Relatórios - Biologia Molecular

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Curso: Biomedicina
Disciplina: Biologia molecular
REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA E ELETROFORESE EM GEL DE
AGAROSE.
Jéssica Ferreira Santos
Goiânia, 2022.
1. Introdução:
O DNA é um hélice de dupla fita, composta por nucleotídeos
complementares.Sua replicação é semiconservativa, semidescontínua e segue a
direção 5’ – 3’. Ambas as fitas são lidas, e o objetivo é gerar duas novas moléculas
filhas a partir de uma mãe.
A sigla PCR s ignifica Polymerase Chain Reaction (em tradução:
reação em cadeia da polimerase), cujo princípio é a amplificação de um
molde de DNA por meio de componentes sintéticos do replissomo de
um segmento específico de um genoma.Kary B. Mullis foi o responsável
pela criação da técnica PCR, onde por meio de alterações na
temperatura o DNA altera também a sua estrutura e guia a ação dos
componentes da PCR. O método demanda alguns elementos na reação,
um deles é opróprio genoma a ser analisado que servirá de molde para a
replicação, além disso serão usados iniciadores e polimerases específicos e
nucleotídeos livres. Esse molde de DNA pode ser extraído de qualquer célula de
um organismo.
Para que ocorra a replicação o ambiente natural em que ela ocorreria é
simulado,ou seja, deve-se ser feito em meio aquoso. Assim, um
aumento na temperatura (94ºC) condiciona desnaturação da molécula, o que é
necessário visto que não haverá helicases.A 60ºC terá uma temperatura
ótima para o oligonucleotídeo sintético iniciador se ligar no local de
interesse, delimitando o local a ser replicado, essa etapa consiste no
anelamento do iniciador. Posteriormente, a 72ºC inicia-se a adição das
fosfodiésteres pela DNA polimerase (Taq polimerase), o que consiste na etapa de
extensão da fita.
Assim, descobriu-se que repetindo esse ciclo de alterações na
temperatura seria possível gerar cópias do fragmento alvo em escala
exponencial, gerando milhões delas. Dessa forma, o termociclador realiza
essa mudança diversas vezes, entregando como resultado essas cópias após
algum intervalo de tempo e diversos ciclos.
A quantificação do número de fitas obtidas ao final do processo é
feita por eletroforese, cujo princípio é a dosagem final do fluoróforo
intercalante, no caso desse experimento o Gel Red. Ele se liga na fita
dupla por ter afinidade com as pontes de hidrogênio e só passa a
refletir luz quando intercalado com sucesso nas novas fitas produzidas,
caso o resultado seja positivo e haja a replicação do fragmento alvo.
2. Objetivos:
Realizar a PCR de uma amostra de DNA relatando e identificando suas etapas,
elementos, resultados e princípios.
3. Metodologia:
A confecção e montagem no suporte do gel de agarose 0,8% já tinha sido feita
pelo Rafael, então, fomos direto para a pipetagem da reação de PCR.
REAGENTE QUANTIDADE
H2O 12 µ
MGCL2 02 µ
MIX DNTP 02 µ
PRIMER SNS 01 µ
PRIMER ATSNS 01 µ
CDNA 01 µ
TAQ POLIMERASE 01 µ
O controle negativo não continha o DNA e as ponteiras eram trocadas a cada
pipetagem.
A amostra é colocada no termociclador e os ajustes são feitos diretamente na
interface do aparelho, onde um dos modelos do teste foi selecionado e modificado
de acordo com as orientações de temperaturas e tempo. A desnaturação é feita em
uma temperatura de 94°C, anelamento em uma temperatura de 60°C e a extensão a
uma temperatura de 72°C. São realizados cerca de 35 ciclos como esse e após
esse período o termociclador manterá a solução a 4°C até que seja retirada dele
para colocar no gel. O processo dura de 1 hora e meia a 3 horas, então usamos
outras amostras já prontas para colocar no gel e visualizar na luz UV.
O gel já estava pronto e foram pipetados o controle negativo no primeiro poço e
nos dois poços seguintes, a amostra.
4. Resultado e discussão
Visualização em luz ultravioleta:
Foi possível visualizar o marcador e a amplificação da amostra.
5. Referências bibliográficas:
HENRY A. , Erlich. Basic Methodology. In: HENRY A. , Erlich (ed.). PCR
Technology: Principles and Applications for DNA Amplification. Londres: Macmillan
Publishers, 1989. cap. 1, p. 1-5. ISBN Online 978-1-349-20235-5. Site.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Curso: Biomedicina
Disciplina: Biologia molecular
SDS-PAGE - Eletroforese de proteínas
Jéssica Ferreira Santos
Goiânia, 2022.
1. Introdução:
Os métodos de extração de proteínas são utilizados dado a
necessidade de lisar a parede das proteínas, podendo ser por lise
mecânica: agitação, pérolas de vidro, maceração com nitrogênio líquido, ou
por extração química, como agente químico que remove proteínas
específicas, parede celular, entre outros. Assim, os principais métodos de
extração de proteínas utilizados são o método de SDS -PAGE ou de
Western blot.
O método de SDS-PAGE foi desenvolvido em 1970, por Laemmli e é
uma das técnicas mais utilizadas, em que a separação das proteínas
ocorre por diferença da massa molecular. Essa técnica consiste em uma
eletroforese em gel de poliacrilamida, em que o gel e o tampão
possuem SDS, que é utilizado para desnaturar a proteína, deixá-la mais
linear. Dado isso, para realização do método é necessário, a preparação
do gel de poliacrilamida desnaturante, o qual possui carga negativa e , por
isso, carregará as proteínas negativamente; preparo das amostras, o qual
desnaturar as proteínas através de agentes químicos e físicos, além de
cores proteínas para que sejam vistas durante a corrida eletroforética;
corrida eletroforética, processo que as proteínas migram para o polo
positivo do gel,baseado na migração das moléculas, que dependerá de sua
velocidade de migração. Sendo assim, essa corrida ocorre com um
tampão contendo TRIS-GLICINA, o qual atua na etapa de concentração
e durante esse passo, para o auxílio, é utilizado beta-mercaptoetanol,
que é um agente redutor, que diminui as pontes de sulfeto, o que
auxilia na locomoção dessa proteína no gel. Por fim, tem-se a revelação,
a qual obtém o resultado da eletroforese.
2. Metodologia:
Inicialmente foi realizada a confecção do gel SDS-PAGE.
Assim,preparou-se dois géis, o gel de separação 12% e o gel de
concentração 4%.
GEL 12% 4%
H2O DES. 3,4 ML 4,2 ML
TRIS 2M 1,5 ML -
TRIS 1M - 510 µL
BIS-ACRIL 2,3 ML 600 µL
SDS 20% 195 µL 120 µL
PERSULFATO AMÔNIO 30 µL 60 µL
TEMED 6 µL 9 µL
Na montagem da cuba foi necessário colocar o pente no vidro cortado e medir,
colocar os espaçadores, o maior na parte debaixo e os outros dois na lateral,
colocar o outro vidro e por fim colocar as presilhas. Selar com o ágar nas laterais e
embaixo, em seguida, colocar água para verificar se está vazando ou não.
Figura 1: Colocação das presilhas.
Figura 2: Selagem com o ágar.
O TEMED é pipetado no gel de 12% primeiro e só depois desse gel solidificar
que é colocado o TEMED no gel de 4%, para que ele não solidifique dentro do tubo
de ensaio. Caso tenha bolhas é preciso dar umas batidinhas para que as bolhas
subam e sumam.
Nesse gel utilizamos uma seringa para fazer a aplicação das amostras, foi
retirado o pente com os espaçadores para fazer essa aplicação das amostras e
após a pipetagem das mesmas, o sistema foi ligado (indo do polo negativo para o
polo positivo). A parte do vidro que é menor fica para a parte de trás da cuba e o
ágar é passado novamente na placa para selar os espaços entre a cuba e a placa.
Foi colocado tampão com SDS e água para ligar o sistema e começar o processo.
Figura 3: Sistema pronto.
O primeiro gel foi deixado na voltagem de 100V, no segundo gel a voltagem foi
aumentada para 150V, depois da corrida foi deixado no corante para saber os
resultados.
3. Resultados e discussões:
Figura 4: Gel de SDS-PAGE
corado com azul de cromassil indicando presença de diversas proteínas na
amostra analisada
Foi possível definir que há diversas proteínas na amostra, com
pesos moleculares diferentes. Fica evidente que o método de visualização
em gel SDS-PAGE é eficaz e útil na avaliação quantitativade proteínas.
Sendo assim, é possível aferir peso molecular e quantidade das
proteínas presentes na amostra analisada sempre que o gel estejam
acompanhado da amostra controle para fazer as comparações
necessárias.
4. Referências bibliográficas:
PRINCÍPIOS da Técnica de Eletroforese. Paraná: KASVI, 3 mar. 2016. Disponível
em:https://kasvi.com.br/principios-da-tecnica-de-eletroforese/#:~:text=A%20eletrofor
ese%20%C3%A9%20um%20m%C3%A9todo,acordo%20com%20a%20sua%20car
ga. Acesso em: 30 ago. 2022.