RELATÓRIO - ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE LEITE PASTEURIZADO

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ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE LEITE PASTEURIZADO
1 INTRODUÇÃO 
O leite de boa qualidade, sem outra especificação, é entendido como produto oriundo da ordenha completa e ininterrupta, de vacas sadias, bem descansadas e bem alimentadas, mantendo a organização e higiene de modo adequado (PAULA; CARDOSO; RANGEL, 2010). É considerado um alimento completo e, devido seu alto valor nutritivo, é uma das mais importantes fontes de proteínas, lipídeos, carboidratos e vitaminas. Entretanto, são essas mesmas características que o tornam um meio de cultura, possibilitando a multiplicação de microrganismos patogênicos e/ou deteriorantes, cujos resíduos metabólicos produzem alterações físico-químicas no leite, o que limita sua durabilidade. Isto resulta em problemas sanitários e econômicos (OLIVEIRA, 2009).
O leite e seus derivados constituem um grupo de alimentos de grande valor nutricional, por serem fontes consideráveis de proteínas de alto valor biológico, além de vitaminas e minerais. O consumo habitual destes alimentos é recomendado, principalmente, para atingir a adequação diária de cálcio, um nutriente fundamental para a formação e a manutenção da estrutura óssea, entre outras funções no organismo (MUNIZ et al., 2013)
De acordo com a Instrução Normativa N° 62 de 29 de dezembro de 2011, vários fatores devem ser adotados para a obtenção de leite de boa qualidade e seguro, sob o ponto de vista microscópico e macroscópico, o leite deve apresentar ausência de qualquer tipo de impureza ou elementos estranhos (BRASIL, 2011).
E dentre os alimentos de origem animal, o leite, pela sua riqueza de nutrientes, constitui um importante meio de cultura para o desenvolvimento de um grande número de micro-organismos. O principal parâmetro utilizado para se verificar a qualidade desse produto é o seu perfil microbiológico, determinado principalmente pela forma de obtenção, armazenamento e transporte. Alguns grupos específicos de micro-organismos são frequentemente pesquisados como os aeróbios mesófilos, coliformes e psicrotróficos (SAEKI et al., 2010) A microbiota contaminante do leite normalmente é composta por bactérias, em especial pelas psicrotróficas, que se multiplicam no leite refrigerado, enquanto que leveduras e fungos são raramente encontrados (JAY, 2005).
Um dos parâmetros importantes para determinar a vida útil do leite se baseia na avaliação da contaminação microbiológica para que o mesmo não ofereça riscos à saúde dos consumidores. É importante o controle higiênico-sanitário desde a obtenção do leite in natura até a distribuição do produto industrializado, pois as condições de higiene inadequadas tornam viável a transmissão de doenças a população consumidora (SILVA et al., 2008).
Em vista do acima exposto, o trabalho teve por objetivo realizar o relato das análises microbiológicas feitas em uma amostra de leite, a fim de analisar a qualidade higiênico-sanitária do alimento e determinar se está apto para o consumo, de acordo com os padrões estabelecidos pela vigente legislação, de modo que não venha a comprometer a saúde de indivíduos e coletividades. Como também entender sobre as técnicas de estudo dos micro-organismos em alimentos através da vivência do grupo em aulas práticas.
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Materiais
A prática foi realizada a partir de uma amostra de 100mL de leite, retirado por ordenha mecânica na Escola Agrícola de Jundiaí (UFRN), no município de Macaíba/RN, no dia 21/08/2018, às 16 horas. A amostra foi coletada em uma garrafa pet e transportada em temperatura ambiente 30 minutos, até ser submetido à fervura por 2 minutos em panela de alumínio, em seguida foi armazenado 100mL em uma garrafa de vidro sob refrigeração em geladeira (Electrolux Frost Free TF51) entre as temperaturas de 4 a -2°C. No dia seguinte o leite foi transportado acondicionado em bolsa térmica com gelo, em um período de aproximadamente 20 minutos e foi armazenado no frigobar do Centro Acadêmico do Departamento de Nutrição antes do início da realização das análises. 
· 100mL leite cru fervido;
· Garrafa de vidro;
· Meio de cultura Ágar Padrão para Contagem (PCA);
· Água peptonada a 0,1%;
· Calculadora; 
· 3 tubos de ensaio contendo 9mL de água peptonada estéril;
· 3 pipetas volumétricas de 1mL estéreis;
· Bico de Bunsen;
· Fósforo;
· Pincel marcador permanente;
· 6 placas de Petri estéreis;
· Estufa a 35°C;
· Geladeira a 7°C;
· Contador de colônias.
2.2 Métodos	
Todas análises foram conduzidas no Laboratório de Microbiologia de Alimentos, no Departamento de Nutrição, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), no dia 22/08/2018. Para a análise microbiológica do leite foi utilizado o método descrito no Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água de Silva, et al. (2010). 
2.2.1 Preparo da amostra e diluições 
 
Inicialmente, higienizou-se as mãos dos manipuladores do grupo e a bancada do Laboratório de Microbiologia de Alimentos. Em seguida, ligou-se a chama do Bico de Bunsen e identificou-se com pincel marcador permanente os 3 tubos de ensaio, contendo 9mL de água peptonada, com o grupo de trabalho em laboratório (G4), a diluição da amostra a ser inoculada em cada tubo (100, 10-1 e 10-2). Também identificou-se as 6 placas de Petri com a mesma identificação das placas de Petri, anteriormente citadas, acrescentando a divisão de acordo com o micro-organismo a ser analisado sendo estes mesófilos (M) e psicrotróficos (P). Uma vez realizada a identificação das vidrarias, higienizou-se a garrafa de vidro contendo a amostra de leite cru fervido (100) com álcool 70% antes da realização das diluições seriadas, em seguida agitou-se a garrafa, fazendo assim a homogeneização da amostra. 
Após feito isso, deu-se início o preparo das diluições seriada, com o auxílio de uma pipeta estéril, inoculou-se 1mL da amostra sem diluição (100) para um tubo de ensaio contendo 9mL de água peptonada e realizou-se a homogeneização e obteve-se a diluição 10-1. Por último, com o auxílio de uma nova pipeta estéril, retirou-se 1mL da diluição 10-1 e inoculou-se em outro tubo de ensaio, e mais uma vez, homogeneizou-se a diluição, obtendo-se a diluição seriada 10-2.
	
2.2.2 Plaqueamento em superfície (spread plate)
Com o auxílio de uma pipeta estéril, inoculou-se 1mL da amostra diluição 100 em duas placa de Petri inicialmente identificadas. Esse mesmo procedimento foi feito com as diluições 10-1 e 10-2. Durante o procedimento de plaqueamento, abriu-se as placas o suficiente para inserir a pipeta e sempre próximo a chama do bico de Bunsen, depositou-se os inóculos sempre no centro ou o mais próximo possível. 
Em seguida, misturou-se o inóculo das placas com o meio de cultura Ágar Padrão para Contagem (PCA). Adicionou-se em torno de 10 a 15mL do ágar em todas as placas, tendo este sido previamente fundido e resfriado a 44-46°C. Após a mistura do meio com o inóculo, homogeneizou-se as placas, em superfície plana, em movimentos circulares de oito a dez vezes no sentido horário e anti-horário. Esperou-se solidificar e em seguida incubou-se as placas invertidas em estufa a 35°C por 24 horas para os mesófilos (temperatura dita ótima para o crescimento microbiológico), e em geladeira a 7°C por 8 dias os psicotrópicos (temperatura dita máxima para o crescimento microbiológico). 
2.2.3 Contagem das colônias 
A contagem de colônias do grupo de micro-organismos mesófilos após 24 horas da incubação das placas, visto que o cronograma de aulas não permitir a contagem após as exatas 48 horas indicadas de incubação. Já a contagem das colônias do grupo de psicrotróficos deu-se após 8 dias de incubação das placas, mais uma vez, devido ao fato do cronograma não permitir a contagem após os 10 dias indicados de incubação, entretanto isso não acarretou prejuízos as análises. Nos distintos momentos de contagem das colônias fez-se a seleção de placas em que fosse observado um crescimento de 25 a 250 colônias para contagem de ambos os grupos. A observação do desenvolvimento de colônias de mesófilos e psicrotróficos deu-se através da contagema olho nu por meio de um contador de colônias.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Após feita a contagem das colônias nas placas observou-se o desenvolvimento de colônias para mesófilos e psicrotróficos nas diluições 10-1. 
A seguir, o Quadro 1, demonstra os resultados obtidos através da contagem total de aeróbios mesófilos após 24 horas de incubação em estufa a 35°C.
Quadro 1. Contagem do número de colônias de mesófilos após 24 horas de incubação em estufa a 35°C.
	Fator de diluição 
	100 (amostra sem diluição)
	10-1
	10-2
	Contagem (colônias)
	Incontável 
	207
	Incontável 
O número de colônias contado, por se encontrar dentro do intervalo esperado (25 a 250 colônias) foi multiplicado pelo fator inverso de diluição da respectiva placa, regra geral de contagem. O resultado final foi expresso em UFC/ml da amostra.
Com isso, a placa correspondente a diluição 10-1 para mesófilos foi a única que apresentou valor entre 25 a 250 colônias. Sendo assim, o cálculo para verificar o resultado final da contagem, considerando a diluição, foi: 207 x  1/10 = 2.070 = 2,07 x 103 UFC/mL.
O Quadro 2, demonstra os resultados obtidos através da contagem total de aeróbios psicrotróficos após 8 dias de incubação em geladeira a 7°C.
Quadro 2. Contagem do número de colônias de psicrotróficos após 8 dias de incubação em geladeira a 7°C.
	Fator de diluição 
	100  (amostra sem diluição)
	10-1
	10-2
	Contagem (colônias)
	Incontável 
	75
	Ausência de crescimento de colônias
Como pode ser visto no Quadro 2, a placa correspondente a diluição 10-1 para psicrotróficos foi a única que apresentou valor entre 25 a 250 colônias. Sendo assim, o cálculo para verificar o resultado final da contagem, considerando a diluição, foi: 75 x 1/10 = 750 = 7,5 x 102 UFC/mL
De acordo com os limites estabelecidos por Brasil (2011) é permitida a presença de até 3,6 log 105  UFC/mL para mesófilos aeróbios em leite pasteurizado. No presente trabalho, os resultados encontrados a partir das análises microbiológicas foram de 2,07 log 103 UFC/mL, sendo indicativo de leite de alta qualidade higiênico-sanitária para esse microrganismo. 
No presente trabalho as amostras de leite cru avaliadas, mostraram que a contagem bacteriana total de psicotrópicos resultou em 7,5 log 102 UFC/mL. Cabe salientar que a legislação brasileira não determina um limite para a população de psicrotróficos, no entanto, conforme Pinto et al. (2006) não é recomendável a fabricação de produtos lácteos com leite cru com contagem de psicotrópicos superior a 6,7 log10 UFC/mL, pois estes microrganismos mantêm sua capacidade de multiplicação em condições de refrigeração e tendem a se tornar predominantes na microbiota do leite cru, estas bactérias em alta quantidade permitem modificações do leite e derivados, alterando a quantidade de proteínas e lipídios, encurtando a vida útil desse alimento. (ZANELLA, ROSSI, 2014)
No estudo de Zanella e Rossi (2014) às contagens de bactérias mesófilas e psicotrópicas no leite cru encontradas apresentaram-se fora dos padrões exigidos pela IN nº 62 (Brasil, 2011), indicando a necessidade de revisão das práticas de higiene antes e durante a ordenha. 
Em um estudo realizado no Paraná foram analisadas a presença de mesófilos em várias amostras de leites pasteurizados os resultados variaram de 1 a 5,30 log10 UFC/mL, sendo que das 9 amostras de leite pasteurizado 3 (33,3%) apresentaram valores acima do permitido, sendo indicativo de leite de baixa qualidade higiênico-sanitária. Nesta pesquisa foram analisadas 48 amostras e encontrados valores de microorganismos psicrotróficos entre 1,0 a 4,28 log10 UFC/mL. (SAEKI et al., 2010)
Contagens de psicrotróficos a partir de 6 log10 UFC/mL permitem modificações em leite e derivados, encurtando a vida útil dos mesmos. Em outro estudo relataram que normalmente é preciso que o leite tenha uma contagem acima de 6 log10 UFC/mL de microrganismos psicrotróficos para que se torne perceptível as mudanças de aroma e sabor do leite. (MAHIEU, 1991;  CHAMPAGNE et al. 1994)
Em um estudo que realizado em Alagoas, encontraram contagens de psicrotróficos de até 6 log10 UFC/mL em seus experimentos. Por sua vez, um trabalho realizado com leite de São Paulo, verificaram contagens de 2 a 3 log10 UFC/mL no leite pasteurizado e UHT. A presença de psicrotróficos no leite é um fato preocupante, pois o grupo possui a capacidade de produzir enzimas lipolíticas e proteolíticas termoresistentes, que mantém sua atividade após a pasteurização ou mesmo após o tratamento por UHT. (SILVA et al. 2008; ROSSI JÚNIOR et al. 2006) 
4 CONCLUSÃO 
	Por se tratar de análise microbiológica realizada com fins didáticos, não é possível atestar a qualidade microbiológica do leite estudado, uma vez que nem todo o protocolo de análise foi seguido criteriosamente. Pode-se afirmar, no entanto, que houve crescimento de microrganismos mesófilos, que se desenvolveram dentro de uma faixa ótima de temperatura (35ºC), e de micro-organismos psicrotróficos, incubados a uma faixa de temperatura máxima para a sua detecção (7ºC). Um dos vieses que se deve considerar é que trabalhos de pesquisa utilizam dez dias de incubação a 7º C, e no presente trabalho o período de incubação durou oito dias (dois dias a menos). É provável que caso o período de incubação fosse de dez dias, mais unidades formadoras de colônias tivessem sido identificadas.
Caso todas as etapas de análise fossem realizadas de acordo com o protocolo estabelecido e obtivéssemos os resultados acima citados, poderia-se atestar que o leite analisado não se encontra em boas condições higiênico-sanitárias, portanto estando impróprio para consumo, segundo Pinto et al. (2006). 
REFERÊNCIAS
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa n° 62, de 29 de dezembro de 2011. p. 12. 
CHAMPAGNE, C. P. et al. Psychrotrophs in dairy products: their effects and their control. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v. 34 , n. 1 , p. 1-30, 1994.
JAY, J.M. Microbiologia de Alimentos. Porto Alegre: Artmed, 2005, 6 ed., p. 712.
MAHIEU, H. Modificaciones de la leche despues de su recogida. In: LUQUET, F. M. Leche y Productos Lacteos. La leche de la Mama a la Lecheria. Zaragoza: Acribia, S. A., p. 181-226, 1991. 
MUNIZ, L. C.; MADRUGA, S. W.; ARAÚJO, C. L. Consumo de leite e derivados entre adultos e idosos no Sul do Brasil: um estudo de base populacional. Ciência & Saúde Coletiva, p. 3515-3522, 2013.
OLIVEIRA, Camilo Ferreira. Avaliação da eficácia do “tetra-test” como ferramenta de gestão da qualidade do leite cru refrigerado. São Paulo, 2009.
PAULA, F. P.; CARDOSO, C. E; RANGEL, M. A. C. Análise físico-químico do leite cru
refrigerado proveniente das propriedades leiteiras da região sul fluminense. Rev. Eletrônica TECCEN, Vassouras, v. 3, n. 4, p. 7-8, Out./Dez. 2010.
PINTO, C. J. O.; MARTINS, M. L.; VANETTI, M. C. D. Qualidade microbiológica de leite cru refri ger ado e isolamento de ba ctérias psicrotróficas proteolíticas. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 26, n. 3, p. 645-651, 2006.
ROSSI JUNIOR, O. D., et al. Estudo das características microbiológicas do Leite UAT ao longo de seu processamento. Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v. 73, n. 1, p. 27-32, 2006.
SAEKI, E. K.; MATSUMOTO, L. S. Contagem de mesófilos e psicotrópicos em amostras de leite pasteurizado e UHT. Rev. Inst. Latic. v. 65, n. 377, p. 29-35, Nov./Dez., 2010. 
SILVA, M. C. D. et al. Caracterização microbiológica e físico-química de leite pasteurizado destinado ao programa do leite do Estado de Alagoas. Rev. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, v. 1, n. 28, p. 226-230, Jan. 2008.
SILVA, N. et al. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água. 4 ed. São Paulo: Livraria Varela, 2010.
ZANELLA, M. S.; ROSSI, E. M. Pesquisa de psicrotróficos lipolíticos e proteolíticos do leite e análise da qualidade da água em propriedades rurais no extremo oeste de Santa Catarina. Trabalho de conclusão de Curso. Brasil, 2014.