Relatório Bioengenharia

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
 CENTRO DE TECNOLOGIA
 DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
 LABORATÓRIO DE ENGENHARIA QUÍMICA III
BIOENGENHARIA - FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA: Acompanhamento da cinética de fermentação alcoólica
Grupo: 								 	 RA:
Beatriz Inoue Silva								 116757
Gabriel Leonardo Locatelli		 		 	 108520
Guilherme Fernandes Nakayama 108724
Luiza Carla Augusto Molina 105054
									
			
Turma: 5295 – 002 Professor Dr.: José Eduardo Olivo 
MARINGÁ, DEZEMBRO DE 2022
SUMÁRIO
1. RESUMO	3
2. INTRODUÇÃO	3
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA	4
4. MATERIAIS PARA FERMENTAÇÃO	6
4.1. Mosto	6
4.2. Agentes de fermentação	6
4.3. Controle do processo	6
4.4 Reação de fermentação	6
4.5. Cinética de fermentação	7
5. MATERIAIS E MÉTODOS	8
5.1. Preparação do substrato	8
5.2. Preparação da fermentação	8
5.3. Acompanhamento do núcleo de células	8
5.4. Determinação dos açúcares - métodos DNS	9
5.5. Formação de Etanol	9
6. RESULTADOS E DISCUSSÕES	10
7. CONCLUSÃO	19
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS	20
1. RESUMO
	Nessa prática, observamos uma fermentação em batelada com temperatura contínua, e colhemos dados da fermentação por amostragem e contagem de bolhas. Com as amostras parte deles foi separada para a destilação e posteriormente análise no cromatógrafo e outra parte passou por dissolução e pelo método do DNS para analisar a quantidade de açúcar redutor consumida pela fermentação.
2. INTRODUÇÃO
A fermentação é um processo pelo qual a matéria orgânica é parcialmente degradada e a energia química nela armazenada é liberada e utilizada na produção de moléculas de ATP (adenosina trifosfato), em que ficará armazenada para ser utilizada posteriormente em diversas reações do organismo. Existem várias formas de classificar os diferentes tipos de fermentação, geralmente são usados características como qual material é consumido ou qual material é formado para gerar essa classificação.
A fermentação alcoólica é um tipo de fermentação no qual açúcares como a glicose e a frutose são convertidos em energia. Como este processo pode ser realizado sem a presença de oxigênio é considerado um processo anaeróbico.
Praticamente todos os organismos vivos podem utilizar a glicose para produção da energia necessária para seus processos metabólicos. Neste processo, chamado glicólise, a glicose e alguns outros açúcares são transformados em outras substâncias, com liberação de energia.
O que determina quais substâncias serão produzidas depende do tipo de micro-organismos e o meio onde vivem. As leveduras de cervejaria e padaria e em todos os outros organismos que promovem a fermentação alcoólica, incluindo algumas plantas, fermentam a glicose em etanol e CO2, de forma que, neste processo, toda massa de glicose está contida nos produtos e não é utilizada outra substância como "matéria prima" (como oxigênio, nitrato, íons férricos, etc).
O processo de glicólise, comum às fermentações, produz ácido pirúvico, que no meio celular encontra-se ionizado na forma de piruvato e um intermediário reduzido, o NADH.
Como a quantidade de NADH é limitada e ele é necessário na sua forma oxidada (NAD+) na glicólise e, consequentemente, na continuação do processo de produção de energia, o NADH tem que ser oxidado. A forma como ele será oxidado caracteriza o tipo de fermentação, e quase sempre utiliza o outro subproduto da glicólise: o piruvato ou seus derivados.
Na fermentação alcoólica, o piruvato sofre descarboxilação (perda de um átomo de carbono, na forma de CO2), pela ação de uma enzima (piruvato descarboxilase, enzima esta que necessita de Mg2+para catalisar, possuindo também uma coenzima, a tiamina pirofosfato, auxiliadora na catálise), formando aldeído acético. Este aldeído sofre redução, oxidando o NADH para NAD+ e formando o etanol, processos intermediados pela enzima álcool desidrogenase.
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
A fermentação alcoólica é o processo onde as leveduras e algumas bactérias fermentam açúcares produzindo etanol e dióxido de carbono (CO2). A molécula de açúcar por exemplo, a glicose é convertida em duas moléculas de etanol e duas moléculas de dióxido de carbono por meio de múltiplas reações enzimáticas.
Na fermentação alcoólica, as duas moléculas de ácido pirúvico produzidas são convertidas em álcool etílico (ou etanol), com a liberação de duas moléculas de CO2 e a formação de duas moléculas de ATP. 
A espécie Saccharomyces cerevisiae é reconhecida como uma levedura onipresente com cepas naturais encontradas em plantas, animais, solos e ambientes aquáticos. Ela desenvolve um papel importante na elaboração dos produtos a partir de um processo fermentativo. Neste processo, o açúcar é transformado em dióxido de carbono, álcool etílico e outros compostos. 
A fermentação acontece em três etapas distintas: a pré-fermentação te início quando o fermento (leveduras) é adicionado ao mosto. Após cinco ou seis horas, inicia-se a fermentação principal, elevação da temperatura, queda da densidade do mosto por conta da transformação do açúcar e da formação do álcool. A acidez aumenta e abaixa o pH. Esse processo só tem término quando as espumas reduzem, sendo um indício que a fermentação terminou.
4. MATERIAIS PARA FERMENTAÇÃO
4.1. Mosto
· Mel final invertido, diluído 100 g/L e tamponado com pH 4,5;
· 1 mL de solução de invertase para cada 100 mL de mosto, contendo 4 mg/mL de invertase;
· 5 mL de solução de uréia, concentração 0,04 g/L;
· 5 mL de suspensão de fosfato comercial, concentração 0,1 g/L;
4.2. Agentes de fermentação
· Microorganismo: saccharomyces cerevisiae, concentração 50g/200g em base úmida.
4.3. Controle do processo
A temperatura durante o processo foi controlada por um banho termostático a 32 graus celsius. Todos os materiais usados foram esterilizados antes e durante, com auxílio de chama, o processo de amostragem. O processo foi realizado em um reator tipo tanque com 1 litro de volume, vedado na parte superior com rolha e uma saída lateral para o gás carbônico ser liberado. As leituras foram feitas em espectrofotômetro com auxílio de DNS.
4.4 Reação de fermentação
A reação global da fermentação alcoólica:
Primeiramente, a enzima piruvato descarboxilase age no piruvato com auxílio de e da coenzima tiamina-pirofosfato. Em seguida, o acetaldeído é reduzido a etanol pela ação da álcool-desidrogenase, com o poder redutor fornecido pelo NADH derivado da desidratação do gliceraldeído-3-fosfato.
4.5. Cinética de fermentação
Na cinética se estuda a velocidade das reações e os fatores que a influenciam, assim como a possibilidade de controle para obtenção de reações mais lentas ou mais rápidas, sendo importantes para que se possa interferir quando necessário.As variáveis definidas são: concentração do substrato (S) – onde o substrato é a glicose -, concentração do produto (P) – sendo o produto o etanol – e a concentração celular no reator (X) – que seria a quantidade de células do extrato de levedura. Também há a definição das velocidades de crescimento celular (rx), formação do produto (rp) e concentração de substrato (rs), calculadas por:
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1. Preparação do substrato
O meio de cultivo foi preparado com uma solução de mel final invertida através da adição de 1 mL de solução de invertase, 4 mg de enzima a cada mL de solução, para cada 100 mL de mosto. Todos os materiais foram esterilizados por autoclave a uma temperatura de 121 graus celsius durante 20 minutos.
A concentração inicial de substrato foi de 30 g/L, em um reator com volume de 1 litro contendo 10 mL de solução de uréia, concentração 0,04 g/L e 10 mL de suspensão de fosfato comercial, concentração 0,1 g/L.
5.2. Preparação da fermentação
Após o preparo do substrato, foi feita a adição do microrganismo Saccharomycescerevisiae, concentração de 50 g de microorganismo/200 g de água, e então adicionada água destilada esterilizada até a massa aproximada de 900 gramas. Por fim, a mistura foi homogeneizada de forma asséptica e em seguida transferida para o banho termostático a uma temperatura de 32 graus celsius para o experimento. Todos os valores citados foram anotados.
5.3. Acompanhamento do núcleo de células
Com a transferência do reator ao banho termostático, o cronômetro é acionado e a primeira amostra é retirada utilizando uma pipeta que é previamente esterilizada com uma chama. Essa amostra equivale ao ponto de referência com t = 0 minutos e, assim como as posteriores tiradas a cada 15 minutos (7 amostras, 90 minutos), possuem cerca de 15 mL. As amostras então são processadas, primeiramente sendo colocadas em banho de gelo por 3 minutos como forma de interromper a fermentação e então separar igualmente o volume entre dois tubos graduados de centrifugações. Após centrífuga-las em 2000-3000 rpm por 3 minutos, foi feita leitura da quantidade de material sedimentado e medido o pH de material sobrenadante, que então é devolvido ao frasco para que se possa realizar na dosagem de açúcares redutores e determinação de etanol feitas a seguir. 
5.4. Determinação dos açúcares - métodos DNS
Para a determinação dos açúcares redutores (AR) pelo método de DNS, foi feita a pipetagem de sobrenadante em 4,5 mL de água destilada, solução intitulada como D1, agitada manualmente e então posta em banho de água fervente durante 10 minutos. Após resfriar a temperatura ambiente, fez-se a diluição de 1:4 de 1 mL da solução de D1 com água destilada, intitulando essa solução como D2. Foi, então, pipetado 0,5 mL de D2 em 2,5 mL de DNS e outra amostra, para servir como referência, pipetando 0,5 mL de água em 2,5 mL de DNS. Os tubos foram deixados em banho de água fervente por 10 minutos e, depois de resfriados, acrescentados 3 mL de água destilada para, enfim, serem transferidos para uma cubeta e lidos em espectrofotómetro a 600 nm.
5.5. Formação de Etanol
Com o sobrenadante, foi transferido cerca de 10 mL do líquido para o responsável técnico para o processo de destilação e, depois de completar o destilado para atingir a base de 10 mL, levado para o acondicionamento em tubo com tampa e deixado no resfriador de armazenamento.
6. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Os valores iniciais de massa, volume e concentração do reator e dos componentes do meio foram aferidos e anotados, como observado abaixo na Tabela 1.
Tabela 1 - Massa, volume e concentração do reator e dos componentes do meio.
	
	Quantidade
	Mel invertido (g)
	300,4
	Inóculo (g/200mL)
	50
	Ureia (mL)
	10
	Reator (sem rolha) (g)
	572,78
	Superfosfato (mL)
	10
	Reator com rolha (g)
	641,55
	Mel + Ureia + Superfosfato + Sacharomicces (g)
	512,6
	Total (acima + H2O) (g)
	907,25
	Total + Rolha (g)
	976,24
	Volume total (final) (mL)
	777,83
Com isso, foi possível calcular a concentração inicial de X (o branco/referência) de 45,36 g/L. Durante o experimento, foram aferidos os valores de volume referentes ao crescimento celular para então o cálculo da concentração de células.
Tabela 2 - Resultados para análise do crescimento celular.
	t (min)
	VT1 (mL)
	VS1 (mL)
	%X1
	VT2 (mL)
	VS2 (mL)
	%X2
	%X3
	Xm(g/L)
	pH
	0
	8,5
	0,65
	7,647%
	8,5
	0,65
	7,647%
	7,647%
	76,47
	4,91
	15
	9
	0,6
	6,667%
	8,75
	0,6
	6,857%
	6,762%
	67,62
	4,75
	30
	6,5
	0,5
	7,692%
	6,5
	0,5
	7,692%
	7,692%
	76,92
	4,71
	45
	7,4
	0,5
	6,757%
	7,25
	0,5
	6,897%
	6,827%
	68,27
	4,69
	60
	9
	0,75
	8,333%
	8,75
	0,6
	6,857%
	7,595%
	75,95
	4,69
	75
	10,5
	0,75
	7,143%
	10,5
	0,75
	7,143%
	7,143%
	71,43
	4,83
	90
	9
	0,7
	7,778%
	9,25
	0,75
	8,108%
	7,943%
	79,43
	4,84
A concentração média das células foi de 75,95 g/L. Por conta das condições de preparo do meio, a concentração média de célula deveria estar próximo de 40 g/L. Além disso, observou-se que a concentração de células apresentou-se uma concentração constante.
	Para determinar a concentração do meio, foi medido a absorbância das amostras no espectrofotômetro, onde a concentração foi calculada pela curva padrão de DNS, conforme pode ser observado na Tabela 3 abaixo: 
Tabela 3: Concentração do meio ao longo do tempo. 
	t(min)
	Abs
	Sa (g/L)
	Diluição
	Sm (g/L)
	0
	0,426
	0,8549066827
	40X
	34,19626731
	15
	0,299
	0,6000401365
	40X
	24,00160546
	30
	0,274
	0,5498695565
	40X
	21,99478226
	45
	0,164
	0,3291190046
	40X
	13,16476018
	60
	0,096
	0,1926550271
	40X
	7,706201084
	75
	0,028
	0,05619104957
	40X
	2,247641983
	90
	0
	0
	40X
	0
A concentração de produto (etanol), foi determinada a partir da cromatografia, sendo os fatores de correção para a água e para o etanol 0,55 e 0,64 respectivamente. A tabela 4 apresenta os resultados fornecidos pela análise cromatográfica:
Tabela 4: Resultados da cromatografia.
	t(min)
	Área ETOH
	*Área corrigida ETOH
	Área H2O
	*Área corrigida H2O
	0
	1260
	806,4
	1800004
	990002,2
	15
	3466
	2218,24
	2738595
	1506227,25
	30
	8283
	5301,12
	1981764
	1089970,2
	60
	15398
	9854,72
	1676153
	921884,15
	75
	25273
	16174,72
	2532290
	1392759,5
	90
	20279
	12978,56
	1681873
	925030,15
A partir das áreas corrigidas para cada componente da mistura (etanol e água) foi possível calcular a fração molar e a fração mássica de cada componente e a concentração do etanol para cada amostra. Os cálculos foram realizados a partir das equações abaixo e os resultados estão apresentados na tabela 5 a seguir.
 
 
Tabela 5: Resultados para determinação da concentração de etanol. 
	t(min)
	X etanol, molar
	X água, molar
	X etanol, mássica
	X água, mássica
	C etanol (g/L)
	0
	0,0008138807031
	0,9991861193
	0,00207728743
	0,9979227126
	2,081611536
	15
	0,001470547007
	0,998529453
	0,003749487554
	0,9962505124
	3,763599122
	30
	0,004840006219
	0,9951599938
	0,01227647644
	0,9877235236
	12,42906152
	60
	0,01057669731
	0,9894233027
	0,02659183173
	0,9734081683
	27,31827469
	75
	0,01148011012
	0,9885198899
	0,02882333358
	0,9711766664
	29,6787748
	90
	0,01383628943
	0,9861637106
	0,03461439662
	0,9653856034
	35,85551359
Assim, foi possível plotar o gráfico Tempo x Concentração, para análise do comportamento da concentração de substrato, células e produto no decorrer da fermentação.
Figura 1 - Perfil da concentração de etanol durante o processo de fermentação
Com isso, foi possível analisar a presença de CO2 e o pH do meio durante o processo fermentativo. A tabela 6 abaixo retrata os dados obtidos durante a reção e a Figura 2 permite a análise do comportamento dessas variáveis.
Tabela 6: Dados de número de bolhas de CO2 e pH ao longo da reação.
	t(min)
	nº de bolhas de CO2/min
	8
	32
	18
	92
	30
	144
	49
	160
	64
	148
	80
	64
	92
	44
Figura 2 - Gráfico da quantidade de bolhas de CO2 durante o processo de fermentação.
Figura 3 - Gráfico do comportamento do pH do meio
	Da figura 2 e 3 observa-se que o valor mínimo de pH foi por volta dos 60 minutos e a maior quantidade CO2 foi observada aos 47 minutos. Esse comportamento pode ser justificado pela presença de CO2, que acidifica o meio. Ademais, da Reação 2, tem-se que a presença de CO2 no meio está diretamente relacionada à presença do etanol, que também acidifica o meio. Pelas equações das velocidades específicas é possível calcular aproximando as derivadas por deltas entre o ponto atual e o ponto anterior. Tendo em vista os pontos das tabelas 3, 4 e 5 tem-se que para o tempo de 15 minutos:
 
0,001492 1/s
	
Figura 4 - velocidades específicas do experimento
	Foi possível observar que a velocidade específica de produção de etanol possui um perfil muito semelhante com a produção do CO2. Como consequência tem-se que há uma correlação direta entre o produto de interesse e o gás expelido pela fermentação. 
7. CONCLUSÃO
Por meio das metodologias apresentadas foi possível observar os perfis de velocidades específicas para a fermentação alcoólica praticada. Para isso, foram utilizadas diversas técnicas de quantificação de substrato, de células e de produto.Como resultado, observou-se que a formação de produto está diretamente relacionada com o consumo do substrato, de forma que a velocidade da formação de bolhas se torna um bom indicador indireto da cinética da reação metabólica. 
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
SHIGEMATSU, E. Fermentação alcoólica na produção de etanol e os fatores determinantes do rendimento. Revista Ibero-Americana de Ciências Ambientais, v. 9, n. 4, 2018. DOI: 10.6008/CBPC2179-6858.2018.004.0023. 
LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W.; SCHMIDELL, W. Biotecnologia Industrial: Processos fermentativos e enzimáticos, Vol. 3. Editora Edgard Blucher LTDA, 2001. 
PACHECO, T. F. Fermentação alcoólica com leveduras de características floculantes em reator tipo torre com escoamento ascendente. Universidade Federal de Uberlândia, Faculdade de Engenharia Química, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, 2010. DOI: 10.52138/citec.v12i1.113. 
PEREIRA, D. A.; MACRI, R. C. V.; GIMENEZ, A. Z. Fatores que afetam a fermentação alcoólica. Ciência & Tecnologia, Fatec-JB, v. 12, n. 1, 2020. 
SCHMIDELL, W.; LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioquímica, Vol. 2. Editora Edgard Blucher LTDA