RELATÓRIO AULA 1 E 2 - BioTec

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 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA 
CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS - CAMPUS DE 
CURITIBANOS Disciplinas: CNS7111 - BIOTECNOLOGIA 
VEGETAL Professores: Lírio Luiz Dal Vesco e Kelen Haygert 
Lencina – Semestre: 9º. Acadêmico (s): Mariah Rosa, Gabrielle 
Cruz de Andrade, William Matheus e Mateus Ganasini. 
Matrícula(s): 17102047, 17102039, 16203650, 17102086. 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
1.1 Composição dos meios de cultura 
 
Em laboratório é possível cultivar plantas in vitro, através de culturas artificiais, o qual 
consiste no cultivo de células, tecidos ou órgãos vegetais em recipientes semi-herméticos 
(recipientes que impedem a entrada e saída de ar), onde a temperatura, pH, luminosidade e 
umidade, são controlados (Barrueto Cid, 2001; Semprebom, 2017). 
Os meios de cultura podem ser líquidos ou geleificados, que objetivam fornecer à planta 
todos os nutrientes essenciais, podendo ser utilizados na sua forma líquida ou sólida, como por 
exemplo, vitaminas, carbono, carboidratos, reguladores, macro e micronutrientes (Quisen e 
Angelo, 2008). 
O meio MS foi um dos pioneiros em cultura de tecidos de plantas, mostrando altos 
níveis de nitrato, amônio e potássio. Hoje em dia, esse meio de cultura é extensamente utilizado 
em trabalhos de cultura de tecidos vegetais (Paiva e Paiva, 2001). 
 
1.2 Seleção da planta matriz e desinfestação dos explantes e introdução in vitro: 
 
Através dos meios de cultura, é possível trabalhar com microenxertia, na qual consiste 
na escolha de uma planta matriz (estádio 0) para a retirada de uma gema apical ou um ápice 
caulinar. Em laboratório, para evitar contaminação, dentro câmara de fluxo laminar (CFL) com 
as mãos e materiais higienizados com água e álcool 70%, fazer cortes basal e apical nessas 
gemas e introduzir no meio de cultura (estádio 1), sendo ele líquido ou geleificado, e aguardar 
a resposta da planta em relação aos reguladores de crescimento (Guerra et al, 2016). 
A planta matriz utilizada no presente trabalho é do gênero Mentha, pertencente à família 
Lamiaceae, cujo gênero compreende plantas aromáticas perenes cultivadas com interesse na 
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extração de seus óleos essenciais tanto para fins medicinais quanto alimentícios, e dentre eles, 
está a erva conhecida popularmente por hortelã (Moreno e de Oliveira, 2013). 
 
2. JUSTIFICATIVA 
 
Através da aula prática na qual visa o estudo de tecidos vegetais, torna-se possível 
observar o potencial que a biotecnologia proporciona, podendo utilizar o estudo de tecidos 
vegetais como ferramentas de melhoramento vegetal, multiplicação de material genético e 
produção de mudas livres de vírus, aspectos fundamentais para aqueles que trabalham no meio 
agrícola e florestal. 
 
3. OBJETIVOS 
 
3.1 Objetivo geral 
 
Obtenção de um conhecimento mais detalhado sobre as tecnologias e técnicas 
envolvidas durante os processos de manipulação de organismos vivos, nos quais com o intuito 
de gerar produtos e serviços, tanto quanto o estudo das características pertencentes a cada 
processo. 
 
3.2. Objetivo específico 
 
- Salientar a importância da assepsia das vidrarias, meio de cultura e demais instrumentos 
utilizados na extração e manipulação dos explantes; 
- Efetuar todos os procedimentos necessários para elaboração do meio de cultura, tendo 
em vista suas características e diferentes composições; 
- Explorar as premissas da micropropagação vegetal, atentando à organogênese e seus 
cinco estádios, tal como a seleção, desinfestação e multiplicação de explantes. 
 
4. MATERIAL E MÉTODOS 
 
 4.1 Aula prática 1 e 2 
Na prática realizada no dia 09/03/2023 deu-se início às atividades laboratoriais, com 
apresentação do ambiente, e suas respectivas regras que devem ser seguidas para um bom 
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desenvolvimento dos trabalhos. Sendo então necessário manter o ambiente e os equipamentos 
limpos (lavagem e secagem de vidrarias/descarte de meios/autoclavagem) e desinfetados, 
sempre que utilizados. 
4.2 Equipamentos essenciais e manipulação de um laboratório de cultura de tecidos vegetais 
Manipular as culturas requer o auxílio de diversos equipamentos e ferramentas, e 
durante as aulas ministrada, utilizamos tais para o desenvolvimento dos meios de cultura no 
laboratório, equipamento como autoclave que confere uma esterilização das vidrarias, freezer 
para manter a conservação das soluções e reagentes em temperatura adequada, a câmara de 
fluxo laminar que possibilita o manuseio evitando contaminações com o meio externo, bisturis 
e pinças para manipulação e corte. Outros também como o pHmetro para conferir o pH, e para 
a manipulação das soluções e meios, utilizamos becker, tubo de ensaio, micropipetas, balança 
e reguladores. 
4.3 Procedimentos executados no laboratório 
Em sequência realizamos os cálculos dos meios de culturas, para elaborar 250 ml tanto 
dos meios líquidos e tanto dos geleificados, para os componentes sacarose (g), macronutrientes 
(ml), solução de ferro (ml), micronutrientes (ml) e vitaminas (ml), foi realizado apenas uma 
regra de 3 simples para a obtenção de suas respectivas quantidades a serem introduzidas no seu 
respectivo meio representadas na equação (1), já para os fitorreguladores ANA, BAP e GA3 
utilizou-se regra de três composta, representado na equação (2). 
Equação (1): 
𝐶𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜 (𝑚𝑙) − − − − − −1000 (𝑚𝑙) 
 𝑥 (𝑚𝑙) − − − − − − − −250 (𝑚𝑙) (1) 
 
Equação (2): 
 𝑉1 ∗ 𝑀1 = 𝑣2 ∗ 𝑚2 ⇒
𝑉2𝑀2
𝑀1
 (2) 
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Na aula prática do dia 16/03/2023 realizou-se a formulação dos meios de cultura com 
base nos resultados obtidos anteriormente, foram elaborados 24 tubos de ensaio de A2B4G2 
em meio de cultura líquido, sendo assim, seguimos o protocolo abaixo: 
1. Separamos 24 tubos de ensaio, com 24 tampas de papel alumínio e 24 pontes de papel; 
2. Usamos um Becker de volume apropriado para a capacidade calculada (~600 ml); 
3. Pesamos a sacarose diretamente no Becker; 
4. Adicionamos ao Becker ½ do volume final desejado (130ml) com H2O tipo 2 e dissolvemos 
a sacarose; 
5. Acrescentamos os outros componentes um a um e em ordem de acordo com a lista do item; 
6. Completamos para o volume final (250 ml) em proveta e transferimos para o Becker de 
preparo; 
7. Ajustamos o pH para 5,8, sob agitação utilizando NaOH ou HCl a 0,5N; 
8. Preparamos a ponte de papel filtro e introduzir no fundo do tubo; 
9. Elaboramos as etiquetas com o seguinte código (A2B4G2). 
 
Figura 1. Alguns materiais utilizados. A) Sacarose; B) GA3 ; C) BAP; D) H2O; E) ANA. 
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Figura 2. Alguns procedimentos realizados. A) Pesamos a sacarose; B) Misturamos a sacarose com H2O tipo 2, 
até dissolver; C) Ajustamos o pH para 5,8. 
 
Figura 3. A) Adição de um dos componentes para a formulação do meio A2B4G2; B) Inserindo a formulação do 
meio A2B4G2 no tubo de ensaio; C) Tubo de ensaio e a ponte para o meio; D) Tubos de ensaio contendo meio 
de cultura A2B4G2 no momento da confecção, sendo que posteriormente o tubo de ensaio foi fechado e 
armazenado em local adequado. 
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4.4 Aula prática 3 
 
Para a realização da prática 03, a qual ocorreu no dia 23/03/2023, o grupo recebeu 12 
tubos de ensaios com 4 meios de cultura diferentes, sendo A2B4G2, A1B2, B1 e o MS. No 
entanto realizamos a multiplicação in vitro da Mentha, utilizando o protocolo abaixo: 
1. Retirou-se objetos, como anéis, relógios, e lavou-se as mãos com água e sabão, e secou-
se com papel toalha. Em seguida borrifou-se álcool 70 nas mãos; 
2. Transferiu-se para a câmara de fluxo laminar (CFL) os tubos de ensaios com os meios 
de cultura elaborados previamente; 
3. Selecionou-se a espécie em cultivo desejada, Menthaque continha brotações em bom 
estágio de desenvolvimento; 
4. Retirou-se as brotações dos frascos, com o auxílio de uma pinça, e colocou-se sobre o 
papel autoclavado e efetuou-se a excisão das microestacas contendo 1-3 segmentos de 
nó; 
5. Efetuou-se a excisão das áreas necrosadas, amarelas ou secas, com a pinça e bisturi; 
6. Inoculou-se 2 explantes por tubo. Primeiramente um em cada tipo de meio para evitar 
erros experimentais; 
7. Fechou-se o tubo com papel alumínio e vedou-se com filme plástico; 
8. Borrifou-se álcool 70% nas mãos e flambou-se as pinças e bisturis, quando necessário; 
9. Anotou-se na etiqueta as iniciais do nome da espécie (Mtha), a data de inoculação 
(23/03/2023), nome do grupo (G4); 
10. Por fim, transferiu-se as culturas para BOD regulada para a T de 25°C e fotoperíodo de 
14h de luz. 
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Figura 4. A) Retirada de explantes para inserção em diferentes meios de cultura; B) Vedação do tubo de ensaio 
com o papel alumínio e o papel filme após a inserção; C) Explantes inoculados nos diferentes meios de culturas 
produzidos pelos grupos em laboratório. 
 
5. RESULTADO E DISCUSSÕES 
De acordo com Bown e Thorpe (1896), a composição do meio de cultura é um fator 
determinante para o sucesso da prática. Em 1962, foi desenvolvido o meio de cultura 
Murashige e Skoog, que até hoje é utilizado universalmente. Este método é muito utilizado na 
morfogênese, cultura de meristemas e regeneração de tecidos, tendo uma quantidade 
satisfatória de sais minerais e nutrientes (QUISEN; ANGELO, 2008). 
Tendo em vista este conceito, no dia 09/03/2023, realizamos a prática de elaborar as 
formulações salinas necessárias para elaborar os meios de cultura geleificado e o líquido, sendo 
assim, primeiramente efetuamos os cálculos dos componentes do meio para elaborar 250 mL, 
ou seja, cada constituinte do meio foi quantificado de maneira correta (Tabela 01). 
 
 
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Tabela 1. Quantidade a ser adicionada de cada componente para uma solução de 250 Ml. 
 
Componentes 
do meio 
de cultura 
Grupo 1 
(Geleificado) 
Grupo 2 
(Geleificado) 
Grupo 3 
 (Líquido) 
 Grupo 4 
(Líquido) 
 Códigos das Etiquetas 
MS B1 A1B2 A2B4G2 
Sacarose (g) 7,5 7,5 7,5 7,5 
Macronutriente (ml) 12,5 12,5 12,5 12,5 
Solução de Ferro (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 
Micronutriente (ml) 1,25 1,25 1,25 1,25 
Vitaminas de MS (ml) 1,25 1,25 1,25 0,5 
ANA (ml) - - 0,25 0,36 
BAP (ml) - 0,25 0,5 1 
GA3 (ml) - - - 0,5 
Ajustar o pH (pH 5,8) 5,8 5,8 5,8 5,8 
Agar (7,5g/L) 1,875 1,875 - - 
Fonte: Os autores (2023). 
 Na prática 03, teve como base os estádios iniciais da organogênese, no qual o primeiro 
estádio está relacionado com a seleção e o tratamento sanitário da planta matriz, como também 
o isolamento das estruturas meristemáticas. 
 Já o segundo estádio condiz a introdução e estabelecimento in vitro, no qual houve uma 
seleção dos explantes da planta, sendo necessário o corte dos nós e a remoção das folhas, 
expondo assim as gemas, a fim de que os fitorreguladores realizem a multiplicação e o 
crescimento dessas células. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Tabela 2. Diferentes meios de cultura versus o tipo e número de explantes. 
Meios de cultura Tipo Nº de explantes 
MS (G) Nodal 3 
B1 (G) Nodal 3 
A1B2 (L) Nodal 3 
A2B4G4 (L) Nodal 3 
Fonte: Os autores (2023). 
 
6. CONCLUSÃO 
 
Após as práticas 1 e 2, foi realizado os cálculos das soluções e preparados 12 beckers 
com 3 repetições para cada grupo: MS e B1(em meio geleificado), A1B2 e A2B4G2 (em meio 
líquido). 
Na aula prática 3, após a seleção da planta matriz, desinfecção dos segmentos, 
juntamente à excisão dos mesmos, foram inoculados dentro de todos os tubos de ensaio no 
meio de cultura. No final obtivemos todos os tubos de ensaios com um segmento da planta 
matriz inoculados em meios de cultura diferentes e condicionados em sala climatizada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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7. REFERÊNCIAS 
 
GUERRA, M. P.; NODARI, R. O.; FRAGA, P. de F.; VIEIRA, L. do N.; FRITSCHE, Y. 
Biotecnologia 1. Universidade Federal de Santa Catarina, 2016 (Apostila de Biotecnologia), 
Departamento de Fitotecnia. 
 
MARTINS, C. R.; CARVALHO, A. C. P. P. de. Avanço da cultura de tecidos na 
micropropagação de plantas. In: MARTINS, C. R.; CARVALHO, A. C. P. P. de. Ciclo de 
palestras sobre cultivo in vitro de plantas. Brasília - DF: Embrapa, 2012, p. 28-32. 
 
MORENO, M. R.; de OLIVEIRA, S. C. Resultado da experimentação agronômica com o 
gênero Mentha no distrito federal - Brasil (período de 1985 a 2012), faculdade de 
Agronomia e Medicina Veterinária, Brasília - DF, p. 1-4, 2013. 
 
PAIVA, R.; PAIVA, P. D. de O. Cultura de Tecidos. Lavras: UFA/FAEPE, 2001. 
 
QUISEN, R.C; ANGELO, P.C.S. Manual de procedimentos do laboratório de cultura de 
tecidos da Embrapa Amazônia Ocidental. Manaus: Embrapa Amazônia Ocidental, 2008, 
48p. Disponível em: https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/47132/1/Doc-61-
A5.pdf. Acesso em 28 de mar. 2023. 
 
SEMPREBOM, T. Biotecnologia vegetal: como e por que cultivar plantas in vitro?, v.2, 
2017. Disponível em: <https://profissaobiotec.com.br/biotecnologia-vegetal-como-e-por-que-
cultivar-plantas-in-vitro/> Acesso em 03 de mar. 2023. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
https://profissaobiotec.com.br/biotecnologia-vegetal-como-e-por-que-cultivar-plantas-in-vitro/
https://profissaobiotec.com.br/biotecnologia-vegetal-como-e-por-que-cultivar-plantas-in-vitro/
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8. ANEXO