Relatório MIA

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UNIVERSIDADE PAULISTA- UNIP
 FARMÁCIA
 RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA
 MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
 MARCELA ALVES DE OLIVEIRA
 RA: 0410288 
 POLO: PARAÍSO/VERGUEIRO
 SÃO PAULO
 2022
1. INTRODUÇÂO
	A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), assegura que a validação de um método inicia a partir do planejamento da estratégia analítica até a transferência. Para garantir que um método analítico gere resultados confiáveis, se faz necessário analisar alguns aspectos, como seletividade, precisão e exatidão (PEREZ,2010).
	Para assegurar um controle de qualidade de medicamentos é obrigatório a identificação e a quantificação das substâncias químicas presente em fórmulas farmacêuticas, como comprimidos, pomadas, cremes que contenham o fármaco com realização de análises químicas e físicas (NEVES,2020).
O controle de qualidade de medicamentos consiste em um conjunto de medidas tomadas para verificar a qualidade do medicamento, dos produtos biológicos e insumos, com o objetivo de analisar se o mesmo satisfaz os critérios de atividade, pureza, eficácia e segurança (SILVA,2017).
	Na primeira aula de laboratório utilizamos a espectrofotometria como método instrumental para analisar o alaranjado de metila. A espectrofotometria consiste em uma técnica analítica muito utilizadas para determinações quantitativas de espécies químicas, devido à robustez, instrumentação relativamente simples e de baixo custo e ao grande número de aplicações desenvolvidas. Esta técnica se baseia na medida da absorção de radiação eletromagnética nas regiões visível e ultravioleta por espécies químicas (moléculas ou íons) em solução (FILHO et.al, 2010).
	Outro método instrumental de analíse utilizado foi a cromatografia. Essa técnica  tem por finalidade geral duas utilizações, a de identificação de substâncias e de separação-purificação de misturas. Usando propriedades como solubilidade, tamanho e massa. Dependendo da natureza dessas fases, tem-se diversas cromatografias: sólido-líquido (coluna, camada fina ou delgada, papel); líquido-líquido (CLAE – cromatografia líquida de alta eficiência); gás-líquido (CG – cromatografia gasosa (SERAFIM, 2018).
2. DESCRIÇÃO DA AULA PRÁTICA
2.1 AULA-1: ESPECTRO DE ABSORÇÃO E ANÁLISE DE AMOSTRA DESCONHECIDA 
 	Teve como objetivo efetuar a varredura de comprimento de onda na região visível do espectro eletromagnético para uma solução aquosa de alaranjado de metila utilizando o espectrofotômetro UV-VIS e determinar o comprimento de onda de máxima absorbância dessa substância
PROCEDIMENTO:
Parte I: Determinação do espectro de absorção
Ajustamos o comprimento de onda no aparelho para 400 nm. Adicionamos água destilada a uma cubeta, para calibrar o espectrofotômetro, com auxílio de um papel-absorvente limpamos a cubeta e introduzimos no compartimento do espectrofotômetro. 
	Em outra cubeta adicionamos solução de alaranjado de metila (4,0 mg/L) e introduzimos no compartimento do espectrofotômetro. Esse processo foi realizado para vários comprimentos de onda e anotado os resultados, conforme tabela abaixo: 
Tabela 1: Varredura de absorbância em diferentes comprimentos de onda para análise de solução de alaranjado de metila 4,0 mg/L.
	λ (nm)
	A (nm)
	400
	0,145
	410
	0,157
	420
	0,183
	430
	0,190
	440
	0,208
	450
	0,226
	460
	0,231
	470
	0,223
	480
	0,228
	490
	0,190
	500
	0,152
	510
	0,108
	520
	0,075
	530
	0,046
	540
	0,028
	550
	0,012
	560
	0,08
	570
	0,005
	580
	0,003
	590
	0,004
Após a determinação da absorção, construímos um gráfico que representa o espectro eletromagnético de absorção do alaranjado de metila, tendo a absorbância (A) como ordenada e comprimento de onda (λ) como abscissa. 
Ao analisar a tabela e o gráfico acima, podemos observar que o valor do comprimento de onda de máxima absorbância para o alaranjado de metila foi de 460 nm
PARTE II: Determinação da absorbância de amostras com concentração desconhecida de alaranjado de metila.
Ajustamos o comprimento de onda correspondente à máxima absorção para o alaranjado de metila (460nm), definido após análise dos resultados da Parte I. Calibramos o espectrofotômetro com uma cubeta com água destilada e após adicionamos a solução de alaranjado de metila (4,0 mg/L) em outra cubeta e introduzimos no compartimento do espectrofotômetro. O resultado foi da absorbância foi de 0,231.
Após realizamos o cálculo de concentração de uma amostra desconhecida. No qual achamos a concentração de 2,92 desta amostra, conforme cálculo abaixo:
0,173 = 0.0595 x C – 0,0011
0,173 + 0,0011 = 0,0595 C
C = 0,1741 ÷ 0,0595
C = 2,92
AULA 2: CONSTRUÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA ANÁLISE DE ALARANJADO DE METILA 
Este experimento teve como objetivo construir a curva de calibração (concentração em função da absorbância) para a análise do alaranjado de metila por espectrofotometria.
PROCEDIMENTO
Parte I: Preparo de solução de alaranjado de metila em balões volumétricos
Transferimos parte da solução estoque de alaranjado de metila (10 mg/L) para um béquer de 50 mL. Após identificamos quatro balões volumétricos de 50 mL, indicando as concentrações, como representado a seguir. Utilizamos a expressão para cálculos de diluição C1.V1 = C2.V2, para determinar o volume de solução estoque a ser adicionado em cada balão volumétrico para obter a concentração final desejada. 
Resultados das concentrações:
	Concentração (mg/L)
	V estoque (mL)
	1,0
	5
	2,5
	12,5
	5,0
	25
	8,0
	40
Após calcularmos as concentrações, transferimos, com auxílio de pipeta graduada, o volume de solução estoque calculado para o balão volumétrico correspondente e completamos com água destilada até o menisco.
Parte 2: Dosagem dos padrões em espectrofotômetro
Ajustamos o comprimento de onda no aparelho para 460 nm. E com uma cubeta contendo água destilada calibramos o equipamento. Após com auxílio da micropipeta automática, adicionamos as soluções preparadas, uma a uma, à cubeta e efetuamos a leitura da absorbância para cada uma das soluções e anotamos os valores na tabela a seguir, iniciando pela solução de menor concentração. 
 Tabela: Resultados de Absorbância (A) para as soluções de diferentes concentrações de alaranjado de metila
	C(mg/L)
	A
	1,0
	0.060
	2,5
	0.169
	5,0
	0.280
	8,0
	0.462
	10,0
	0.597
CONSTRUÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO E EQUAÇÃO DA RETA
AULA 3: AVALIAÇÃO DA SELETIVIDADE DO MÉTO ESPECTROFOTOMÉTRICO DE DOSAGEM DE ALARANJADO DE METILA.
Teve como objetivo realizar os ensaios de seletividade, precisão e exatidão para a validação parcial do método instrumental de quantificação do teor de alaranjado de metila em solução.
PROCEDIMENTO:
PARTE I: Preparo de solução de alaranjado de metila 4,0 mg/L (amostra)
Essa solução já estava preparada para realizarmos os demais procedimentos.
PARTE II: Ensaio de seletividade
Nomeamos dois tubos de ensaio como: tubo A e tubo B. No tubo A colocamos com auxílio de micropipeta automática, 2mL da solução de alaranjado de metila 4,0mg/L. No tubo B, com auxílio da micropipeta automática adicionamos 1 mL da solução de alaranjado de metila 4,0 mg/L e 1 mL da solução de referência de alaranjado de metila (5,0mg/L).
	Após ajustamos o comprimento de onda no aparelho para 460nm e calibramos com uma cubeta contendo água destilada. Colocamos uma cubeta contendo solução do tubo A e fizemos a leitura (0,225) e depois ajustamos o zero novamente com a cubeta contendo água e medimos a absorbância do tubo B colocando uma quantidade da amostra em uma cubeta e anotamos o resultado (0,253).
TABELA DE RESULTADOS
	Tubo
	Absorbância (A)
	A
	A = 0,225
	B
	B = 0,253
	
	P = AP – A = 0,028
Utilizamos o resultado para calcular a porcentagem de recuperação e avaliação da seletividade do método de acordo coma RDC 196/2017, utilizando a fórmula a seguir:
 %Recup = AP – A X 100
 P
 %Recup = 0,253 – 0,225 x 100
 0,028
 % Recup = 100 %
No método da adição padrão, os valores aceitos são entre 80% - 120% de recuperação, logo o experimento realizado está dentro do padrão.
AULA 4: AVALIAÇÃO DA PRECISÃO E EXATIDÃO DO MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO DE ALARANJADO DE METILA
Teve como objetivo realizar os ensaios de precisão e exatidão para a validação parcial do método instrumental.
PROCEDIMENTO:
PARTE I: Ensaio de precisão e exatidão
Realizamos três cálculos de concentração:
Cálculo 1: teor de 80 % da concentração da solução de alaranjado de metila com concentração 4,0 mg/L.
C1 . V1 = C2 . V2
10 . V1 = 3,2 . 100
V1 = 32 mL
Transferimos 32 mL da solução referência (10,0 mg/L) para um balão volumétrico de 100 mL e completamos com água destilada até menisco, após medimos três vezes (descartando e colocando a solução na cubeta e fazendo o ajuste no zero) as absorbâncias das soluções resultantes em 460 nm e registamos a medida, conforme tabela a seguir:
Tabela 1: Absorbância obtida pela leitura de solução de alaranjado de metila.
	Replicata (80% da concentração)
	Absorbância (A)
	1
	0,179
	2
	0,178
	3
	0,181
	Média
	0,538
	Concentração (mg/L)
	3,2 mg/L
Cálculo 2: teor de 120 % da concentração da solução de alaranjado de metila com concentração 4,0 mg/L.
C1 . V1 = C2 . V2
10 . V1 = 4,8 . 100
V1 = 48 mL
Transferimos 48 mL da solução referência (10,0 mg/L) para balão volumétrico de 100 mL e completamos o volume com água destilada. Após medimos três vezes (descartando e colocando novamente a solução na cubeta e fazendo o ajuste do zero) as absorbâncias das soluções resultantes em 460 nm, utilizando água destilada para ajuste do zero. Registramos as medidas de Absorbância (A) na tabela a seguir. 
Tabela 2: Absorbância obtida pela leitura de solução de alaranjado de metila.
	Replicata (120% da concentração)
	Absorbância (A)
	1
	0,272
	2
	0,269
	3
	0,268
	Média
	0,269
	Concentração (mg/L)
	4,8 mg/L
Cálculo 3: teor de 100 % da concentração da solução de alaranjado de metila com concentração 4,0 mg/L.
C1 . V1 = C2 . V2
10 . V1 = 4 . 100
V1 = 40 mL
Transferimos 40 mL da solução referência (10,0 mg/L) para balão volumétrico de 100 mL e completamos o volume com água destilada. Após medimos três vezes (descartando e colocando novamente a solução na cubeta e fazendo o ajuste do zero) as absorbâncias das soluções resultantes em 460 nm, utilizando água destilada para ajuste do zero. Registramos as medidas de Absorbância (A) na tabela a seguir. 
Tabela 3: Absorbância obtida pela leitura de solução de alaranjado de metila.
	Replicata (100% da concentração)
	Absorbância (A)
	1
	0,235
	2
	0,234
	3
	0,232
	Média
	0,233
	Concentração (mg/L)
	4,0 mg/L
Após a análise utilizamos os resultados para o cálculo da média, desvio padrão e coeficiente de variação no excel. Abaixo os resultados:
	Para 3,2 mg/L (80%)
	 
	 valor 1
	0,179
	valor 2
	0,178
	 valor 3
	0,181
	média
	0,179
	desvio padrão 
	0,002
	coeficiente de variação
	0,852
	Para 4,8 mg/L (120%)
	 
	valor 1
	0,272
	valor 2
	0,269
	valor 3
	0,268
	média
	0,27
	desvio padrão 
	0,002
	coeficiente de variação
	0,772
	Para 4,0 mg/L (100%)
	 
	valor 1
	0,235
	valor 2
	0,234
	valor 3
	0,232
	média
	0,234
	desvio padrão 
	0,002
	coeficiente de variação
	0,654
AULA 5: ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO E PARACETAMOL 
PROCEDIMENTO
Em uma placa de sílica, efetuamos três marcações indicando o ponto de aplicação da amostra e o ponto onde se indicará o final da corrida. Com auxílio de um capilar, aplicamos três porções de cada analgésico (AAS; DIPIRONA e PARACETAMOL) sobre uma placa de sílica 
Colocamos cuidadosamente a placa de sílica na cuba contendo citrato de etila e ácido acético, evitando que o ponto de aplicação da amostra mergulhe no solvente. Aguardamos até que o solvente atingisse cerca de 0,5 cm do topo da placa, removemos a placa e marcamos a frente do solvente (linha de chegada da fase móvel). Fizemos a visualização da placa de sílica utilizando uma lâmpada de UV.
Marcamos, com o lápis, o ponto visualizado para cada analgésico após a corrida na placa de sílica e com uma de régua, determinamos a distância de cada ponto e calculamos os valores de Rf. 
	Molécula
	Rf
	Paracetamol
	3,5
	Ácido acetilsalicílico
	4,5
	Dipirona
	0,8
Quanto maior o fator de retenção (Rf), mais apolar é a substância e quanto menor Rf, mais polar é a substânicia, logo chegamos a conclusão de acordo com os resultados obtidos o paracetamol é mais polar e a dipirona é apolar.
AULA 6: ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DE PIGMENTOS 
PROCEDIMENTO
Utilizamos três extratos de pimentão, sendo pimentão verde, amarelo e vermelho. Em uma placa de sílica traçamos uma linha de 1,5 da margem e três pontos onde depositamos com auxílio de um capilar gotas de cada amostra, após colocamos em uma cuba contendo éter de petróleo e acetona e deixamos por alguns minutos até atingir a segunda marcação e retiramos, marcando com um lápis o ponto atingido.
Após efetuamos a revelação com vapor de iodo: em uma cuba contendo iodo sólido, acondicionamos a placa de sílica por alguns minutos até observação de manchas escuras. Por fim relacionamos cada molécula das amostras ao resultado do cálculo Rf para as manchas observadas.
	Molécula
	Rf
	Caroteno
	1,0
	Capsantina
	0,18
	Criptoxantina
	0,36
AULA 7: ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA EM COLUNA DE TROCA IÔNICA HEMOGLOBINA GLICADA EM AMOSTRA DE SANGUE 
PROCEDIMENTO:
Separamos 4 tubos, sendo dois com tampa cinza e nomeamos como T1 e P1 e dois tubos com tampa vermelha e nomeamos como T2 e P2. No tubo T1 adicionamos com auxílio de uma pipeta 20µL hemoglobina teste (sangue) e no tubo P1 adicionamos 20µL com auxílio de uma pipeta hemoderivado padrão, após homogeneizamos e colocamos na centrifuga por 5 min. No tubo T2 adicionamos 100µL de hemolisado teste e no tubo P2 adicionamos 100µL de padrão, homogeneizamos e levamos para centrifuga por 5 min.
Após os 5 min fizemos a leitura da absorbância de 415nm no espectrofotômetro para cada amostra, calibrando com uma cubeta contendo água. Os resultados foram: T1- 0,740; P1- 0,240; T2- 0,339; P2- 0,297. Após efetuamos o cálculo de hemoglobina glicada na amostra de sangue, que foi igual a 27,25, ou seja um valor alto, pois o valor de referência é de 5,3% a 8,0%.
 
REFERÊNCIAS
1. Perez M.A.F. Validação de métodos analíticos: como fazer? Por que ela é importante? Boletim de tecnologia e desenvolvimento de embalagens- ITA. v 2, nº 3, 2010.
2. Neves, LCM. Métodos instrumentais de análises. São Paulo. Editora Sol,2020, 84p.
3. Silva CB,et.al. Desafios ao controle da qualidade de medicamentos no Brasil Cad. Saúde Colet., 2017, Rio de Janeiro, 25 (3): 362-370.
4. Filho, B. H, et.al. Espectrofotometria no ultravioleta e visível. 2010. Universidade de São Paulo. São Paulo, 2010.
6. Serafim F. A. T. O papel da cromatografia no controle de qualidade, conformidade e na rastreabilidade das aguardentes. Scientia Chromatographica 2018; 10(4):230-242. Disponível em: http://dx.doi.org/10.5935/sc.2019.002.
400	410	420	430	440	450	460	470	480	490	500	510	520	530	540	550	560	570	580	590	0.14499999999999999	0.157	0.183	0.19	0.20799999999999999	0.22600000000000001	0.23100000000000001	0.223	0.22800000000000001	0.19	0.152	0.108	7.4999999999999997E-2	4.5999999999999999E-2	2.8000000000000001E-2	1.2E-2	8.0000000000000002E-3	0	3.0000000000000001E-3	4.0000000000000001E-3	
y = 0,06x - 0,0126
R² = 0,998
1	2.5	5	8	10	0.06	0.129	0.28000000000000003	0.46200000000000002	0.59699999999999998