ANÁLISES DE ÁGUAS MINERAIS NATURAIS

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Universidade Federal de Pernambuco 
 
Centro de Ciências Biológicas 
 
Departamento de Antibióticos 
 
 
 
NOTAS SOBRE 
ANÁLISES DE ÁGUAS MINERAIS NATURAIS 
E ÁGUAS NATURAIS 
 
 
 
 
 
 
Ulrich Vasconcelos; Joás Lucas da Silva & Glícia M. T. Calazans 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RECIFE 
 
 
 
ANO 2012 
2 
 
 
ÁGUAS MINERAIS 
 
Ulrich Vasconcelos; Joás Lucas da Silva & Glícia Calazans (2012). 
 
 
 
1. DEFINIÇÃO 
 
São as águas obtidas diretamente de fontes naturais ou artificialmente 
captadas, de origem subterrânea, caracterizada pelo conteúdo definido e 
constante de sais minerais e pela presença de oligoelementos e outros 
constituintes (Resolução nº 274/2005 MS). 
 
 
2. CLASSIFICAÇÃO 
a) Quanto à composição química: oligominerais, radíferas, alcalina-
bicarbonatadas, alcalino-terrosas cálcicas ou magnesianas, sulfatadas, 
sulfurosas, nitratadas, cloretadas, ferruginosas, etc. ; 
 
b) Quanto a adição de dióxido de carbono: água sem gás e água gaseificada. 
 
 
3. LEGISLAÇÃO 
 Código de Águas do Brasil - decreto-lei nº 7841/45; 
 Resolução nº 310/99 MS; 
 Resolução nº 274/2005 /MS. 
 Resolução nº 275/2005 /MS. 
 RDC nº 173, de 13 de setembro de 2006. 
 
Essa última, no que se refere aos aspectos microbiológicos, determina que 
essas águas na fonte, poço ou local de surgência, assim como na 
comercialização, devem estar em conformidade com as seguintes 
características: 
 
 
 
3 
 
 
 
 
TABELA 01 
 Amostra indicativa Amostra representativa 
 
 
Microorganismos 
 
 
Limites 
 
Nº de 
amostras 
 
Nº de amostras com 
resultado entre o 
mínimo e máximo 
 
Limite 
mínimo 
aceitável 
 
Limite 
máximo 
aceitável 
 
E. coli ou 
coliforme (fecais) 
termotolerantes 
em 100 ml 
 
 
Ausência 
 
 
05 
 
 
0 
 
 
- 
 
 
Ausência 
 
 
Coliformes totais 
em 100 ml 
< 1,0 UFC; 
< 1,1 NMP 
ou 
Ausência 
 
 
05 
 
 
01 
<1,0 UFC; 
<1,1 NMP 
ou 
Ausência 
 
2,0 UFC 
ou 2,2 
NMP 
 
 
Enterococos em 
100 ml 
< 1,0 UFC; 
< 1,1 NMP 
ou 
Ausência 
 
 
05 
 
 
01 
<1,0 UFC; 
<1,1 NMP 
ou 
Ausência 
 
2,0 UFC 
ou 2,2 
NMP 
 
Pseudomonas 
aeruginosa em 
100 ml 
< 1,0 UFC; 
< 1,1 NMP 
ou 
Ausência 
 
 
05 
 
 
01 
<1,0 UFC; 
<1,1 NMP 
ou 
Ausência 
 
2,0 UFC 
ou 2,2 
NMP 
 
Clostrídios 
sulfito redutores 
ou C. perfringens 
em 100 ml 
 
< 1,0 UFC; 
< 1,1 NMP 
ou 
Ausência 
 
 
05 
 
 
01 
 
<1,0 UFC; 
<1,1 NMP 
ou 
Ausência 
 
 
2,0 UFC 
ou 2,2 
NMP 
4 
 
 
Em termos bacteriológicos, essas fontes ou poços, em geral, produzem água 
de boa qualidade, mas não são completamente estéreis, possuem flora 
autóctone como bactérias pertencentes aos gêneros Pseudomonas, 
Acinetobacter, Alcaligenes, Flavobacterium, Micrococcus, Bacillus (Varnam & 
Sutherland / 1994 in Cabrini & Gallo / 2001). 
 
A vigilância da qualidade da água, do ponto de vista microbiológico, 
normalmente não é feita partindo-se da identificação completa dos 
microrganismos presentes na água, mas a partir da determinação de grupos 
de significado higiênico e sanitário. 
 
No caso das águas minerais, além dos microrganismos usualmente 
requeridos para avaliação bacteriológica de águas de consumo humano e da 
rede de distribuição, que são os coliformes totais e fecais (Portaria nº 518 - 
MS), exige-se também a pesquisa de Enterococos, Pseudomonas aeruginosa 
e Clostrídios sulfito redutores. A contagem de bactérias heterotróficas é um 
parâmetro utilizado muito mais para verificar as condições higiênico-sanitárias 
do sistema industrial (Cabrini & Gallo/2001). 
 
Classificação desses indicadores de acordo com o tipo de uso: 
 E. coli e Enterococos - contaminação fecal recente; 
 Esporos de Clostrídios - Poluição fecal remota; 
 Pseudomonas aeruginosa e Aeromonas hydrophila - poluição por 
nutrientes. 
 
4. COLETA DAS AMOSTRAS 
 
 As amostras devem ser coletadas no ponto de captação, linha de produção 
e nos pontos de comercialização; 
 As amostras devem estar devidamente identificadas: na fonte - nº, hora da 
coleta, local, pH, temperatura; envasadas - marca comercial, nome da 
fonte, conteúdo líquido, data do envasamento, lote, etc. ; 
 O volume mínimo a ser analisado é 1000 ml; 
 Amostras coletadas na fonte, realizar as análises entre 6 e 24 horas após a 
5 
 
 
coleta. Essas amostras devem ser transportadas sob refrigeração (4° a 
10°C); 
 As amostras envasadas devem ser transportadas em boas condições de 
assepsia e não necessitam de refrigeração até o momento da análise. 
 
5. ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DE ÁGUA 
 
As técnicas para determinação do conteúdo microbiológico das águas 
minerais consistem basicamente em: 
 Técnica da membrana filtrante; 
 Técnica dos tubos múltiplos. 
 
O que permitirá a diferenciação dos micro-organismos é o meio utilizado em 
cada uma das técnicas citadas (Tabela 02). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
 
TABELA 02 
 
 
Microrganismos 
 
Membrana filtrante 
 
Tubos múltiplos 
 
 
 
 
 
 
Bactérias do grupo Coliforme 
 
 
 
 
 
 
 
 
Meios de cultura - M-Endo 
ágar LES ou Ágar M-Endo. 
 Ensaio presuntivo - meio 
de caldo lactosado (CL) ou 
caldo lauril triptose (CLT); 
 Ensaio confirmativo - 
meio de caldo lactosado com 
verde brilhante e bile a 2% 
(CLVBB) para coliformes 
totais; e meio EC para 
coliformes fecais; 
 Ensaio completo - meio 
ágar eosina azul de metileno 
(EAM) 
 
 
Enterococos 
 
 
Meio de cultura - Ágar M-
Enterococos 
 Ensaio presuntivo - meio 
caldo dextrose azida 
(CDA); 
 Ensaio confirmativo - 
meio de ágar PSE. 
 
 
Pseudomonas aeruginosa 
 
Meio de cultura - Ágar-mPA-B; 
Confirmação em placa com 
meio de ágar leite. 
 Ensaio presuntivo - meio 
de caldo asparagina; 
 Ensaio confirmativo - 
meio de caldo acetamida. 
Clostrídios Meio de cultura - Ágar m-CP 
 Ensaio presuntivo - meio 
diferencial enriquecido para 
clostrídios (DRCM); 
 Ensaio confirmativo - 
meio de leite tornassolado 
Fonte: Atualização em técnicas para o controle microbiológico de águas minerais/1999. 
 
 
 
 
 
7 
 
 
OUTRAS CONSIDERAÇÕES 
 Para determinação de bactérias do grupo coliforme podem ser utilizadas 
as técnicas de Presença-Ausência (P-A) e do substrato cromogênico e 
fluorogênico; 
 Todos os meios, após inoculação, são incubados a 35°C durante 48 horas, 
com exceção do meio EC para coliformes fecais que deverá ser incubado 
a 44,5° durante 24 horas, do meio ágar-mPA-B (membrana filtrante) para 
Pseudomonas que deverá ser incubado a 41,5°C por 48 horas e do meio 
ágar m-CP (membrana filtrante) para clostrídios que deverá ser incubado a 
45° durante 24 horas; 
 Antes de proceder às análises para identificação de clostrídios, faz-se 
necessário o aquecimento da amostra em banho-maria a 65°C durante 15 
minutos para eliminar organismos não esporulados e formas vegetativas. 
Além disso, todos os meios devem ser incubados em anaerobiose, pois 
esses micro-organismos são anaeróbios obrigatórios; 
 A técnica para determinação de bactérias heterotróficas utiliza o meio de 
cultura ágar triptona glicose extrato de levedura (PCA). 
 
DETALHAMENTO DOS MÉTODOS PASSÍVEIS DE USO 
Métodos: 
 Para todos os microrganismos pesquisados pode ser aplicada a técnica 
convencional dos tubos múltiplos a qual subdivide-se no ensaio presuntivo, 
confirmativo e completo, expressando-se os resultados em número mais 
provável por 100 mL (NMP) (Fig. 1). 
 
1) Ensaio presuntivo: 
 Consiste na inoculação de volumes de 10, 1 e 0,1 mL de água a ser 
analisada numa série de nove tubos. Os tubos que recebem inóculos de 10 mL 
contem meio de cultura com concentração dupla a fim de compensar a diluição. 
Os volumes de 1 e 0,1 mL da amostra são inoculados em meio deconcentração simples. O ensaio visa ao enriquecimento da amostra e um 
resultado positivo, dentro de 24-48h, é apenas sugestivo de água 
contaminada, pois pode haver interferência de outros microrganismos 
8 
 
 
devendo-se, portanto, dar seguimento a análise. 
 
Fig. 1. Fluxograma hipotético geral da técnica de tubos múltiplos para análise de água 
mineral e potável de mesa. Onde; Tubos negros = resultado positivo. Tubos brancos 
= resultado negativo 
 
 2) Ensaio confirmativo: 
 Todos os tubos positivos no ensaio presuntivo devem ser submetidos ao 
ensaio confirmativo o qual consiste na inoculação dos ensaios presuntivos 
positivos em meio de cultura seletivo para a bactéria ou grupo de bactérias 
pesquisadas reduzindo-se a possibilidade de ocorrência de resultados falso-
positivos. Um resultado positivo confirma a presença de bactérias indicadoras 
de contaminação (COSTA, 1980; SANCHES, 1999). 
 
3) Ensaio completo: 
 Este ensaio é caracterizado pela realização de provas adicionais, não sendo 
obrigatório. Consiste na utilização de provas bioquímicas adicionais para 
identificação da espécie ou quando se suspeita da interferência de 
Ensaio confirmativo (24-48h/35oC) 
 
Ensaio completo (opcional) 
1000 mL de água mineral a ser analisada 
Ensaio presuntivo (24-48 h/35oC) 
 
9 
 
 
microrganismos nos ensaios anteriores (STANDARD METHODS, 1998). 
 
4) Expressão dos resultados em número mais provável de bactérias por 
100mL (NMP): 
 A combinação de resultados positivos e negativos no ensaio confirmativo 
permite a obtenção de uma estimativa da densidade original das bactérias 
(NMP) através da aplicação de cálculos de probabilidade (COSTA, 1980; 
STANDARD METHODS, 1998) predeterminados na tabela de Hoskins (em 
ANEXOS). Os resultados são expressos em número mais provável de 
bactérias por 100mL. 
Microrganismos pesquisados 
 As amostras foram avaliadas quanto a presença de coliformes totais e 
fecais, Estreptococos fecais, Pseudomonas aeruginosa e Clostridium 
perfringens, e quando positivas no ensaio presuntivo e confirmativo submetidas 
a testes adicionais para descartar possíveis interferências de outros 
microrganismos que não os pesquisados. 
 Para a pesquisa de coliformes totais foi utilizado o meio de caldo 
lactosado, concentração dupla e simples (CLD e CLS), no ensaio presuntivo e 
caldo lactosado verde brilhante bile a 2% (CLVBB 2%) para a confirmação do 
ensaio presuntivo. Em ambos a incubação é feita durante 24-48h a 35oC. Uma 
alçada, de cada tubo confirmativo positivo, foi semeada em eosina azul de 
metileno (EMB), colônias típicas e atípicas foram transferidas para caldo E.C e 
incubadas por 24h a 44,5oC  0,02 para verificação da presença de coliforme 
fecal. 
 Na pesquisa de Pseudomonas aeruginosa, a formação de pigmento 
esverdeado ou turvação do meio de caldo asparagina, em 24-48h a 35oC, 
significa resultado presuntivo positivo. Inóculos destes tubos positivos foram 
transferidos para o meio caldo acetamida a fim de serem confirmados. Das 
amostras confirmadas, fez-se semeio em ágar leite e ágar cetrimida para 
descartar possíveis microrganismos que não o pesquisado. 
 O caldo dextrose azida (CDA), um ótimo inibidor de Gram negativos e o ágar 
seletivo para enterococos (PSE) foram utilizados para identificação presuntiva 
e confirmativa de estreptococos fecais, respectivamente. 
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 Para isolamento prévio de Clostridium perfringens, foi utilizado o caldo 
diferencial para clostrídios (DRCM). Os inóculos foram incubados em jarra de 
anaerobiose por 48h a 350C e possíveis amostras positivas inoculadas em 
caldo de leite tornassolado para confirmação. 
 Embora não utilizada, rotineiramente, na avaliação microbiológica de água 
mineral, mas apenas de águas potáveis, foi feita também a contagem de 
bactérias heterotróficas em placas (número de colônias desenvolvidas em 
aerobiose a 35oC por 48h em placas de Petri, contendo o meio PCA). Utilizou-
se a técnica de incorporação, inoculando-se volumes em triplicatas de 1 e 0,1 
mL. Esse dado informa sobre as condições higiênicas das fontes e possíveis 
causas de deterioração da qualidade de água, uma vez que um elevado 
número dessas bactérias causa odor e sabor desagradáveis. 
 O pH e a temperatura da amostra foram aferidos, após a retirada da água 
do garrafão para um recipiente diferente do utilizado para a análise 
microbiológica. 
Amostragem: 
 
1) Homogeneiza-se a água, invertendo-se o garrafão por diversas vezes. 
2) O bocal do garrafão é desinfetado com álcool a 70% ou solução de 
hipoclorito de sódio. 
3) Retira-se o lacre com objeto desinfetado e desprezou-se um volume inicial. 
4) Faz-se a coleta próximo ao bico de Bunsen, para recipiente estéril e as 
amostras coletadas (1000mL) são, imediatamente, inoculadas, sendo o 
restante colocado sob refrigeração. 
 5.2.4 Princípio dos meios de cultura utilizados (composição em ANEXO): 
 
1) Caldo lactosado (CL). 
 É utilizado para a determinação de uma possível contaminação por coliforme 
total em água. A simples detecção de gás no tubo de Durham, resultante da 
fermentação da lactose com produção de ácidos e gás CO2 , caracteriza um 
ensaio presuntivo positivo para coliforme total (BIER, 1990). 
 
2) Caldo lactosado verde brilhante bile a 2% (CLVBB 2%). 
11 
 
 
 Indicado para o enriquecimento seletivo de Escherichia coli .Os 
componentes verde brilhante e a bile de boi, inibem, notavelmente, as bactérias 
acompanhantes Gram positivas, inclusive clostrídios degradadores de lactose 
(MANUAL MERCK, 1990). A fermentação da lactose, com conseqüente 
formação de hidrogênio e CO2 , caracteriza um ensaio confirmativo positivo 
para a presença de coliforme total. 
 
3)) Eosina azul de metileno (EMB). 
 É um meio diferencial, em placas, para o isolamento de bactérias entéricas 
Gram negativas. Os corantes eosina e o azul de metileno inibem Gram 
positivas e Gram negativas exigentes. Em meio ácido, esses corantes de 
anilina precipitam funcionando, assim, como indicadores de pH (KONEMAM et 
al., 2001). As bactérias fortes fermentadoras de lactose apresentam-se como 
colônias verde- escuras metálicas, as fermentadoras fracas produzem colônias, 
levemente, púrpuras e os não fermentadores colônias transparentes. 
 
4) Meio para coliformes fecais ( E.C). 
 Consiste num caldo lactosado tamponado adicionado de sais biliares, a fim 
de se inibir o crescimento de Estreptococos fecais (SANCHEZ, 1999). Pode ser 
utilizado para a pesquisa de coliformes totais desde que incubado a 350C. No 
entanto, para a pesquisa de coliforme fecal (E. coli) deve ser incubado a 44,50C 
 0,02, pois o crescimento a essa temperatura é característica dessa bactéria 
nas condições nutricionais ensaiadas (MANUAL DIFCO, 1984). Os sais biliares 
inibem, notavelmente, o crescimento de germes Gram positivos e espécies 
microbianas não adaptadas ao meio ambiente intestinal ( MANUAL MERCK, 
1990). 
 
5) Caldo asparagina. 
 A asparagina, adicionada ao meio, é o aminoácido utilizado como única fonte 
de nitrogênio e carbono pela Pseudomonas aeruginosa. O desenvolvimento 
dessa bactéria é caracterizado pela turvação e pigmentação esverdeada 
(piocianina) do meio, melhor visualizada em luz ultravioleta (SANCHEZ, 1999). 
 
6) Caldo acetamida. 
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 Neste meio a acetamida apresenta-se como única fonte de carbono e 
nitrogênio, sendo importante para o enriquecimento seletivo de Pseudomonas 
aeruginosa. A alcalinização do meio, evidenciada pela mudança de cor do 
indicador vermelho de fenol, caracteriza um resultado confirmativo positivo 
(MANUAL MERCK, 1990). 
 
7) Ágar cetrimida. 
 Meio seletivo utilizado para o isolamento e identificação de Pseudomonas 
aeruginosa. A cetrimida, como detergente catiônico, é um importante inibidor 
de bactérias distintas da Pseudomonas aeruginosa, agindo na liberação de 
nitrogênio e fósforo da célula bacteriana (MANUAL DIFCO, 1984). Uma 
concentração de 0,3g/L já exerce atividade inibitória suficiente sobre a flora 
acompanhante, podendo-se utilizar 15g/mL de ác. Nalidíxico para aumentar a 
eficácia (MANUAL MERCK, 1990). As colônias de Pseudomonas aeruginosa 
formam um pigmento verde azulado fluorescente à luz ultravioleta. 
 
8) Caldo dextrose azida (CDA). 
 A presença de Estreptococos fecais em água é um importante indicador de 
contaminação fecal. O CDA é um meio que contém todos os fatores nutrientes 
requeridos para o crescimento de enterococos. A azida sódica (NaN3), presente 
em uma concentração, suficientemente, inibitória para a flora acompanhante, 
exerce um efeito bacteriostático sobre as bactérias Gram negativas. A 
fermentação da dextrose pelas bactérias, detectada pela formação de 
precipitado no meio ou turvação, permite suspeitar de Estreptococos fecais ( 
MANUAL MERCK, 1990). 
 
9) Meio seletivo para Estreptococos fecais (PSE). 
 Ágar seletivo para o ensaio confirmativo de estreptococos fecais. Estes 
microrganismos hidrolizam a esculina do meio produzindo glicose e esculetina 
a qual reage com o íon férrico, formando um complexo enegrecido e difusível 
no meio ( SANCHEZ, 1999). 
 
10) DRCM. 
 Meio diferencial enriquecido para clostrídios sulfito redutores no qual as 
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bactérias reduzem o sulfito, contido no meio, para sulfeto, enegrecendo-o. 
 
11) Leite tornassolado (Litmus Milk). 
 Clostrídios sulfito redutores fermentam o leite tornassolado com coagulação 
do caseinogênio. A fermentação da lactose pelos clostrídios sulfito redutores 
produz ácido forte, variando a cor do meio para rosa. A grande quantidade de 
gás formada caracteriza o que chamamos de fermentação turbulenta do meio 
(JAWETZ et al.,1998; SANCHES, 1999). 
 
12) "Plate count ágar" (PCA). 
 Meio sólido utilizado, em placas, para determinação da quantidade de 
bactérias heterotróficas. É um meio de cultura que apresenta todos os 
nutrientes necessários ao crescimento de bactérias heterotróficas, além da 
transparência e maior facilidade de visualização das colônias. 
 
 
BIBLIOGRAFIA 
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 
Resoluções nº 274, 275/2005 MS. Ver In: DIÁRIO OFICIAL DA UNIÃO. 
Brasília - DF. 
CABRINI, K. T. & GALLO, C. R. Avaliação da qualidade microbiológica de 
águas minerais envasadas. In: Higiene Alimentar, v.15, nº 90/91, p.83-92, 
nov/dez 2001. 
MERCK. Manual de medios de cultivo. Rio de Janeiro, 1990. 
PIRES, E. F., GUERRA, N. B. & STAMFORD, T. L. Behavior of autochthonous 
flora of a ground water. In: XXI Congresso Brasileiro de Microbiologia - 
Resumos. Foz do Iguaçu - PR, 2001. 
SANCHEZ, P. S. Atualização em técnicas para controle microbiológico de 
águas minerais. Universidade Mackenzie, São Paulo - SP. 1999. 
Silva, N. et al. Manual de Métodos de Análise Microbiológica da Água. São 
Paulo, Ed. Varella, 2005. 
Standard Methods for Examination of Water and Wastewater. 21th Edition. 
Washington, D.C., American Public Health Association, 2005. 
 
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