HPLC

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CONCIFARMA?
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3 TALK SHOW
Fundamentos de 
Cromatografia Líquida 
de Alta Eficiência
Ingrid Ferreira Costa
Por que ÁGUA e ÓLEO
NÃO se misturam?
Respondam no Chat
Ingrid Ferreira Costa
▪ Bacharel em Química
▪ Bacharel em Química com Atribuições Tecnológicas
▪ Mestrado em Ciências Farmacêuticas
▪ MBA em Marketing Estratégico Digital
▪ Especialização em Growth Hacking
▪ Founder & CEO da Biochemie
Ingrid Ferreira Costa @ingrid.biochemie
Dúvidas do Curso
Até quando o curso ficará disponível?
01 de Junho de 2021 às 19 horas
Como minha presença será contabilizada?
Automaticamente
Como eu faço para obter meu certificado?
Será enviado por e-mail para quem assistir 75% do curso até 01 de 
Junho de 2021 às 19h. Prazo: 10 (dez) dias
Não recebi o meu certificado. O que eu faço?
Abrir um protocolo na página do CONCIFARMA
Agenda
Risadas Aprender
Por que ÁGUA e ÓLEO
NÃO se misturam?
Respondam no Chat
Você já JOGOU
VIDEOGAME?
PARABÉNS! Você é ESPECIALISTA 
em CROMATOGRAFIA e 
ESPECTROSCOPIA
Introdução
Separação
▪ Mistura = Dividida em, pelo menos, duas porções de composições químicas
distintas
Tipos de Separação Propriedades Físico-Químicas
Destilação Fracionada Ponto de Ebulição
Extração com Solvente Solubilidade, Polaridade
Cromatografia Afinidade das Substâncias, Compatibilidade
Química, Solubilidade, Polaridade, Tamanho dos
Analitos, pH, Pressão e Temperatura
Cromatografia
▪ Método que permite separar espécies químicas presentes em uma mistura
▪ Falou em SEPARAÇÃO? Apenas CROMATOGRAFIA
▪ Falou em IDENTIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO ou QUANTIFICAÇÃO?
CROMATOGRAFIA ACOPLADO A UM DETECTOR
▪ Tempo de Retenção 
▪ Quantidade de Substâncias (Informação Não-Conclusiva)
Cromatografia
▪ Separação – Migração diferencial dos componentes de uma mistura baseada
nas diferentes interações entre duas fases imiscíveis: Fase Móvel e Fase
Estacionária
Como ocorre a separação 
dos compostos?
Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e 
Estatística (IBGE), o número de divórcios no 
País cresceu 75% em cinco anos e, no meio do 
ano passado, o total de divórcios saltou para 7,4 
mil apenas em julho, um aumento de 260% em 
cima da média de meses anteriores.
Propriedades Físico-Químicas
Propriedades Físico-Químicas
▪ Dados do espectro (UV/Vis, FT-IR, NMR, MS, HRMS, XRD, etc.)
▪ Faixa do ponto de fusão e faixa do ponto de ebulição
▪ pH – acidez ou alcalinidade
▪ Densidade relativa e densidade aparente
▪ Tensão de superfície
▪ Solubilidade na água e solubilidade em solventes orgânicos
▪ Coeficiente de partição
Propriedades Físico-Químicas
▪ Viscosidade
▪ Estabilidade dos solventes orgânicos
▪ Constante de dissociação no meio aquoso
▪ Estado físico/ de agregação, aparência, cor, odor
▪ Pressão do vapor
▪ Reatividade com relação ao material do recipiente
▪ Distribuição do tamanho das partículas (granulometria)
▪ Hidrólise
Propriedades Físico-Químicas
▪ Fotólise no meio aquoso
▪ Estudos de estabilidade acelerados e de longo prazo (vida útil)
▪ Estabilidade térmica
▪ Estabilidade no solvente orgânico
▪ Constante de dissociação
▪ Polaridade
Forças Intermoleculares
Forças Intermoleculares
▪ Força de Dipolo Permanente
F > O > N > Cl > Br > I > S > C > P > H
Fui Ontem No Clube Brincar de Índio Só Comi Pizza Hut
▪ Somente em moléculas polares
▪ Elétrons estão distribuídos de forma assimétrica
▪ O elemento mais eletronegativo atrai os elétrons da
ligação e força um dipolo elétrico
Forças Intermoleculares
▪ Força de Dipolo Permanente
▪ A parte positiva atrai a parte negativa de outra molécula
▪ Intensidade média (é mais intensa que a força de
dipolo induzido, mas é menos intensa que a força da
ligação de hidrogênio)
Forças Intermoleculares
▪ Força de Dipolo Induzido
▪ Moléculas polares e apolares (os elétrons estão
distribuídos uniformemente, não havendo um dipolo
elétrico na molécula)
▪ Deformações nas nuvens de elétrons, pois há
atrações e repulsões entre os elétrons e os núcleos
dos átomos
Forças Intermoleculares
▪ Força de Dipolo Induzido
▪ Essa deformação é apenas temporária, mas forma
regiões do átomo ou da molécula que ficam com maior
quantidade de elétrons, ou seja, são formados dipolos
instantâneos
▪ Esse dipolo instantâneo pode induzir a molécula vizinha
a também se polarizar e assim surgem forças atrativas,
que são as forças de dipolo induzido
▪ Força de London - É de menor intensidade
Forças Intermoleculares
▪ Ligações de Hidrogênio
▪ Essa é a força intermolecular mais intensa
▪ H → F
H → O
H → N
+
δ-
δ+
F > O > N > Cl > Br > I > S > C > P > H
Qual a Finalidade de 
Separação?
Finalidade da Separação
▪ Concentração do Analito
▪ Desenvolvimento Analítico
▪ Análises de Via Úmida
Finalidade da Separação
Analítica
Separação cromatográfica 
e/ou quantificação
Descarte da Amostra 
Utilizada
Finalidade da 
Separação
Semi-preparativa
e preparativa
Coleta das 
frações da 
amostra
Descarte da 
Amostra 
Utilizada
Mecanismos de 
Separação
Cromatografia de Adsorção 
Cromatografia de Adsorção 
▪ Fase Estacionária = Sólida
▪ Fase Móvel = Líquida ou Gasosa
▪ Equilíbrio FE e FM
Cromatografia de Partição 
▪ Diferença de Solubilidade dos Componentes da FM e FE
▪ Soluto fica em equilíbrio entre FE e FM
▪ Amostra precisa ser Solúvel na FM
Cromatografia de Partição 
▪ Substâncias formadas por moléculas polares geralmente se dissolvem bem
em solventes formados por moléculas também polares. Substâncias
formadas por moléculas apolares geralmente se dissolvem bem em solventes
formados por moléculas também apolares.
▪ SEMELHANTES DISSOLVEM SEMELHANTES
Eletronegatividade
é a capacidade de o
átomo atrair, na sua
direção, o par de
elétrons que ele está
compartilhando com
outro átomo.
Cromatografia de Partição 
Cromatografia de Partição 
Cromatografia de Partição 
▪ Coeficiente de Solubilidade (Cs) - É a quantidade de uma substância, em
geral, em gramas, necessária para saturar uma quantidade padronizada de
solvente em determinadas condições físicas de temperatura e pressão
Cromatografia de Bioafinidade
▪ Propriedades biológicas ou
funcionais das espécies que
interagem com a coluna
▪ Isolamento seletivo de
macromoléculas biológicas
▪ Substâncias se unem
reversivelmente a ligantes
específicos
Cromatografia 
de Troca Iônica
▪ Separa íons e moléculas polares
com base em sua afinidade com o
trocador de íons
▪ Purificação de proteínas
▪ Diferenças de Carga (pH e Força
Iônica)
Cromatografia de Exclusão de 
Tamanho
▪ Separa as moléculas pelo tamanho molecular
E AS FORÇAS 
INTERMOLECULARES?
Solventes
▪ A CL é baseada na partição do soluto entre as FM e FE
▪ Pode-se entender a CL como uma cromatografia de adsorção, onde o soluto fica
adsorvido na FE
▪ O solvente (FM), compete com os solutos pelos sítios ativos de adsorção na FE
▪ A capacidade de eluição dos solventes independe da natureza do soluto
Solventes
▪ Quanto mais o solvente
se ligar na FE, maior será
sua força de eluição,
consequentemente,
menor a retenção do
soluto na FE
Solventes
▪ Força Eluente
▪ É uma medida da energia e adsorção do solvente (FM), considerando o valor de
pentano como “zero”
▪ Quanto maior a força do eluente, mais rápido é a eluição do soluto através
da coluna
▪ Quanto maior a polaridade de um solvente (FM), maior é sua força eluente
Série Eluotrópica
Harris – Quantitative Chemical Analysis
VAMOS CONHECER O 
EQUIPAMENTO?
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – CLAE
High-Permormance Liquid Chromatography – HPLC
▪ Técnica cromatográfica emprega elevadas pressões para
forçar a passagem do solventeatravés de colunas
fechadas que contêm partículas da ordem de micrômetros
▪ Possibilita maior eficiência de separação
▪ Empregada na separação de moléculas que sejam solúveis
na fase móvel
▪ Espécies iônicas
▪ Macromoléculas (elevada massa molecular)
▪ Moléculas com baixa estabilidade térmica
Esquematização
INJETOR
Injetor
▪ Injetor é o local por onde a amostra é introduzida
▪ Manual ou Automatizada - com o auxílio de um amostrador
▪ O sistema de injeção é composto por injetor e loop de injeção e está posicionado
após a cabeça da bomba
▪ A injeção de uma amostra à pressão atmosférica em um sistema de alta pressão
representa uma etapa crítica no processo cromatográfico
Injetor Manual
▪ Etapa 1 - Injeção por uma Seringa no loop a partir de uma porta na válvula de
injeção
▪ Etapa 2 - Depois que a amostra é totalmente inserida, a válvula é girada para a
posição "injetar". Sendo assim, os canais vão se mover e se conectar de maneira
diferente. A bomba agora é capaz de empurrar a FM a partir do loop da amostra,
transferindo a amostra para a coluna.
Injetor Manual
▪ Etapa 3 - Depois que a injeção é feita, a válvula é retornada à posição carga. Isso
permite o preenchimento de loop para a próxima injeção. Algumas pessoas
preferem deixar a posição de injeção até que a próxima injeção seja necessária
para liberar completamente o ciclo e reduzir o efeito carry-over.
Injetor Manual
Injetor Manual
Injetor Automatizado
▪ Válvula de Injeção
▪ Seringa ou Agulha de Amostragem
▪ Loop de Volume Fixo ou Ajustável
▪ Uma Bomba Dosadora para aspirar a
amostra do frasco
Como eu sei a QUANTIDADE de 
AMOSTRA que vai ser necessária 
para colocar no Vial?
Respondam no Chat
Como eu sei a QUANTIDADE de 
AMOSTRA que vai ser usada na 
Corrida Cromatográfica?
Respondam no Chat
FASE MÓVEL
Fase Móvel
▪ Reservatório de vidro ou aço inox (Mais Recomendado)
▪ Plástico não é recomendado (Compatibilidade Química)
▪ Tubulação que permite o acesso dos solventes
▪ Há um filtro de aço inox acoplado na extremidade
▪ Esse filtro possui porosidade variável, sendo
extremamente importante para remover algumas
partículas que possam vir a obstruir os tubos conectores
ou contaminar o sistema de bombas (Viscosidade)
Características da Fase Móvel
▪ A fase móvel deve dissolver a amostra sem que ocorra a decomposição, já que a
amostra deve ser transportada a partir da coluna sem que haja modificações nos
seus componentes. Geralmente, o solvente da amostra é utilizado como a própria
fase móvel ou é um dos seus componentes. O propósito é não prejudicar a
resolução do cromatograma, isto também, porque garante que a amostra não irá
sofrer precipitação no injetor ou na coluna.
Características da Fase Móvel
▪ Todos os solventes utilizados como fase móvel deve ter alto grau de pureza ou ter
fácil purificação, o mais recomendado é utilizar um solvente que tenha grau
cromatográfico, pois irá garantir que as análises realizadas tenham alta
sensibilidade. Ressaltando que as impurezas existentes na fase móvel podem
absorver e/ou diminuir a sensibilidade dos detectores, principalmente, os
detectores por fluorescência ou por absorbância no ultravioleta.
Características da Fase Móvel
▪ Os solventes com maior grau de
pureza para serem utilizados no HPLC
são os mais caros, porém, existe a
possibilidade de adquirir solventes com
menor grau de pureza e que são mais
baratos, desde que o processo de
purificação seja fácil.
Características da Fase Móvel
▪ Para obter-se melhor eficiência de
separação dos componentes da
amostra, a fase móvel deve ter baixa
viscosidade, isto porque, a
intensidade da vazão e o efeito de
transferência de massa entre fases
móvel e estacionária são fatores que
são influenciados pela viscosidade.
▪ Um dos fatores mais importantes é que
a fase móvel deve ser compatível com
o tipo de detector acoplado ao HPLC,
principalmente, em casos de eluição por
gradiente, já que o funcionamento do
detector é afetado pela mudança de
composição da fase móvel.
Características da Fase Móvel
▪ A fase móvel não pode decompor ou dissolver a fase estacionária. É uma
situação recorrente quando emprega-se a cromatografia líquido-líquido. Para que
isso não ocorra, a fase móvel deve ser saturada com a fase estacionária antes
de ser inserida no equipamento a partir de uma método de tratamento ou, mais
comumente empregado, usa-se uma pré-coluna que é composta de uma alta
percentagem da mesma fase estacionária líquida e possui um suporte sólido. Neste
caso, é a pré-coluna que perde a fase estacionária, já que ela irá passar pela fase
móvel antes de entrar no injetor.
Características da Fase Móvel
▪ Deve-se avaliar se a polaridade da fase móvel é adequada para separar, identificar
e/ou quantificar os componentes presentes na amostra em que está sendo
trabalhada.
SELETIVIDADE
Seletividade
▪ Hidrocarbonetos Alifáticos
▪ Olefinas
▪ Hidrocarbonetos Aromáticos
▪ Haletos
▪ Sulfetos
▪ Nitro Compostos
▪ Ésteres, Aldeídos e Cetonas
▪ Álcoois, Aminas
▪ Sulfonas
▪ Sulfóxidos
▪ Amidas
▪ Ácidos Carboxílicos
GRUPOS FUNCIONAIS (AMOSTRA) SOLVENTES ORGÂNICOS (FASE MÓVEL)
▪ Hexano
▪ Tetracloreto de Carbono
▪ Éter
▪ Benzeno
▪ Diclorometano
▪ THF
▪ Isopropanol
▪ Clorofórmio
▪ Acetato de Etila
▪ Acetonitrila
▪ Metanol
▪ Água
APOLAR
POLAR
FASE MÓVEL
Como as BOLHAS são 
formadas?
Respondam no Chat
Problemas com a FM
▪ Presença de Partículas
▪ Filtração - Filtro de porosidade 2 a 5 µm
▪ Surgimento de Bolhas
▪ Processo de Desgaseificação
▪ FM Polar tem grande tendência a dissolver oxigênio e outros gases
▪ Afeta o funcionamento do detector e eficiência da coluna
Como Preparar uma Fase Móvel?
Como o Fluxo de FM é Calculado?
V1
EXERCÍCIOS
EXERCÍCIO
▪ a) 0% de Acetonitrila
▪ b) 30% de Acetonitrila
▪ c) 50% de Acetonitrila
▪ d) 70% de Acetonitrila
▪ Proporção de Acetonitrila 92:8 - Tampão: pH 3,5
A B C D
EXERCÍCIO
▪ Em termos de seletividade e resolução. Qual o melhor pico
cromatográfico?
FASE 
ESTACIONÁRIA
Colunas Cromatográficas
Colunas Analíticas
▪ Suporte Sólido
▪ Material inerte que resiste a todas pressões - Ex: Aço Inox
▪ Diâmetro Interno Uniforme - Fluxo Constante ao longo da Coluna
▪ Resistentes a Elevadas Pressões
▪ Octadecil (C18, RP18, ODS), Octil (C8, RP8), CN (Cianopropil) e NH2 (Amina)
▪ Termostato (Temperatura Sob Controle)
▪ Possuem elevado custo e se degradam com facilidade
Pré-Colunas
▪ Impedir que as moléculas indesejadas façam parte da análise
▪ Sua composição deve ser igual ou muito semelhante à da
coluna de separação
▪ Evitar o entupimento da coluna
Colunas de Saturação
▪ Proteger a fase estacionária de ataques químicos
▪ Comum quando o suporte de sílica era recoberto por
um filme líquido
▪ Colunas com fase quimicamente ligada - descarta o
uso de coluna de saturação
Tamanho da Partícula
▪ Tamanho de partícula de sílica pode alterar a eficiência
▪ Menor o tamanho das partículas = Melhor resolução e Diminuição no tempo de
análise
▪ Com a redução do tamanho, temos o UHPLC que foi desenvolvido para que
suportassem maiores pressões
TIPOS DE ELUIÇÃO
Eluição Isocrática
▪ Eluição com apenas um solvente ou uma mistura de composição constante
▪ Um solvente pode ser insuficiente para promover uma separação adequada, ou
ainda, pode ser insuficiente para proporcionar uma separação rápida de todos os
componentes. Neste caso, emprega-se a eluição com gradiente.
Eluição com Gradiente
▪ O solvente é continuamente alterado do mais fraco para o mais forte em termos de
força eluente, através da adição de mais solvente forte ao solvente mais fraco
durante a cromatografia.
Exemplos
Exemplos
Exemplos
Exemplos
MODOS DE 
ELUIÇÃO
Fase Normal
▪ Fase normal = A FE é polar e a FM é apolar
Fase Normal
▪ VANTAGENS
▪ Alta seletividade de compostos (devido à versatilidade de troca de fases móvel e
estacionária)
▪ A maioriados compostos orgânicos é solúvel nos solventes da fase normal
▪ Maior estabilidade da fase estacionária devido a não utilização de solvente aquoso
Fase Normal
▪ DESVANTAGENS
▪ Corridas mais longas
▪ Custo elevado dos solventes
▪ Compostos iônicos ou altamente polares são de difícil separação
▪ Formação de bolas (devido aos pontos de ebulição baixos, por isso é importante um
controle da temperatura no ambiente e na coluna)
Fase Reversa
▪ Fase reversa = A FE é apolar e a FM é polar
DETECTORES
Fluorescência
▪ Responde aos analitos que fluorescem ou que podem se tornar fluorescentes por
derivatização
▪ A intensidade de emissão é proporcional à concentração do soluto
▪ O eluato é irradiado pelo detector em um comprimento de onda e mede a emissão
em um comprimento de onda maior
▪ Na fluorescência ocorre a emissão de um fóton durante a transição entre estados
de mesmo spin
▪ Na fosforescência ocorre a emissão de um fóton durante a transição entre estados
de spin diferentes
Arranjo de Diôdos
Arranjo de Diôdos
Arranjo de Diôdos
Espectrometria de Massas
Ingrid Ferreira Costa @ingrid.biochemie
Ingrid Ferreira Costa
contato@biochemieacademy.com