Biologia Molecular e Biotecnologia - WebAula 02 -Profa Juliana Gonçales

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WEBAULA 02
Biologia Molecular e Biotecnologia
P rofa . D ra . Ju l i a n a G o n ç a l e s
Todos direitos reservados - Profa. Dra. Juliana Gonçales
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Eletroforese 
❑ Separação de moléculas de acordo com suas propriedades através da 
aplicação de um campo elétrico;
❑ Componentes:
✓ Campo elétrico;
✓ Matriz de migração;
✓ Tampão.
❑ Tamanho da molécula influência diretamente na posição na matriz de 
migração;
❑ Utilizada na Biologia molecular para identificar o tamanho dos pares de 
bases.
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Eletroforese 
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Eletroforese 
❑ Matriz de Agarose ou Poliacrilamida 
 Dependente do tamanho dos pares de base
❑ Agarose – 0.2 kb a 50 kb ( 1kb equivale a 1000 pares de bases);
❑ Poliacrilamida – <1kb (pequenos fragmentos);
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Eletroforese 
Matriz de Agarose
❑ Mistura de um solvente + Agarose – não tóxico;
❑ Polimerização é rápida;
❑ Precisa de uma coloração com agente não mutagênico ou com brometo de 
etídio (mutagênico);
❑ Faz uso de um transiluminador UV; 
❑ Tamanho dos poros tamanho do fragmento concentração do gel 
❑ Menor concentração maior porosidade (banda maiores);
❑ 1 a 3%
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Eletroforese 
Tampão
❑ TAE (Tris-acetate-EDTA electrophoresis buffer – Tampão de eletroforese-
Tris-acetato-EDTA;
❑ TPE (Tris-phosphate-EDTA electrophoresis buffer – Tampão de 
eletroforese-Tris-fosfato-EDTA);
❑ TBE (Tris-borate-EDTA electrophoresis buffer – Tampão de eletroforese-
Tris-borato-EDTA);
Loading Buffer
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Eletroforese 
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Eletroforese 
Fatores que afetam a migração: 
❑ Tamanho da molécula;
❑ Concentração do gel:
✓ Define o tamanho dos poros;
✓ Conformação do DNA.
❑ Força elétrica aplicada:
✓ Voltagem – Volts;
✓ Corrente – Ampères;
✓ Força – Watts ;
✓ Presença de corantes;
❑ Composição do tampão
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Eletroforese 
Poliacrilamida
❑ Em solução é neurotóxica;
❑ Mistura de polímeros - acrilamida e bisacrilamida
❑ Preparação do gel mais complexa;
❑ Necessita de componentes adicionais para que a polimerização 
ocorra;
❑ Diferentes concentrações permitem analises mais especifica para 
fragmentos de pequenos pares de base.
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Eletroforese 
Poço
Gel agarose
Pente
Solução Tampão
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Eletroforese 
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Reação em Cadeia da Polimerase 
Taq - Thermus aquaticus, 
uma extremófila encontrada em fontes hidrotermais
Como tudo começou...
Thomas D. Brock no lago “Yellowstone National Park”
de onde foi isolado a bactéria Thermus aqquaticus
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Reação em Cadeia da Polimerase 
Como tudo começou...
Desenvolver um processo onde o 
DNA poderia ser multiplicado
artificialmente.
Kary Mullis
Nobel de Química - 1993
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Reação em Cadeia da Polimerase 
Multiplicar um segmento específico de DNA (gene ou parte dele) a partir de
uma quantidade mínima até um ponto em que sua concentração seja tão 
alta que possa ser facilmente detectável por métodos simples de 
separação e identificação de substâncias (eletroforese).
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Reação em Cadeia da Polimerase 
❑ Termociclador
❑ Existem variações da técnica:
✓ PCR convencional;
✓ RT-PCR;
✓ Nested – PCR;
✓ PCR-RFLP;;
✓ qPCR
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Reação em Cadeia da Polimerase 
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Reação em Cadeia da Polimerase 
Primers 
❑ Tamanho → 10 a 30 bases;
❑ Composição de bases → ~50% de G/C;
❑ Sequências – não devem ter complementaridades intra ou inter 
molecular;
❑ É necessário o cálculo da melting temperature (Tm);
❑ Tm → é a temperatura na qual se tenta obter o equilíbrio entre a 
formação e a dissociação dos híbridos gerados pelo 
estabelecimento de pontes de hidrogênio;
❑ Cálculo → 2 para A e T → 4 para C e G.
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Primers 
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Reação em Cadeia da Polimerase 
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Reação em Cadeia da Polimerase 
3° Passo
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Reação em Cadeia da Polimerase 
Reagentes 
❑ Água
❑ DNA molde
❑ Nucleotídeos
❑ Primers
❑ DNA polimerase (Taq)
❑ Tampão
❑ Mg++
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Reação em Cadeia da Polimerase 
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Reação em Cadeia da Polimerase 
❑ Existem variações da técnica:
✓ PCR convencional;
✓ RT-PCR;
✓ Nested – PCR;
✓ PCR-RFLP;
✓ qPCR.
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PCR CONVENCIONAL
❑ DNA;
❑ TaqPolimerase;
❑ Qualitativa
❑ Uma das técnica mais utilizadas.
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NESTED PCR
❑ Duas PCR, a segunda usa 
como molde o produto da 
primeira; 
❑ Quantidade reduzida de 
material genético.
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RT-PCR
❑ RNA;
❑ Transcriptase Reversa;
❑ Qualitativa
❑ Expressão genética;
❑ Análise de patógenos de RNA;
❑ Realizada em duas etapas: 
✓ Construção do cDNA;
✓ Amplificação do cDNA.
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PCR-RFLP
❑ Técnica do polimorfismo de comprimento de fragmento de 
restrição;
❑ Qualitativa;
❑ Realizada em duasetapas: 
✓ PCR convencional;
✓ Digestão.
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Reação em Cadeia da Polimerase 
qPCR
❑ PCR em tempo real;
❑ Quantitativa.
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qPCR
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qPCR
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qPCR
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aula
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POLIMORFISMO 
GENÉTICO
GENÉTICA 
FORENSE
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“Qualquer coisa que você possa fazer 
ou sonhar, você pode começar. A 
coragem contém em si mesma, o 
poder, o gênio e a magia”
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