1 Métodos e técnicas em análises clínicas

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1 - Métodos e Técnicas em 
Análises Clínicas(MTANC)
CONTEÚDO PROGRÁMATICO 
 O profissional do laboratório clinico; terminologia
médica, Avaliação da qualidade no laboratório
(sensibilidade, especificidade, precisão e
exatidão na etapa analítica).
 Bioquímica: testes laboratoriais remotos;
técnicas analíticas usadas (ponto final, cinético,
histoquímico, imunohistoquímico...etc).
 Técnica e testes rápidos de hemostasia,
enfocando possíveis distúrbios de coagulação.
(Tempo de sangramento, tempo de protrombina.
 Marcadores laboratoriais nas provas de
inflamação e nas doenças Auto imunes
 Técnicas de cultura para bactérias; preparando e
corando por Gram e outras colorações
especificas em microbiologia; Meios de cultura
de utilizados para secreções, urina, fezes -
coleta, preparo, Cultura de orofaringe e testes
rápidos para Streptocccus do grupo A;
automação em microbiologia para diversos tipos
de bactérias.
 Hematologia: Enfocar alterações qualitativas e 
quantitativas dos leucócitos. Princípios de 
Automação em hematologia; Contagem manuais 
e automatizadas. Eritograma - hematócrito, VCM, 
CHCM, HCM, RDW relacionando com as 
diferentes anemias ou outros distúrbios. 
Princípios de Automação em hematologia; 
Contagem manuais e automatizadas. Esfregaço 
sanguíneo e micro hematócrito. Discutir algumas 
alterações nestes exames mediante a 
revisão/aula vista em sala de aula.
 Parasitologia: Enfocar as técnicas Faust, Willis, 
Kato-Katz, Hoffman, Rugai, gota espessa, teste 
de sangue oculto nas fezes. Interpretação das 
principais infecciosas parasitárias (malária, 
doença de chagas, toxoplasmose, parasitoses 
intestinais).
 Uroanálise: (exame físico, químico e 
microscópico) Interpretação de exames 
laboratoriais utilizados para avaliar as alterações 
da função renal.
Bibliografia Básica
 FERREIRA, A. W.; ÁVILA, S.L.M. Diagnóstico Laboratorial das Principais 
Doenças Infecciosas e Auto-Imunes. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 3 
Ed. 2013.

 LIMA, A.O.; SORARES, J.B.; GRECO, J.B.; GALIZZI, J.; CANÇADO, J.R.
Métodos de Laboratório Aplicados à Clínica – Técnica e Interpretação. Rio 
de Janeiro: Guanabara Koogan. 2008.

 RAVEL, R. Laboratório Clínico – Aplicações Clínicas dos Dados 
Laboratoriais. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2009. 
Bibliografia Digital
 XAVIER, R.M.; DORA, J.M.; SOUZA, C.F.M.; BARROS, E. e COLs. Laboratório 
na prática clínica. Artmed, 2011. (Minha Biblioteca)
 MCPHERSON, R. A.; PINCUS, M. R. Diagnósticos clínicos e tratamento por 
métodos laboratoriais de Henry. 21ª ed. Barueri: Manole, 2012. (Minha 
Biblioteca)
 NICOLL, D. MCPHEE, S. PIGNONE, M. Manual de exames diagnósticos. 
Traduc ̧ão Ivan Carlquist, Ane Rose Bolner. 4. ed. Porto Alegre: Artmed, 
2006. (Minha Biblioteca)
Definição: Técnicas e atividades operacionais
utilizadas para monitorar o cumprimento dos
requisitos da qualidade especificados.
Monitora a precisão e exatidão através de
ferramentas de estatística.
PADRONIZAÇÃO NO LABORATÓRIO CLÍNICO
 Na realização de um exame pelo Laboratório Clínico temos 
que considerar as seguintes etapas:
 1- Etapa Pré-Analítica
 2- Etapa Analítica
 3- Etapa Pós-Analítica
 Para se obter qualidade nos exames realizados, é preciso 
que se faça uma padronização dos processos envolvidos 
desde a solicitação médica dos exames até a liberação do 
laudo.
Laboratório convencionalde análisesclínicas.
Onde é feito cada exame laboratorial
Setor
Bioquímico
Realiza os exames básicos de bioquímica,como por exemplo:
Glicose 
Colesterol 
Gama GT 
Magnésio 
Ureia 
Acido Úrico 
Ferro
Fal 
TGP 
TGP
....
Esses Exames são realizados em equipamentos que são automáticos 
Ou semiautomáticos.
A reação acontece com o soro +reagente.
Setor
Hematológico
A hematologia é umaárea que estuda, principalmente, as doenças 
do sangue.Suaespecialidade é identificar doençasque acometemo 
sangue, através do estudo dos glóbulos vermelhos (hemácias), 
glóbulos brancos (leucócitos)e plaquetas.
Esses exames podem ser feito de forma manual ou de forma 
automática (em equipamentos) + conferida do analista clínico.
Usado o sangue total nos tubos com EDTA ou Citrato.
Setor
Imunológico
Usado geralmente analisadores imunológicos totalmente
automatizado que permitem a realização de testes de
imunologia ehormônios.
Exemplo de exames :
AFP
CA 125 II
CA 15-3
Pepsinogênio I
Pepsinogênio II
PIVKA-II
ProGRP 
PSA, Livre 
PSA, Total 
SCC
Anti-HAV IgG (HAVAB IgG) 
Anti-HAV IgM (HAVAB IgM)
Cortisol 
Ferritina 
Folato 
HbA1c
Usado geralmente o tubo amarelo ou vermelho.
Setores de Urinálise e Parasitológicos
Interferentes
Pedido médico de exame
Preparo do paciente
Obtenção da amostra
Procedimento de análise
Pós-análise
Resultado
Pré-analítico
Erro: ~60-70%
Analítico
Erro: ~20-30%
Pós-analítico
Erro: ~10%
Interferentes pré-analíticos 
 São exemplos de interferentes: 
 Atividade Física
 Idade
 Gênero
 Dieta
 Jejum
 Variação Circadiana
 Ingestão de Álcool.
 Hemólise
 Lipemia
Etapas Analíticas
 Etapas nas quais são realizadas as analises laboratoriais.
✓ Metodologia Técnico cientifica comprovadas, acrescida de controle 
estatístico do processo;
✓ Instrumentos interfaciados para registro da analise.
Processos Analíticos
 As diversas variáveis analíticas na realização de um exame laboratorial
devem ser muito bem controladas para assegurar que os resultados
sejam precisos e exatos.
 Os métodos analíticos, antes de serem implantados na rotina laboratorial,
devem ser analisados em relação aos seguintes critérios:
 1- Confiabilidade: precisão, exatidão, sensibilidade, especificidade,
linearidade.
 2- Praticidade: Volume e tipo de amostra, duração do ensaio,
complexidade metodológica, estabilidade dos reagentes, robustez,
necessidade de equipamentos, custo, segurança pessoal.
 A maioria das técnicas laboratoriais que são feitas de rotina na
área de pesquisa ou diagnóstico são fundamentadas seguindo
metodologias que consideram o uso de antígenos e anticorpos.
O uso de anticorpos depende da habilidade que eles têm em
se ligar especificamente com o antígeno para produzir
complexos imunológicos, em soluções ou em géis, que podem
ser verificados em inúmeros métodos óticos e que atualmente
podem ser automatizados.
 A seguir, mencionaremos as técnicas imunológicas/ sorológicas
que são utilizadas com frequência nos laboratórios clínicos.
Técnicas mais Utilizadas 
 Métodos de Diagnóstico Sorológico 
 Técnicas Sorológicas Tradicionais 
 Método de Diagnóstico Molecular 
 Técnicas mais usadas 
 Métodos de Diagnóstico Imuno-Histoquimico
 Método de Diagnóstico Microscópico 
 Vantagens e Desvantagens dos Métodos Moleculares em Relação aos 
Sorológicos 
 Processos gerais em Biomol (PCR-C e PCR-RT) Virologia Clínica 
www.posugf.com.br 
 Reação em Cadeia da Polimerase Convencional (PCR-C) 
Métodos de Diagnóstico Sorológico 
 • Reação da inibição da hemaglutinação. 
 • ELISA. 
 • Imunocromatografia. 
 • Imunoblot (Western Blot). 
Princípio das técnicas sorológicas
 Interação antígeno (presentes nos reagentes) e anticorpo (presentes na 
amostra biológica. 
 Antígeno: qualquer substância que, sob condições apropriadas, é capaz 
de estimular a formação de anticorpos.

 Anticorpo: proteína que é formada em resposta à exposição de um 
antígeno e reage especificamente com este, formando imunocomplexos. 
Importância dos testes sorológicos na 
Patologia Clínica: 
 Elucidar processos patologicos com sintomas e sinais clínicos confundíveis.
 Diferenciar a fase da doença (aguda ou crônica).
 Diagnosticar doença congênita.
 Selecionar doadores e receptores de órgãos para transplantes.
 Avaliar a evolução e o prognóstico da doença.
 Avaliar a eficácia da terapêutica ou sua suspensão.
 Avaliar a imunidade ativa específica naturalmente adquirida ou
artificialmente induzida (vacinas).
 Verificar o agravamento da doença.Forças de ligação envolvidas
nas reações:
 Conjunto de reações fracas que 
estabilizam a ligação entre 
moléculas de antígenos e de 
anticorpos:
 Pontes de hidrogênio
 Ligações iônicas
 Forças de Van der Waals
Forças de ligação envolvidas nas 
reações:
 Forças de Van der Waals: As
forças de atração ou repulsão
entre entidades moleculares (ou
entre grupos dentro da mesma
entidade molecular) diferentes
daquelas que são devidas à
formação de ligação ou a
interação eletrostática de íons ou
grupos iônicos uns com os outros
ou com moléculas neutras.
Força entre dipolos permanentes
forças de dispersão
Forças de ligação envolvidas nas 
reações:
 Ligações de Hidrogênio
 A ligação de hidrogênio só pode
ocorrer quando o hidrogênio
estiver ligado a um átomo
pequeno e muito eletronegativo,
como F, O, N, Cl, etc. Quando o
hidrogênio está ligado a um
átomo muito eletronegativo, a
densidade eletrônica em torno
do próton fica bem baixa
As ligações de
hidrogênio representam
importante papel tanto
nas propriedades
especiais da água como
em moléculas de
extrema importância
para os seres vivos: elas
determinam a forma das
proteínas, e constituem
a força que une as
hélices do DNA.
http://www.infoescola.com/biologia/dna/
Fatores que interferem na 
ligação entre Ag e Ac
  Especificidade dos anticorpos
  Afinidade dos Ac
  Avidez dos Ac
  Concentração dos Ac e antígenos
  Classe dos anticorpos envolvidos
  Pureza dos antígenos utilizados
Características importantes nos testes 
sorológicos na Patologia Clínica: 
 Essas duas características, sensibilidade e especificidade, são importantes 
pois podem influenciar diretamente num resultado confiável. Porém temos 
outros parâmetros que devem ser verificados para validação de um teste 
assim como em todo ensaio laboratorial: 
 Precisão. 
 Acurácia e exatidão. 
 Reprodutibilidade.
Os testes são utilizados no diagnóstico 
clínico, na triagem e na pesquisa
▪ Concebido como um teste laboratorial, também se aplica à 
informação obtida na história, exame físico ou raio x, etc. 
▪ Um teste de diagnóstico determinar presença ou ausência da 
doença quando um individuo apresenta sinais ou sintomas da 
doença
▪ Um teste de triagem identifica indivíduos assintomáticos que 
podem ter a doença
▪ O teste diagnóstico é realizado após um teste de triagem positivo 
para estabelecer um diagnóstico definitivo
Estabelecer um diagnóstico
Estabelecer um diagnóstico é um processo imperfeito:
probabilidade e não certeza
Assim, a possibilidade de um paciente ter a doença é expressa como 
probabilidade
Serve para comparar com o teste em questão e avaliar sua
exatidão.
MAS
O uso de testes mais simples que o padrão-ouro é feito sabendo-se que 
isso resulta em certo risco de diagnóstico incorreto
Esse risco é justificado pela segurança e conveniência do teste mais 
simples
Frequentemente difícil de ser encontrado
Teste padrão (“padrão ouro”)
Sensibilidade
 A sensibilidade de um imunoensaio refere-se à porcetagem de resultados
positivos pelo teste na população de doentes, ou seja, a proporção de
resultados verdadeiramente positivos, evitando os falsos-negativos. A alta
sensibilidade de um teste diminui a janela imunológica de uma doença. A
janela imunólogica compreende o período em que a infecção se instala e
o organismo começa a produzir anticorpos suficientes para ser detectados
num imunoensaio.
Especificidade
 A especificidade de um imunoensaio é definida pela percentagem de
resultados negativos pelo teste nos individuos não doentes, ou seja, a
proporção dos verdadeiros negativos, e pode ser influenciada por
inúmeros fatores que levam a resultados falso-positivos (anticorpos
heterófilos > reações cruzadas).
SENSIBILIDADE/ESPECIFICIDADE
 SENSIBILIDADE: é a probabilidade de um teste dar POSITIVO dado que o 
individuo tenha a doença.
 VP/TOTAL DE DOENTES
 ESPECIFICIDADE: é a probabilidade de um teste dar NEGATIVO dado que 
o individuo NÃO tenha a doença.
 VN/TOTAL DE NÃO DOENTES
resultado 
DOENÇA
DOENTE Não 
doente
TESTE
+ 90 10
- 10 90
100 100 200
Um teste é aplicado em 100 pessoas com (+) doença e 100 pessoas sem (-) a 
doença.
resultado 
DOENÇA
DOENTE Não 
doente
TESTE
+ 90 VP 10FP
- 10FN 90VN
100 100 200
Um teste é aplicado em 100 pessoas com (+) doença e 100 pessoas sem (-) a 
doença.
 Sensibilidade: VP/Doentes=90%
 Muito sensível detecta bem os doentes FP 
 Especificiadade: VN/ND =90% FN
A Relação entre Doença e Teste
Doença
 
+ - 
 + 
Verdadeiro 
positivo 
Falso 
positvo 
 - 
Falso 
negativo 
Verdadeiro 
negativo 
 
 PRESENTE AUSENTE 
 
Total 
 
 
 POS 
a 
 verdadeiro 
positivo 
b 
falso 
positivo 
a + b 
TESTE 
NEG 
c 
falso 
negativo 
d 
verdadeiro 
negativo 
c + d 
 Total a + c b + d a + b + c + d 
 
DOENÇA*
Sensibilidade = a / (a + c)
Especificidade = d / (b + d)
Sensibilidade e Especificidade
*como não se tem certeza da presença ou não da doença, utiliza-se o 
melhor teste disponível para avaliar um novo teste diagnóstico → teste 
padrão ouro
Sensibilidade (S): é a probabilidade de um teste dar positivo na 
presença da doença, isto é, avalia a capacidade do teste detectar a 
doença quando ela está presente. 
S = 
ca
a
+
 
 
 
Especificidade (E): é probabilidade de um teste dar negativo na ausência 
da doença, isto é, avalia a capacidade do teste afastar a doença quando 
ela está ausente. 
E = 
db
d
+
 
 
Sensibilidade Especificidade 
Conceito Identifica os 
DOENTES 
Identifica os 
SAUDÁVEIS
Fórmula Verdadeiro 
Positivo/doente
Verdadeiro 
Negativo/saudáveis
Pode ocasionar Falso positivo Falso Negativo
É útil para Triagem Confirmação
Melhor resultado Negativo Positivo
Sensíveis
▪ Para doença perigosa ou 
grave, mas tratável 
▪ Para excluir doenças 
(rastreamento)
▪ Probabilidade da doença é 
baixa mas o objetivo é excluir 
a doença – banco de sangue, 
ex. periódicos
▪ Dá poucos Falsos Negativos
Específicos 
 Quando um resultado FP pode 
ocasionar danos físicos, 
morais ou financeiros ao 
paciente
 Quando o tratamento é 
requer medidas mais 
agressivas ou invasivas, como 
uma quimioterapia ou cirurgia
 Dá poucos Falsos Positivos 
Uso dos testes
A escolha entre um ponto de corte alto
ou baixo depende da importância que
nós damos aos falsos positivos e falsos
negativos para a doença em questão
Curva Roc
 Geralmente, a sensibilidade e a especificidade são características difíceis 
de conciliar. É complicado aumentar a sensibilidade e a especificidade 
de um teste ao mesmo tempo. 
 As curvas ROC (receiver operator characteristic curve) são uma forma de 
representar a relação, normalmente antagônica, entre a sensibilidade e a 
especificidade de um teste diagnóstico quantitativo, ao longo de um 
contínuo de valores de "cutoff point". 
 Para construir uma curva ROC traça-se um diagrama que represente a 
sensibilidade em função da proporção de falsos positivos (1-
Especificidade) para um conjunto de valores de "cutoff point". 
Curva Roc (receiver operator
characteristic curve)
 As curvas ROC descrevem a capacidade discriminativa de um 
teste diagnóstico para um determinado número de "cutoff point". 
 Assim podemos otimizar os valores da S e da E. O ponto, numa 
curva ROC, onde isto acontece é aquele que se encontra mais 
próximo do canto superior esquerdo do diagrama (ponto B da 
curva 2). 
 As curvas ROC permitem quantificar quanto um teste é exato. Essa 
exatidão é proporcional à área sob a curva ROC.
 Quanto mais a curva se aproxima do canto superior esquerdo do 
diagrama, maior a área sob a curva e maior exatidão tem o teste. 
Um teste é aplicado em 
100 pessoas com uma doença e 100 pessoas sem a doença.
A linha verde na vertical represente o critério de diagnóstico ou cut-off
cut-off (ou cutoff)
 Definições:
 Ponto da resposta analíticade um teste abaixo do qual o resultado de um
teste qualitativo é convertido em “negativo” e acima do qual o resultado
é determinado como “positivo” ( ou vice-versa). Para um teste
verdadeiramente qualitativo, o cut-off é o único ponto de decisão
médica. Para um teste qualitativo derivado da dicotomização de um teste
de um teste quantitativo ou de uma escala ordinal, há muitos pontos
possíveis para o cut-off.
 Concentração de um analito na qual testes repetidos geram resultados
positivos 50% das vezes e resultados negativos também em 50% das vezes.
Reprodutibilidade
 Obtenção de resultados iguais em testes realizados com a mesma amostra
biológica, quando feitos por diferentes pessoas em diferentes locais e se garante
quando a precisão exatidão são sempre validadas.
 Variação : ocorre aparelhos bem calibrados, reagentes confiáveis, erros humanos.
Reprodutibilidade
  Refere-se à obtenção de resultados iguais em testes 
realizados com a mesma amostra, por pessoas diferentes 
em locais diferentes.
Linearidade
 A capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os 
resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do 
analito na amostra, dentro de um intervalo especificado.
Exatidão ou Acurácia
 Capacidade de obter 
resultados próximo ao valor 
de um método de 
referencia. 
 Geralmente a media dos 
valores encontrados são 
mais próximas do real.
Preciso e Exato
Exatidão ou acurácia
 Determina a capacidade do teste em 
fornecer resultados muito próximos 
ao verdadeiro valor do que está 
sendo medido. Detecta erro do 
sistema ou tendência de desvio.
A B
Precisão
Capacidade de 
reproduzir 
resultados muito 
próximos em 
análises repetidas 
de uma mesma 
amostra analisada.
È medida pelo 
Desvio Padrão e 
CV em replicata 
de ≥ 20 repetições
Precisão
 Expressa a concordância dos resultados 
obtidos após várias repetições e traduz a 
possibilidade de erro acidental do
método.
 Quanto maior a precisão do teste, menor
a influência que sofre das condições de 
execução (temperatura, pH, manuseio, 
tempo, etc)
A B
Reação-cruzada
 Uma reação cruzada é resultado da 
similaridade tridimensional entre 
duas moléculas de antígenos
diferentes.
 Assim, um Ac gerado contra uma das 
moléculas pode reagir com a outra, ainda 
que sua afinidade seja mais baixa.
 Um exemplo prático das reações cruzadas é
a que se observa entre alguns anticorpos 
contra leishmania que reagem 
cruzadamente com antígenos de
tripanossomas
Como são definidos e o que eles
representam?
□ Teórica e idealmente, os valores deveriam ser estabelecidos de acordo com a população em 
específica.
Valor de REF X
Valor de REF y
VR
 95%
 Na prática, os valores são definidos pelas bulas dos reagentes.
 As bulas retiram esses valores de basicamente 2 grupos.
 Estudo Populacional amplo x Estudos sobre condições clínicas. Ex: 
Glicemia em jejum, lipídeos sem jejum, troponinas em iAm;
 Quando comparamos esses dois grupos, muitos analitos tem o potencial 
de sofrer alterações nas concentrações séricas.
 *Analitos = Itens a serem analisados.
O ideal seria uma análise longitudinal da pessoa, ou seja, uma avaliação 
em série para determinar o padrão do indivíduo para determinar as 
variações ao longo do tempo.
Interatividade
 A capacidade do método de fornecer resultados muito próximos ao valor 
verdadeiro do parâmetro mensurado denomina-se
 a) Exatidão.
 b) Precisão.
 c) Valor preditivo positivo.
 d) Valor preditivo negativo.
interatividade
 A capacidade do método de fornecer resultados muito
 próximos ao valor verdadeiro do parâmetro mensurado
 denomina-se
 a) Exatidão.
 b) Precisão.
 c) Valor preditivo positivo.
 d) Valor preditivo negativo.
Biomedico -ufrj
 Os métodos imunológicos diretos ou indiretos têm sido muito empregados
para detectar antígenos, anticorpos ou imunocomplexos relacionados
com a existência de infecções. Atualmente eles se caracterizam pela
simplicidade e rapidez de execução, possibilidade de automoção e baixo
custo operacional. Na padronização de um teste, é importante selecionar
populações de indivíduos seguramente doentes e não doentes a fim de se
estabelecerem os parâmetros sorológicos conforme leitura da tabela a
seguir:
-
-
Sobre a forma de se calcular os parâmetros sorológicos é 
correto afirmar:
A) Sensibilidade = A/(A+B).
B) Especificidade = D/(B+D).
C) Eficiência = (B+C/(A+B+C+D).
D) Sensibilidade = D/(B+D).
E) Especificidade = A/(A+C).
-
-
Sobre a forma de se calcular os parâmetros sorológicos é 
correto afirmar:
A) Sensibilidade = A/(A+B).
B) Especificidade = D/(B+D).
C) Eficiência = (B+C/(A+B+C+D).
D) Sensibilidade = D/(B+D).
E) Especificidade = A/(A+C).
Refere-se à obtenção de resultados iguais em testes realizados com a mesma
amostra, por pessoas diferentes em locais diferentes. Refere-se a:
 1. Precisão; 
 2. Reprodutibilidade;
 3. Exatidão; 
 4. Variância
Refere-se à obtenção de resultados iguais em testes realizados com a mesma 
amostra, por pessoas diferentes em locais diferentes. Refere-se a:
 1. Precisão; 
 2. Reprodutibilidade; 
 3. Exatidão; 
 4. Variância
Para Refletirmos... 
 “O Domínio de uma profissão, não exclui o seu aperfeiçoamento, ao
contrário, será mestre quem continuar aprendendo”
Pierre Fourter.
bibliografia
 Diagnóstico laboratorial das principais doenças infecciosas e auto-imunes : 
autores Walter Ferreira e Sandra Avila
 Leitura cap 1