ED enzimas 1 -

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ESTUDO DIRIGIDO SOBRE ENZIMAS
1. Mantendo o sabor doce do milho. O sabor doce de um milho recém colhido é devido ao alto-nível de açúcar das sementes. Alguns dias depois da colheita, o milho armazenado não é tão doce pois cerca de 50% do açúcar livre é convertido em amido no 1º dia pós-colheita. Para preservar a doçura do milho fresco, as espigas devem ser escaldadas em água fervente e depois resfriadas em água gelada. Dessa forma, o milho pode ser congelado e manterá a sua doçura. Qual é a base bioquímica desse fenômeno?
Ao escaldar o milho em água fervente, suas enzimas estarão em um ambiente com alta temperatura, o que culmina no rompimento de ligações que mantém sua estrutura secundária e terciária (ou quaternária), mantendo apenas a estrutura primária, que corresponde à sequência de aminoácidos. Isto leva à sua desnaturação, ou seja, à perda da sua estrutura tridimensional, essencial para seu funcionamento e quebra das pontes dissulfeto. Desta forma, as enzimas perdem sua funcionalidade catalítica, deixam de realizar a conversão de glicose em amido e a doçura é mantida.
2. Aumento da velocidade pela urease. A enzima urease aumenta a velocidade da hidrólise da uréia em pH 8,0 e a 20°C por um fator de 1014. Se uma certa quantidade de urease pode hidrolisar completamente uma certa quantidade de uréia em 5 minutos a 20°C e pH 8,0, quanto demoraria para essa quantidade de uréia ser hidrolisada sob as mesmas condições na ausência da urease?
Sem a urease, essa quantidade de uréia levaria 5 ⋅ 1014 minutos para ser convertida, o que equivale a 8,3 ⋅ 1012 horas ou 3,5 ⋅ 1011 dias ou 9,5 ⋅ 108 anos. 
3. Proteção de uma enzima contra a desnaturação pelo calor. Quando soluções de enzimas são aquecidas, há uma perda progressiva da atividade catalítica devido à desnaturação da enzima. A enzima hexoquinase incubada a 45°C perde 50% da sua atividade em 12 minutos, mas quando incubada a 45°C na presença de uma concentração muito grande de um dos seus substratos, a enzima perde apenas 3% da sua atividade em 12 minutos. Explique por que a desnaturação térmica da hexoquinase foi retardada na presença de um dos seus substratos.
Quanto maior a quantidade de substrato no meio, maiores são as chances de colisões entre suas moléculas e as enzimas. Com a colisão, pode ser formado o complexo enzima-substrato, a partir do qual são formadas novas ligações que o tornam mais estável e a enzima fica menos suscetível à desnaturação, se comparado à enzima livre.
4. Requisitos dos sítios ativos das enzimas. A carboxipeptidase, que remove resíduos de aminoácidos a partir da extremidade carboxi-terminal, é um polipeptídeo de 307 aminoácidos. Os dois grupos catalíticos essenciais no sítio ativo são fornecidos pela Arg145 e Glu270. Explique como estes dois resíduos de aminoácidos podem catalisar uma reação.
Esses resíduos de aminoácidos são os responsáveis por formar ligações, covalentes ou não, entre seus grupos funcionais e os substratos das reações em que atuam. Apesar de distantes um do outro na sequência peptídica, Arg145 e Glu270 conseguem catalisar a reação graças à formação da estrutura tridimensional da enzima. O enovelamento da enzima e os mecanismos químicos dos aminoácidos permite uma aproximação desses resíduos (localizados no sítio ativo das enzimas), de forma que ambos se ligam ao substrato e permitem que a reação aconteça. 
5. Física quântica. Um dos mecanismos menos conhecidos para a compreensão do funcionamento das enzimas são aqueles baseados na mecânica quântica. A partir da leitura do artigo: http://cienciahoje.org.br/coluna/biologia-quantica/, pesquise sobre exemplos de enzimas quânticas e a sua aplicação na biotecnologia.
As enzimas quânticas seguem o princípio do enovelamento quântico e não estão na classificação do modelo clássico das enzimas devido a sua cinética avançada. Estudos revelaram que o tunelamento quântico pode ser o único meio em que uma enzima catalisa a transferência de hidrogênio durante a quebra da ligação C – H. Dessa forma, estudos podem esclarecer através da mecânica quântica a dinâmica proteica e ação enzimática.
Referência: doi: 10.1098/rsta.2000.0536
6. Estimativa da Vmáx e Km pela inspeção. Embora métodos gráficos sejam disponíveis para a determinação precisa da Vmáx e Km de uma reação catalisada por enzima, algumas vezes essas quantidades podem ser rapidamente estimadas inspecionando-se os valores de V0 em [S] crescentes. Estimem a Vmáx e a Km da reação catalisada por uma enzima para a qual foram obtidos os seguintes dados:
	[S] (M)
	V0 (µM/min)
	2,5 x 10-6
	28
	4,0 x 10-6
	40
	1 x 10-5
	70
	2 x 10-5
	95
	4 x 10-5
	112
	1 x 10-4
	128
	2 x 10-3
	139
	1 x 10-2
	140
O Vmáx é o maior valor da velocidade medida, sendo então:
Vmáx =140 (µM/min)
O Km é a concentração de substrato necessária para atingir metade da Vmáx das enzimas saturadas, dessa forma: 
Km = Vmáx / 2
Km = 140/2
Km = 70
Km = 1 x 10-5
7. Inibição da atividade enzimática. O ibuprofeno é um inibidor da prostaglandina endoperóxido sintase. Quando inibe a síntese das prostaglandinas, o ibuprofeno reduz a inflamação e a dor. Usando os dados da tabela abaixo, determine o tipo de inibição que o ibuprofeno exerce na prostaglandina endoperóxido sintase.
	[Ácido araquidônico] (mM)
	Velocidade de formação de prostaglandina (mM/min)
	Velocidade de formação de prostaglandina com 10mg/mL de ibuprofeno (mM/min)
	0,5
	23,5
	16,67
	1,0
	32,2
	25,25
	1,5
	36,9
	30,49
	2,5
	41,8
	37,04
	3,5
	44,0
	38,91
De acordo com o gráfico acima plotado a partir da equação de Lineweaver-Burk, é possível identificar o mesmo valor da Vmáx para ambas as retas, sendo esse valor constante e classificando o inibidor como competitivo. O gráfico é do tipo Duplo Recíproco.
8. O número de renovação da anidrase carbônica. A anidrase carbônica dos eritrócitos (Mt 30000) apresenta um dos maiores números de renovação que conhecemos. Ela catalisa a hidratação reversível do CO2:
H2O + CO2 ↔ H2CO3
Esse é um processo importante no transporte de CO2 dos tecidos para os pulmões. Se 10,0 µg de anidrase carbônica pura catalisa a hidratação de 0,30 g de CO2 em 1 min a 37°C e Vmax, qual é o número de renovação (kcat) da anidrase carbônica (em unidades de min-1)?
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1) Conversão Vmáx (mol/min):
44g ---------- 1 M (massa molar do CO2)
0,3g --------- x
x ∙ 44g = 0,3g ∙ 1 M
x = 
x = 0,0068 M
Vmáx = 0,0068 M/min
2) Conversão [Et]:
30.000 g -------- 1 M
1 ∙ 10-5 g -------- [Et]
30.000 g ∙ [Et] = 1 M ∙ 1 ∙ 10-5 g
[Et] = 
[Et] = 3,33 ∙ 10-10 M
3) Vmáx = K2 ∙ [ET]
0,0068 M/min = kcat ∙ 3,33 ∙ 10-10 M
kcat = 
kcat = 2 x 107 min-1
9. O pH ótimo da lisozima. O sítio ativo da lisozima contém dois resíduos de aminoácidos essenciais para a catálise: Glu35 e Asp52. Os valores de pKa das carboxilas das cadeias laterais destes resíduos são 5,9 e 4,5, respectivamente. Qual é o estado de ionização (protonado ou desprotonado) de cada resíduo em pH 5,2, o pH ótimo da lisozima? Como os estados de ionização desses resíduos podem explicar o perfil pH-atividade da lisozima mostrado a seguir?
	
 O pKa de um aminoácido corresponde ao pH no qual ele se encontra no ponto isoelétrico, em que seu grupo carboxila já foi totalmente desprotonado, mas ainda restam prótons na cadeia lateral e no grupo amina, de forma que o aminoácido ainda se encontra protonado. Em pH acima do ponto isoelétrico, esse aminoácido começa a liberar o restante dos prótons, ficando desprotonado. O pH ótimo da lisozima, que é 5,2, possui valor inferior ao pKa do resíduo Glu35 (5,9), de forma que este ainda se encontra desprotonado. Já o resíduo Asp52, que possui pKa = 4,5, encontra-se protonado no pH ótimo da enzima. Conforme o pH varia, perde a proporção de protonados e desprotonados, alterando a atividade enzimática.
10. Clivagem de DNA com endonucleases de restrição. Cada enzima de restrição possui características próprias, as quais são indicadas pelo fabricante. As enzimas devem permanecer sempre armazenadas em -20°C, em freezer que não possua descongelamento automático.As enzimas são comercializadas em soluções de glicerol em concentrações de 5 a 10 unidades (U) por µL. É estabelecido que 1 unidade de enzima de restrição cliva 1 µg de DNA, a 37°C, por 1 hora. Calcule qual o volume de enzima EcoRI [8 U µL-1] é necessário para clivar 5 µg de DNA a 37°C, por 1 hora. Se você precisasse terminar a clivagem em apenas 30 min, como você faria? Caso você necessitasse que a reação ocorresse “overnight”, qual seria o procedimento?
Se 1 unidade de Enzima de Restrição cliva 1 µg de DNA, para clivar 5 µg de DNA, são necessárias, pelo menos, 5 unidades de Enzima de Restrição. Como a EcoRI tem concentração de 8 U µL-1, por regra de três:
8U --------------- 1µL
5U --------------- x
 x ∙ 8U = 1µL ∙ 5U
x = 
x = 0,625 µL de enzima
São necessários 0.625 µL para clivar 5 µg de DNA a 37°C, por 1 hora. Para completar a clivagem em 30 minutos, que é a metade do tempo, adiciona-se o dobro de volume: 
1,250 µL para a reação ocorrer em 30min.
Para a reação ocorrer “overnight”, o procedimento seria reduzir a metade da quantidade de enzimas:
0,625 µL / 2 = 0,312 µL.
Questões extraídas ou adaptadas de: 
Nelson, D.L., Cox, M.M. Lehninger princípios de bioquímica. São Paulo: Sarvier. 4.ed. 2006.
y = 0,0116x + 0,0194R² = 0,9999y = 0,0203x + 0,0194R² = 0,999300,010,020,030,040,050,060,0700,511,522,51/Vo1/Vo com ibuprofenoLinear (1/Vo )Linear (1/Vo com ibuprofeno)