Testes bioquímicos 2020 (2)

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São Carlos, 24 de Junho de 2020
Aula Prática
Testes Bioquímicos para identificação de bactérias
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Identificação de bactérias
Coloração simples, diferenciais ou estruturais, mesmo combinadas com diferentes cultivos, não são, geralmente, suficientes para identificação de bactérias 
Tais métodos não revelam a fisiologia ou a filogenia das células
Testes Bioquímicos
Classificação das bactérias segundo tipo de metabolismo e atividade enzimática
Combinado com outras técnicas, tais como os
testes bioquímicos, que permitem a identificação de bactérias, de acordo com suas propriedades metabólicas que são únicas para cada espécie.
Testes Bioquímicos
Meios de Cultura
Seletivo
Diferencial
Enriquecimento
Favorece o crescimento de alguns organismos, mas suprime o crescimento de outros. 
Possui um constituinte que causa uma mudança observável no meio quando ocorre uma reação bioquímica específica.
Contém nutrientes especiais que favorecem o crescimento de um organismo específico.
 Classificação das bactérias em relação às suas características bioquímicas:
Diferentes vias metabólicas para obtenção de energia
 Ex: Fermentação e Respiração
Enzimas específicas utilizadas no processo de metabolização de diferentes substratos
Ex: Enzimas Triptofanase e Catalase
Formação de produtos específicos nas reações catabólicas
Ex: Ácidos estáveis e Indol
Testes Bioquímicos
Resultados de Testes Bioquímicos
Resultados expressos como positivo (+) ou negativo (-) 
Identificação da bactérias de acordo com suas características já pré-estabelecidas
Atividade Prática: Execução de 5 testes bioquímicos:
1. Fermentação de carboidratos 
2. Produção de indol
3. Hidrólise do amido
4. Teste de oxidação e fermentação
5. Teste da catalase
1. Fermentação de carboidratos
Forma de catabolismo anaeróbio, no qual um composto orgânico é um doador de elétrons e um aceptor de elétrons
Utilizado para identificação de bactérias entéricas
Bacilos Gram negativos;
Aeróbios facultativos;
Exigência nutricional simples (fermentadores de açúcares);
Podem ser patogênicos ao homem, animais e plantas;
Importância industrial.
1. Fermentação de carboidratos
Aplicação do teste é válido pois existem características que permitem distinguir vários gêneros de bactérias entéricas
Tipo e proporção de produtos de fermentação
Fermentação Ácido-Mista
Fermentação Butanodiol
3 ácidos são formados em quantidades significativas: acético, láctico e succínico
Quantidades menores de ácidos são formadas, sendo butanodiol, etanol, os principais produtos.
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1. Fermentação de carboidratos
a. FERMENTAÇÃO ÁCIDO-MISTA
Formação de diferentes tipos de ácidos e etanol;
CO2 e H2 produzidos na mesma proporção;
Isto porque o CO2 é produzido somente do ácido fórmico por meio da enzima formate hydrogenase
HCOOH  H2 + CO2
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1. Fermentação de carboidratos
b. FERMENTAÇÃO DO BUTANODIOL
Reação geral
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1. Fermentação de carboidratos
IMPORTANTE
Razões
Ácido : Neutro
CO2 : H2
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1. Fermentação de carboidratos
A fermentação de carboidratos é evidenciada pela produção de ácido e/ou gás no meio de cultura em pH neutro. 
Usa-se meio básico contendo apenas uma fonte de carbono e um indicador de pH
Detecção
Ocorre conversão em produtos neutros como 2,3 butanodiol, não provocando redução tão drástica de pH.
Exemplo: Enterobacter
Fermentam com produção de ácidos (fórmico, acético, láctico e succínico) e gás, até que o pH do meio chegue a cerca de 5,0. 
Exemplo: E. coli
Vermelho de Metila
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1. Fermentação de carboidratos
	Proteose peptona	5g
	KH2PO4	5g
	Glicose	5g
	Água destilada	1L
Meio Clark e Lubs 
2x
Incubação à 30°C por 48 h
Leitura 
F. Ácido mista
F. de butanodiol
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1. Fermentação de carboidratos
Leitura 
F. Ácido mista
F. de butanodiol
Indicador vermelho de metila
Cor rosa/avermelhado: indica pH<5, portanto + para fermentação ácido mista (geração de maior proporção de ácidos)
Cor amarela: indica pH>5, portanto - para fermentação ácido mista. Mas se observar formação de gases é porque provavelmente ocorreu a fermentação de butanodiol.
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 2. Produção de Indol
Identificar bactérias entéricas que são capazes de degradar o aminoácido triptofano até indol através da ação enzimática da triptofanase
Hidrolisar o triptofano com a produção de indol não é uma característica de todos os microrganismo, por isso pode ser utilizado como marcador bioquímico
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 2. Produção de Indol
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 2. Produção de Indol
	Triptona	5 g
	NaCl		2,5 g
	Água destilada	1 L
Caldo Indol 
2x
Incubar à 30°C por 48 h
+ -
Adição de 0,5 ml do reagente de Kovac 
Leitura
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 3. Hidrólise do amido
Forma linear da molécula do amido
Forma ramificada da molécula do amido
O amido juntamente com a celulose são os dois polissacarídeos naturais mais abundantes
O que diferencia estes polissacarídeos são as ligações entre as moléculas de glucose
As enzimas amilase e oligo-1,6-glicosidase catalisam a hidrólise do amido, formando maltose. A maltose pode então entrar na célula, onde é hidrolisada à glicose
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 3. Hidrólise do amido
Diferencia bactérias que hidrolisam o amido
Leitura
Iodo presente na solução é usado para detectar a presença ou ausência de amido na periferia ao redor do crescimento bacteriano
Iodo reage com o amido e produz uma coloração azul-violácea intensa
Zona clara ao redor do crescimento representa resultado positivo para o teste
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 3. Hidrólise do amido
Abrir a placa com meio ágar amido próximo ao gramado atrás e a frente do prédio da Eng. Ambiental;
Deixar aberto por 10 minutos.
1ª Etapa do experimento
	Amido		2g
	Na2HPO4	1g
	Extrato de carne	 10g
	NaCl	5g
	Agar	 15g
	Água destilada	1L
Meio ágar amido
Incubar à 30°C por 48 h
Reativo Lugol (contém iodo)
5 -10 ml
2ª Etapa do experimento
SE (+)
SE (-)
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 3. Hidrólise do amido
Reativo Lugol (contém iodo)
5 -10 ml
SE (+)
SE (-)
AMIDO
LUGOL
Azul
DEXTROSE 
MALTOSE
GLICOSE
LUGOL
Incolor
+
+
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 4. Oxidação/Fermentação
CARBOIDRATOS
Produtos ácidos
Fermentação
Aerobiamente
O teste de oxidação/fermentação é utilizado para diferenciar microrganismos que oxidam ou fermentam açúcares específicos e determina se a bactéria é aeróbia ou anaeróbia facultativa
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 4. Oxidação/Fermentação
Tubos selados com óleo mineral (ambiente anaeróbio)
Microrganismos não são capazes de degradar o açúcar 
(sem alteração do pH)
Microrganismos são capazes de degradar o açúcar 
(alteração no pH)
 Azul de bromotimol
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 4. Oxidação/Fermentação
Microrg. capazes de promover apenas oxidação 
Microrg. capazes de oxidar e fermentar
Microrg. capazes de promover apenas fermentação
 Azul de bromotimol
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 4. Oxidação/Fermentação
Aeróbio
Rodilhão de algodão
Anaeróbio
2 ml de óleo mineral
Incubar à 30°C por 48 h
+ -
Leitura 
	NaCl	5,0g
	Peptona	2,5g
	Glicose	10g
	Ágar	5g
	Azul de Bromotimol	40ml (solução 1:500)
	Água destilada	1000mL
Meio com ágar e azul de bromotimol
2 X
Corrigir o pH para 7,1
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 4. Oxidação/Fermentação
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 5. Catalase
Permite identificar microrganismos produtores da enzima catalase que protege a célula de formas tóxicas do oxigênio. 
A toxicidade do oxigênio para anaeróbios estritos deve-se a certas moléculas produzidas durante as reações que envolvem o oxigênio. 
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 5. Catalase
Reações tóxicas do oxigênio para anaeróbios estritos 
O2 + e- O2-
2O2- + 2H+ O2 + H2O2
O2- + H2O2 O2 + OH- + OH-
Superóxido
Peróxido de hidrogênio
Hidroxilas
Adição de 1 elétron a molécula de oxigênio:
Superóxidos dão origem:
Altamente reativos e podem destruir componentes vitais da célula, como o DNA
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 5. Catalase
Reações de proteção dos aeróbios e anaeróbios facultativos: 
Superóxido dismutase
Catalase
Peroxidase
O2-
H2O2
H2O2
H2O2
O2 e H2O
H2O
Produção de enzimas que eliminam os superóxidos e peróxidos de hidrogênio:
Enzimas
Superóxido
Peróxido de hidrogênio
305. Catalase
Incubar à 30°C
 18-24 h
Água oxigenada (3%)
Ágar nutriente
Água oxigenada reage com a catalase liberando bolhas de oxigênio (Catalase +)
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 RESUMO GERAL
+ -
+ -
Leitura
F. Ácido mista
F. de butanediol
Fermentação de Carboidratos
Cor avermelhada: indica pH<5
Cor amarela: indica pH>5
Produção de Indol
Hidrólise de amido
Fermentação/ Oxidação
Catalase
Degradação do aminoácido triptofano até indol através da ação enzimática da triptofanase
Detecção da presença ou ausência de amido na periferia ao redor do crescimento bacteriano
Incapacidade de degradar o açúcar 
(sem alteração do pH)
Degradação do açúcar 
(alteração no pH)
Reação da água oxigenada com a enzima catalase liberando bolhas de oxigênio (Catalase +)
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Dúvidas???
®
Bact
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rias Ent
é
ricas 
Escherichia
Salmonella
Proteus
Enterobacter
Klebsiella
Serratia
Fermenta
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ão 
Á
cida Mista
Fermenta
ç
ão 
do Butanodiol