofilas saiam coeluídas, pois a diferença de polaridade delas é muito pequena.
3.2 Cromatografia em Camada Delgada
Referente à CCD, foi calculado o fator de retenção do padrão de β-caroteno e do extrato
pela Equação 1 apresentada, onde dFM a é distância percorrida pela fase móvel e damostra é a
distância percorrida pelo analito e Rf é o fator de retenção.
(1)𝑅
𝑓
 = 
𝑑
𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎
𝑑
𝐹𝑀
Tanto o padrão, quanto a amostra percorreram toda a fase estacionária com a fase móvel,
ou seja, a distância da fase móvel, do padrão e da amostra foram iguais, dando um fator de
retenção de 1 para o padrão e a amostra.
A CCD é um método que com a utilização de um padrão, evidencia se a amostra em
questão apresenta o analito estudado. Se na faixa em que o padrão para de seguir a fase
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móvel houver uma banda na alíquota da amostra, significa que o analito em questão (nesse
caso o β-caroteno) está presente no extrato.
A Figura 7 mostra o resultado da CCD. É possível notar que ocorreu um bom fracionamento
dos componentes presentes no sobrenadante preparado a partir da Spirulina. Eles estão
bem separados e com faixas bem definidas, o que demonstra uma boa resolução e portanto,
um bom manuseio no momento de colocar os analitos.
Figura 7: Resultado da Cromatografia em Camada Delgada
Fonte: Autores.
O padrão como mencionado anteriormente seguiu até o final da corrida cromatográfica e ao
lado dele é visto uma banda de mesma cor, porém com menos intensidade de um composto
presente no extrato. Sendo assim, é possível afirmar que a amostra de Spirulina apresenta
sim β-caroteno na composição.
As bandas que estão de cor esverdeada no local da amostra estão mais retidas na CCD.
Isso é um indicativo de que esses compostos possuem características polares que
interagem mais com a fase estacionária.
O fato de o fator de retenção ter dado 1 como resultado mostra que o padrão e o β-caroteno
da amostra tinham tanta afinidade com a fase estacionária que seguiram até o final da
corrida. Se isso não for desejado, é possível mudar a composição da fase móvel deixando-a
mais polar. O que mesmo assim pode causar problemas, visto que desse modo os
compostos mais polares eluiríam mais e que haveria competição por eles entre a fase
estacionária e a fase móvel, piorando a resolução.
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Mesmo não sendo um método quantitativo, a CCD mostra uma cor bem mais forte para o
padrão do que para o analito. Isso pode dar a interpretação de que existe β-caroteno na
amostra, mas em uma quantidade menor do que no padrão. Contudo, essa resposta só
pode ser confirmada por outros meios analíticos, como a análise por HPLC, ou fazendo uma
curva de calibração para β-caroteno e analisando via espectrofotômetro.
4 CONCLUSÃO
Conclui-se que foi possível extrair os compostos da Spirulina e que a separação deles foi
eficaz. A utilização da CCD é ótima para identificar compostos de interesse em amostras
desconhecidas, não só pelo fato de ser rápida, mas também por ter reagentes de baixo
custo. Então ela pode ser uma análise prévia para posteriormente submeter uma amostra a
análises de alto custo.
Já a coluna aberta é um ótimo método de separação e purificação de componentes de uma
mistura. Foi possível ver que o β-caroteno ficou bem separado e eluiu de forma eficiente da
coluna, sem misturas com outros compostos que possam interferir em resultados, o que
indica um bom empacotamento da sílica na coluna e que a fase móvel aplicada foi feita com
uma união de solventes em uma proporção que realmente atraía bem essa fração do
extrato.
REFERÊNCIAS
DEGANI, Ana Luiza G.; CASS, Quezia B.; VIEIRA, Paulo C.. Cromatografia: um breve
ensaio. Química Nova na Escola, [S.L.], n. 7, p. 21-25, maio 1998. Disponível em:
http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc07/atual.pdf. Acesso em: 07 abr. 2022.
NAVES, Maria Margareth Veloso. Beta - caroteno e câncer. Revista de Nutrição, [S.L.], v.
11, n. 2, p. 99-115, dez. 1998. FapUNIFESP (SciELO).
http://dx.doi.org/10.1590/s1415-52731998000200001. Disponível em:
https://www.scielo.br/j/rn/a/xytpXVkMXFkcwMPX4z767mL/?lang=pt#:~:text=Beta%2Dcarote
no%20constitue%20um%20pigmento,folhosos%20de%20cor%20verde%2Descura. Acesso
em: 07 abr. 22.
RIBEIRO, Núbia Moura; NUNES, Carolina Rodeiro. Análise de Pigmentos de Pimentões por
Cromatografia em Papel. Química Nova na Escola, [S.L], n. 29, p. 34-37, ago. 2022.
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Disponível em: http://professor.ufop.br/sites/default/files/legurgel/files/08-eeq-0707.pdf.
Acesso em: 07 abr. 2022.
ROSA, Gilber; GAUTO, Marcelo; GONÇALVES, Fábio. Análise Instrumental: separações
cromatográficas. In: ROSA, Gilber; GAUTO, Marcelo; GONÇALVES, Fábio. Química
analítica: práticas de laboratório. Porto Alegre: Bookman, 2013. p. 115-116. (Tekne).
STREIT, Nivia Maria et al. As clorofilas. Ciência Rural, [S.L.], v. 35, n. 3, p. 748-755, jun.
2005. FapUNIFESP (SciELO). http://dx.doi.org/10.1590/s0103-84782005000300043.
Disponível em: https://www.scielo.br/j/cr/a/dWwJymDzZRFwHhchRTpvbqK/. Acesso em: 07
abr. 22.