Instrumentação Biomédica 3

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Técnicas de diagnóstico laboratorial
As técnicas de diagnóstico laboratorial são de grande relevância para a assistência à saúde por fornecerem base para decisões médicas. Elas auxiliam a elucidar diagnósticos e, deste modo, tanto a prescrição e monitoramento terapêutico quanto a tomada de decisões relativa a internar ou dar alta hospitalar.
Entre os fatores que conferem a confiabilidade dos resultados, destacam-se a qualidade técnica, a tecnologia empregada, a origem confiável dos materiais e suprimentos e a eficiência e implantação de mecanismos para a prevenção de falhas em potencial (SBPC/ML, 2020).
O século XXI é marcado por grandes avanços na área de análises clínicas, com inovações de metodologias disponíveis em diversas áreas: hematologia, imunologia, urinálise, imunologia, bioquímica, microbiologia e patologia. A harmonização dos métodos e equipamentos é orientada pela busca da segurança do paciente, dos prontuários eletrônicos de saúde e a consolidação de serviços de laboratório em grandes cadeias regionais ou nacionais, entre outros. 
As melhores práticas do laboratório clínico definem a verificação periódica da comparabilidade dos resultados obtidos quando o mesmo analito é examinado em diferentes equipamentos, conferindo padrão de excelência. O laboratório deve avaliar a relação entre os resultados para o mesmo teste realizado por meio de diferentes metodologias ou instrumentos e em locais diferentes, atendendo os programas de acreditação laboratorial nacionais (Programa de Acreditação em Laboratórios Clínicos – PALC e Organização Nacional de Acreditação – ONA) e internacionais.
Por fim, comutabilidade é a capacidade de comparar os resultados obtidos em análises de amostras clínicas autênticas submetidas a análises diferentes, medidas por mais de uma plataforma analítica. Desta maneira, a comutabilidade apresenta equivalência das relações matemáticas entre os resultados de diferentes sistemas analíticos para um material de referência, além de amostras representativas de indivíduos saudáveis ou doentes para determinado analito (SBPC/ML, 2020).
Aplicação das técnicas em hematologia
As técnicas de hematologia são utilizadas para avaliar os componentes do sangue dos pacientes. Isto é muito útil na triagem e seleção de doadores de sangue, no pré-operatório e no diagnóstico e seguimentos de diversas doenças. Existem vários tipos de técnicas utilizadas para avaliar alterações relacionadas à produção das células e de suas funções, fatores de coagulação, resposta imunológica, entre outros.
As técnicas manuais têm sido automatizadas, posto que estas são capazes de realizar um maior número de exames e padronizar os procedimentos, diminuindo erros da fase analítica. Contudo, há casos nos quais os resultados fornecidos por meio automatizado requerem o olhar atento e experiente do laboratorista. Assim, a seguir, analisaremos a aplicação de algumas das inúmeras técnicas utilizadas em hematologia.
// Hemograma completo
Este exame é utilizado para diagnóstico inicial de anemias, leucemias, infecções e inflamações. Quando os resultados forem anormais, podem indicar necessidade de investigação mais pormenorizada. Atualmente, o hemograma automatizado completo inclui diversos tipos de procedimentos analíticos:
Eritrograma: analisa a série vermelha em busca de alterações patológicas do sistema eritropoético, como eritrocitoses (aumento do número de eritrócitos) e anemias (diminuição do número de eritrócitos). Os eritrócitos normais são bicôncavos, exibem forma e tamanho homogêneos e são chamados normocíticos. Quando apresentam coloração normais são chamados de normocrômicos. Os valores normais de eritrócitos são homem: 5.000.000 a 5.500.000 e mulher: 4.500.000 a 5.000.000 (em número por litro);
Dosagem da hemoglobina pelo método da cianometemoglobina: utilizada para dosar todas as formas de hemoglobina, exceto a sulfemoglobina. Considera-se anemia quando o resultado de hemoglobina (Hb) for menor que 12,5 g/dl em adultos, 11 g/dl em crianças de 6 meses a 6 anos e 12 g/dl em crianças de 6 a 14 anos;
Determinação do hematócrito: determina a quantidade de eritrócitos em 100 ml de sangue total. Os valores médios variam de acordo com o sexo e idade. Assim, homem: 8 a 50%; mulher: 36 a 45%; e recém-nascidos: valores altos, que vão baixando com a idade;
Índices hematimétricos ou Índices hematológicos: determinados pelo contador eletrônico de células, auxiliam a caracterizar o quadro anêmico;
Volume corpuscular médio (V.C.M): representa o quociente de determinado volume de eritrócitos pelo número de células contidas no mesmo volume, sendo o resultado do VCM expresso em fentolitros (fl). Este índice indica o tamanho dos eritrócitos, cuja alteração se chama anisocitose, e auxilia no diagnóstico do tipo de anemia: 
Hemoglobina corpuscular média (H.C.M.): é o conteúdo médio (peso) de hemoglobina nos eritrócitos, sendo expresso em picogramas. Representa o quociente do conteúdo de hemoglobina em determinado volume de eritrócitos pelo número de células contidas no mesmo volume;
Concentração de hemoglobina corpuscular média (C.H.C.M.): é a concentração de hemoglobina nos eritrócitos, cujos valores normais ficam entre 32 e 36 g/dl, conferindo-lhes coloração normal – normocrômicos. Eritrócitos com menos de 32 g/dl são hipocrômicos e com mais de 36 g/dl são hipercrômicos; 
Leucograma: é a contagem global e específica dos vários tipos de leucócitos, que são as células responsáveis pela imunidade: neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos e monócitos. A variação do número de leucócitos pode ocorrer em situações fisiológicas e patológicas. A leucocitose (aumento do número de leucócitos) é sugestiva de processos infecciosos, inflamatórios e tóxicos, mas também pode ocorrer em leucemias, como o mieloma. 
Por outro lado, a leucopenia (diminuição do número de leucócitos) indica que a medula óssea está com a capacidade proliferativa comprometida, o que pode ocorrer por doenças infecciosas, como leishmaniose visceral e malária, neoplasias, deficiência de folatos e vitamina B12, tratamento por radioterapia e quimioterapia para câncer, entre outros. Pessoas com leucopenia possuem capacidade imunológica deficiente e encontram-se vulneráveis a infecções. Assim, a avaliação específica do número dos leucócitos auxilia no diagnóstico de diversas alterações patológicas.
A contagem manual de eritrócitos e leucócitos, realizada em esfregaços de sangue diluídos e corados com Leishman ou Giemsa, permite a análise morfológica de cada tipo celular utilizando a objetiva de 100x. Pode-se realizar também a contagem em câmara de Neubauer. Contudo, esses métodos manuais somente são utilizados quando houver dúvidas da metodologia automatizada.
As anemias são condições caracterizadas pela diminuição de hemoglobina nos eritrócitos e a redução da quantidade dessas células no sangue, comprometendo sua capacidade de transportar o oxigênio para os tecidos. Elas são acompanhadas pela diminuição do hematócrito. 
Considera-se anemia quando a taxa de hemoglobina estiver abaixo de níveis mínimos, ou seja, 95% do intervalo de referência para a idade, sexo e localização geográfica. Ressalta-se que pessoas que vivem em altas altitudes apresentam maior quantidade de hemoglobina para compensar a menor concentração de oxigênio na atmosfera.
As anemias em si não são doenças, mas sintomas de doenças responsáveis pela perda de sangue, deficiência de eritropoiese ou lise de eritrócitos. O tratamento correto depende da realização das técnicas de exames adequados para diagnosticar a causa da diminuição de eritrócitos e de hemoglobina.
// Anemias por perda de sangue
Existem várias causas que levam à perda de sangue, como neoplasias e doenças infecciosas. Os ancilostomídeos, por exemplo, são parasitas intestinais que consomem grande volume de sangue e pacientes que apresentam elevada carga parasitária podem desenvolver anemia. Nesse caso, o paciente deverá ser tratado com antiparasitários e sulfato ferroso.
// Anemias por eritropoiese deficiente (anemias linfoproliferativas)São provocadas por falhas na produção dos eritrócitos e podem ser identificadas pela presença de eritrócitos imaturos no esfregaço de amostras do sangue periférico (reticulocitopenia). A análise dos índices hematimétricos, sobretudo o volume corpuscular médio, podem auxiliar a esclarecer o diagnóstico diferencial destas anemias e a determinar os próximos exames a serem realizados.
· Anemias microcíticas: São relacionadas ao comprometimento da síntese do grupo heme ou da globina por fatores referentes ao ferro: deficiência, transporte ou por utilização de ferro (anemias sideroblásticas e anemias por intoxicação por chumbo) e talassemia, as quais podem provocar hemólise. Esses pacientes podem necessitar fazer exames de depósitos de ferro;
· Anemias normocíticas: Há distribuição normal da amplitude do diâmetro dos eritrócitos (RDW) e normocromia. As causas mais comuns são a hipoproliferação por resposta inadequada à eritropoietina (EPO) e a anemia por doença crônica. Os distúrbios primários adquiridos da medula óssea também podem ser acompanhados de anemias normocíticas;
· Anemias macrocíticas: Podem ser causadas pelo comprometimento da síntese de DNA, ocasionando megaloblastose. Estão associadas às deficiências de vitamina B12 ou folato, consumo de álcool, doença hepática, síndrome mielodisplásica e hemólise.
// Hemólise excessiva (destruição de eritrócitos)
É provocada por alterações intrínsecas nos eritrócitos, como alterações na membrana plasmática e hemoglobinopatias. Existem vários fatores extrínsecos responsáveis pela hemólise, como o sistema complemento e anticorpos que reconhecem antígenos na superfície dos eritrócitos, doenças infecciosas como a malária, provocada por Plasmodium falciparum, e infecções pelo Epstein-Barr Vírus. Ainda, pacientes que apresentam esplenomegalia apresentam maior sequestro e destruição dos eritrócitos em relação àqueles que têm baço normal. Fármacos como a ribavirina e toxinas de aranhas também podem levar à hemólise, sendo esta acompanhada por aumento da produção de reticulócitos, exceto quando há depleção de ferro ou deficiência de eritropoietina.
As hemoglobinopatias são doenças decorrentes de alterações na hemoglobina e acometem cerca de 270 milhões de indivíduos no mundo todo. As hemoglobinopatias mais frequentes são a anemia falciforme e as talassemias, cujos defeitos são associados à morfologia dos eritrócitos e da hemoglobina, respectivamente. A gravidade da talassemia varia de acordo com o tipo de mutação genética, assim como o número de cópias presentes destas mutações.
O diagnóstico final da talassemia é realizado pelo estudo molecular do ácido desoxirribonucleico (DNA), com sequenciamento ou com enzimas de restrição.
Aplicação das técnicas em imunologia
As técnicas de imunologia se baseiam na detecção qualitativa e/ou quantitativa de antígenos ou anticorpos e podem ser aplicadas a diversas áreas. São simples, rápidas, e normalmente não requerem equipamentos caros.
Os ensaios podem utilizar reagentes marcados com substâncias como enzimas e fluorocromos, os quais ampliam os sinais emitidos pela interação antígeno-anticorpo de modo a conferir maior sensibilidade ao exame (VOLTARELLI & DONADDI, 2009).
Os anticorpos são proteínas secretadas por plasmócitos, que são as células efetoras da imunidade humoral, mediada pelos linfócitos B. Fazem parte, portanto, dos leucócitos. Os anticorpos interagem de forma extremamente específica com os antígenos, o que garante a especificidade das reações imunológicas. Eles são capazes de reconhecer diferenças de até três aminoácidos na estrutura antigênica. 
Embora os linfócitos B se diferenciem em plasmócitos nos órgãos linfoides, como os linfonodos, baço e tecido linfoide associado às mucosas, os anticorpos lá secretados são enviados para todos os líquidos corporais, como saliva, lágrima, líquido cefalorraquidiano, colostro, leite e soro, entre outros. Usualmente, a pesquisa de anticorpos é realizada em amostras de soro, razão pela qual o laboratório clínico de imunologia é frequentemente referido como laboratório de sorologia.
Os primeiros métodos empregados no diagnóstico laboratorial imunológico não utilizavam nenhuma molécula indicadora ou marcadora: eles identificavam o efeito visual macroscópico da reação antígeno anticorpo por meio da precipitação dos imunocomplexos ou da aglutinação de células ou partículas.
· Reações de aglutinação: a reação entre os anticorpos e os antígenos multivalentes presentes nas superfícies sólidas (látex, eritrócitos) permite que a mesma seja identificada por meio da aglutinação;
· Apresentam boa sensibilidade e podem ser analisadas visualmente, mas são sujeitas a resultados falso-positivos devido à aglutinação inespecífica;
· Hemaglutinação direta: Eritrócitos, bactérias, fungos e protozoários podem ser aglutinados quando adicionados aos anticorpos específicos. É utilizada na tipagem dos grupos sanguíneos, na reação de Paul Bunnell-Davidson (antígenos heterófilos), no teste de Widal para salmoneloses e para identificação de anticorpos na toxoplasmose e tripanossomíase;
· Teste de aglutinação do látex: Utilizado para detectar o fator reumatóide IgM dirigido contra isotipos de IgG, IgA1, IgM ou IgE adsorvido na partícula de látex;
· Teste de aglutinação de cristais de colesterol: Utilizado para diagnosticar sífilis pelo teste do VDRL (Venereal Disease Research Laboratory), o qual usa cristais de colesterol sensibilizados com lecitina e cardiolipina para pesquisar anticorpos cardiolipídicos.
 As reações de precipitação envolvem a combinação de um antígeno solúvel com um anticorpo solúvel para produzir complexos insolúveis que são visíveis macroscopicamente. São utilizadas como prova de precipitação simples para demonstrar a presença de crioglobulinas no soro de pacientes com hepatite C.
Todos os métodos imunológicos de quantificação utilizados em imunologia precisam ter um antígeno ou um anticorpo puro. Um é usado para ligar-se ao outro especificamente, a fim de realizar o diagnóstico. Contudo, por se tratar de uma reação molecular, é necessário que uma terceira molécula seja adicionada à reação, de modo a torná-la visível. Essa molécula indicadora, ou marcadora, pode ser:
· Um radioisótopo: O qual requer instrumentos para detectar e quantificar a reação antígeno-anticorpo nos testes radioimunológicos (RIA);
· Uma enzima: A qual é ligada covalentemente ao antígeno ou ao anticorpo. Após a reação imunológica, adiciona-se o substrato enzimático incolor, que é convertido a um produto colorido. A quantificação da reação é feita por análise espectrofotométrica. Vários testes se baseiam nessa metodologia e são genericamente chamados de ensaios imunoabsorventes ligado à enzima (ELISA). A técnica de ELISA mais utilizada é o ensaio sanduíche (ABBAS et al., 2015).
A ELISA é uma técnica muito sensível para quantificar a interação antígeno-anticorpo, a qual é realizada em múltiplas fases. Inicialmente, um dos reagentes é imobilizado na fase sólida, geralmente uma placa de poliestireno com 96 poços de modo a cobrir toda a superfície do poço. Depois, adiciona-se o outro reagente, o qual pode estar ligado a uma enzima e, nesse caso, é chamado de conjugado. Tanto a enzima quanto o segundo anticorpo conjugado devem manter suas atividades, a fim de que a reação possa ser detectada posteriormente.
 A reação entre o antígeno e o anticorpo é avaliada pela mudança de cor da solução após a adição do substrato, a qual é analisada pela densidade ótica em espectrofotômetro. Um dos conjugados mais utilizados é a peroxidase e seu substrato é o peróxido de hidrogênio, sendo o cromógeno a ortofenilenodiamina (OPD).
A ELISA é capaz de detectar quantidades extremamente pequenas de antígenos ou de anticorpos, podendo ter elevada precisão quando bem padronizado. Por isso, esta é uma técnica bastante adequada para realizar diagnósticos de doenças infecciosas e seleção de doadores de sangue. O fato de a ELISA permitir a detecção de antígenos nas amostras biológicas faz com que ela possa ser empregada para diagnosticar infecçõesem curso, assim como avaliar a eficácia do tratamento.
// Isolamento de antígenos
É possível, por meio das técnicas de cromatografia de imunoafinidade, isolar antígenos de diferentes soluções. Os anticorpos são ligados covalentemente a um suporte sólido insolúvel, como agarose, e dispostos em uma coluna. A mistura contendo os antígenos é passada pela coluna e o antígeno reconhecido pelo anticorpo se liga a ele. O próximo passo é a recuperação do antígeno, preso à agarose. As moléculas não ligadas são lavadas e, então, o antígeno ligado é eluído por meio de uma solução aplicada na coluna para desfazer a reação antígeno-anticorpo. Esta pode ser uma solução com pH alterado ou de alta salinidade. 
A técnica de Western Blotting permite detectar a quantidade relativa e a massa molecular de proteínas presentes em soluções contendo uma mistura ou mesmo purificadas por cromatografia, por exemplo. Essa mistura é separada por eletroforese, formando bandas de acordo com a massa molecular das proteínas, as quais são então transferidas para o papel de nitrocelulose. Essas proteínas são identificadas por meio de anticorpos específicos (ABBAS et al., 2015).
Aplicação das técnicas em urinálise
A urinálise, também chamada exame de rotina ou exame tipo I, é o terceiro tipo de procedimento analítico mais solicitado em laboratórios clínicos. Ela permite analisar as características físico-químicas e elementos figurados em amostras de urina. As tecnologias automatizadas, associadas aos recursos avançados de informática, contribuíram significativamente para a evolução das técnicas de urinálise, melhorando o desempenho diagnóstico (SBPC/ML, 2019).
 O exame tipo I auxilia a diagnosticar processos irritativos, inflamatórios, infecciosos e alguns distúrbios metabólicos, como diabetes e acidose. Também auxilia na elucidação de algumas doenças não relacionadas ao sistema urinário, como distúrbios hemolíticos e hepatites, entre outras. As três fases analisadas durante o exame tipo I são:
// Análise física: aspecto, cor e densidade da urina
Aspecto
O aspecto da urina normal é claro, transparente. Ela é determinada pelo exame visual da amostra dentro de um tubo transparente, após homogeneização. Alterações no aspecto da urina são referidas como turva/opaca e leitosa;
· Turvação: provocada por cristais amorfos, muco, lipídeos, sêmen, leucócitos, hemácias, células epiteliais, leveduras e contaminação externa com produtos como cremes vaginais. A presença de leucócitos, hemácias e bactérias podem indicar estados patológicos. As causas da turvação urinária podem ser esclarecidas por testes bioquímicos para dosagem de glicose, proteína e ureia.
Cor
A cor da urina varia do amarelo ao âmbar, de acordo com a presença do urocromo. As colorações rósea, vermelha ou castanha podem indicar presença de sangue na urina, com pigmentos de hemoglobina, mioglobina, porfirina, mas também podem ser consequência do uso de medicamentos. A ingestão de beterraba também confere cor avermelhada à urina. A cor âmbar escuro sugere presença de níveis elevados de urobilina ou bilirrubina e pode estar associada às hepatites. 
Ao agitar o tubo de urina contendo bilirrubina, ele forma espuma. Urinas de coloração esverdeada estão associadas à bilirrubina oxidada, corantes utilizados em goma de mascar e medicamentos. Já urinas azuladas podem decorrer do uso de medicamentos como vitaminas ou de alimentos corados. A coloração amarela-alaranjada da urina se apresenta, em geral, quando o paciente toma medicamentos derivados de piridina, utilizados para tratar infecções urinárias. Urinas com melanina e ácido homogentísico são pretas. Ademais, a coloração da urina é um critério para avaliar a hidratação do paciente: quanto mais clara, mais hidratado ele está.
Densidade
Em condições normais, a urina apresenta densidade entre 1015 e 1021 (próxima à densidade da água). A densidade elevada da urina indica que ela está mais concentrada e que a água está ficando retida, permitindo avaliação parcial da integridade renal. Quanto mais água, menor a densidade da urina, e mais o paciente está hidratado.
// Análise química: determinação do pH, a pesquisa de glicose, bilirrubinas e urobilinogênio, corpos cetônicos e proteínas
A análise química da urina é realizada por meio da imersão de tiras plásticas contendo diversos reagentes químicos separados em campos. Ao serem imersas durante 30 a 60 segundos na urina previamente homogeneizada, a reação entre as substâncias nela presente e os reagentes impregnados nas tiras formará faixas coloridas. A análise dos resultados é feita pela comparação a uma escala visual. A análise química pode ser automatizada e é semiquantitativa para algumas das substâncias. A análise química da urina permite avaliar alterações associadas a diversas condições patológicas.
pH: os rins são reguladores do equilíbrio ácido-básico por meio da secreção de hidrogênio e de ácidos orgânicos fracos, assim como pela reabsorção de bicarbonato do ultrafiltrado pelos túbulos contornados. Por isso, é necessário analisar o pH da urina para avaliar distúrbios eletrolíticos sistêmicos de origem metabólica ou respiratória. Também é importante o acompanhamento de alguns tratamentos.
A acidez ou alcalinidade da urina pode ser analisada pela reação da amostra em papel de tornassol ou tiras reativas, que apresentam mudança de cor: A urina de reação ácida adicionada ao papel azul o torna vermelho. Inversamente, a urina alcalina modifica a cor do papel vermelho em azul. Se a cor tanto de um como do outro papel não sofrer alteração, a reação é neutra.
Glicose: ausente na urina normal, sua presença é encontrada em pacientes diabéticos e com glicosúria renal, devendo ser quantificada por análise bioquímica.
Corpos cetônicos: encontrados na urina de pessoas após jejum prolongado e em pacientes diabéticos. 
Bilirrubina: essa substância é formada durante o metabolismo da hemoglobina e está normalmente presente na urina, sendo responsável por sua coloração amarela. O aumento da quantidade de bilirrubina está associado a hemólise ou hepatopatia. 
Urobilinogênio: formado durante o metabolismo da hemoglobina, em quantidades aumentadas pode indicar hepatopatia, distúrbios hemolíticos ou porfirinúria.
A detecção de nitrito indica infecção bacteriana, mas não está presente em todas elas. A identificação de esterase leucocitária, enzima que indica a presença de leucócitos na urina, também é sugestiva de infecção por bactérias.
Proteínas: em condições normais, os adultos excretam 100 mg/dia de proteína por via urinária e taxas de excreção aumentadas, proteinúria, podem indicar lesão renal. A prevalência de proteinúria é de aproximadamente 2% na população geral, sendo maior nos idosos e em algumas comorbidades. 
// Intensidade da proteinúria
· Proteinúria elevada: Com excreção superior a 3,5 g de proteínas em 24 horas, confere caráter espumoso à urina, o que está associado à hipoalbuminemia e edema encontrados na síndrome nefrótica. Também pode ocorrer em pacientes com lúpus eritematoso disseminado, trombose da veia renal, glomerulonefrite, nefroesclerose, amiloidose, insuficiência cardíaca congestiva ou pericardite
· Proteinúria moderada: Excreção entre 0,5 e 3,5 g de proteínas em 24 horas, sendo comum em doenças renais como glomerulonefrite crônica, nefropatia diabética, mieloma múltiplo e nefropatia tóxica, na pré-eclâmpsia. Também ocorre nas alterações inflamatórias malignas do trato urinário (degenerativas e irritativas) e cálculo urinário.
· Proteinúria mínima: Excreção menor que 0,5 g de proteínas em 24 horas, presente nos pacientes com glomerulonefrite crônica e durante convalescença de glomerulonefrite aguda e enfermidade policística renal. 
Pode ocorrer proteinúria quando o indivíduo permanece em posição ereta (proteinúria postural) com até 1,0 g de proteína em 24 horas e em estados febris, exposição ao calor ou frio intensos e após exercícios físicos.
A microalbuminúria é a condição na qual a albumina está sendo eliminada na urina, em quantidade entre 20 e 200 microgramas por minuto oude 30 a 300 mg em 24 horas. No diabetes mellitus insulina-dependente, a microalbuminúria é indicadora de doença renal inicial, refletindo a existência de lesão microvascular.
// Análise dos elementos figurados: células, cristais e cilindros
A amostra de urina é centrifugada e o sedimento analisado por microscopia óptica ou citometria de fluxo. A análise pode ser semiquantitativa ou quantitativa e permite avaliar células, entre outros elementos:
· Leucócitos: Mais de 5 leucócitos por campo microscópico, ou de 20000 e 30000/mL analisados por citometria de fluxo, em homens e mulheres, respectivamente, indica processos inflamatórios e infecciosos do sistema urinário;
· Eritrócitos: Avaliados quanto a quantidade e morfologia. Em urina hipertônica têm forma irregular, crenada, pois a água intracelular se desloca para o meio externo; em urina hipotônica são esféricos, posto que há fluxo de água de fora para dentro;
· Células epiteliais: São as células escamosas, transicionais e tubulares renais, as quais são eliminadas normalmente na urina pelo processo de descamação do trato urinário. A análise da morfologia e da quantidade elevada pode sugerir anormalidade;
· Cristais: São formados por condições associadas a pH, densidade e temperatura. Os cristais de urina ácida (uratos amorfos, ácido úrico e oxalato de cálcio) e os cristais de urina alcalina (fosfatos amorfos, fosfato triplo e carbonato de cálcio) são encontrados normalmente na urina, já os cristais de cistina, leucina, tirosina, colesterol e sulfonamidas evidenciam anormalidade;
· Cilindros: As mucoproteínas secretadas pelas células epiteliais tubulares renais, em que a mais abundante é a proteína de Tamm-Horsfall, se condensam na luz do túbulo contorcido distal e do duto coletor, formando os cilindros hialinos, granulosos e céreos, sucessivamente. Os cilindros hematínicos e os leucocitários contêm eritrócitos e/ou hemoglobina e leucócitos, sendo indicativos de hemorragia renal e infecção ou inflamação do néfron, respectivamente.A presença de cilindros epiteliais, que contêm células epiteliais, é sugestiva de lesão tubular renal. Ao se decomporem estes formam os cilindros adiposos, que contêm corpos adiposos ovais, os quais podem ser melhor evidenciados pela coloração com Sudan IV, que os cora em vermelho. A presença de cilindros largos, muito maiores do que os outros, indica prognóstico desfavorável.
Aplicação das técnicas em bioquímica
As técnicas de bioquímica são utilizadas para determinar a presença e a quantidade de substâncias orgânicas e inorgânicas no soro. Os resultados são apresentados em medidas objetivas e permitem avaliar o estado nutricional, doenças metabólicas e riscos de doenças coronarianas, entre outros. 
Entre as substâncias analisadas pelos testes bioquímicos, destacam-se:
// Avaliação laboratorial das dislipidemias e prevenção de doenças coronarianas
As dislipidemias são condições decorrentes de alterações do metabolismo dos lipídios e das lipoproteínas e podem ser investigadas por meio da avaliação do perfil lipídico dos pacientes em amostras de soro. Elas são classificadas em:
· Primarias ou genéticas: Quando ocorrem alterações ou mutações nos genes que codificam a sequência de uma apolipoproteína, de um receptor ou de uma enzima que participa no metabolismo das lipoproteínas;
· Secundarias: São desencadeadas por outras doenças como hipotireoidismo, diabetes mellitus, disfunções renais e hepáticas, pelo uso de medicamentos como diuréticos e betabloqueadores ou por estilo de vida inadequado, como abuso de álcool e sedentarismo.
As dislipidemias representam um dos vários fatores de risco para doenças coronarianas. O colesterol é responsável pela aterosclerose, que é a formação de ateromas (placas de gordura) nas artérias. Esse processo ocorre de forma natural e progressiva, iniciando-se na infância. Além do envelhecimento, alguns outros fatores aumentam o risco da doença, como hipertensão, diabetes, obesidade, tabagismo, sedentarismo e histórico familiar. A aterosclerose não é percebida clinicamente, mas quando ocorre desprendimento das placas pode levar a condições graves, como o acidente vascular encefálico. 
O monitoramento do perfil lipídico é indicado para prevenir o desenvolvimento das doenças cardiovasculares. Os resultados podem ser utilizados para motivar os pacientes à mudança no estilo de vida, com a adoção de atividades físicas e dieta para melhorar o perfil lipídico e incentivar a perda de peso. Ressalta-se que o acúmulo de gordura na região da cintura, do tipo central ou androgênico, constitui fator de risco para doença aterosclerótica.
Assim, o excesso de peso está associado a um maior risco de doença aterosclerótica, posto que pessoas obesas em geral apresentam dislipidemia, resistência à insulina e hipertensão arterial, o que caracteriza a síndrome plurimetabólica. O aumento da circunferência da cintura, independentemente do índice de massa corpórea, é um marcador de risco para alterações metabólicas.
// O colesterol
O colesterol é um esteroide produzido pelo corpo que também é obtido por meio da ingestão de alimentos. Ele faz parte da estrutura das membranas plasmáticas, participa da produção dos hormônios esteroidais e da formação de ácidos biliares necessários para a absorção de nutrientes.
Uma parte do colesterol circula no sangue na forma de lipoproteínas, as quais transportam o colesterol para ser eliminado ou mantido no corpo, a HDL e LDL, respectivamente. O exame de colesterol mede o colesterol total no sangue, e, assim:
· Lipoproteínas de baixa densidade (LDL)
São conhecidas como mau colesterol por depositarem o colesterol nos tecidos e órgãos;
· Lipoproteínas de alta densidade (HDL)
São também conhecidas como bom colesterol por transportarem o excesso de colesterol dos tecidos para ser eliminado no fígado.
// Os triglicérides
Os triglicérides são formados a partir da ingestão de alimentos, sobretudo carnes vermelhas ricas em ácidos graxos saturados e álcool. A maior parte dos triglicerídeos do corpo é encontrada no tecido adiposo, embora haja uma parte circulando pelo sangue para fornecer energia para os músculos. A dosagem de triglicérides está inclusa no perfil lipídico e é indicada para calcular o VLDL-colesterol, o risco de pancreatite, esteatose hepática e acidente vascular encefálico, monitorar eventual hipertrigliceridemia secundária ao uso de medicamentos para tratar a hipertensão e acompanhar a eficiência de tratamentos de redução dos níveis dessa gordura.
// Perfil lipídico ou lipidograma 
A avaliação do perfil lipídico inclui a análise de um grupo de exames para avaliar o risco de doença cardíaca coronariana, sendo estes bons indicadores do risco de infarto do miocárdio e de acidente vascular encefálico provocado pela obstrução dos vasos sanguíneos ou aterosclerose. O perfil lipídico inclui:
· Colesterol total;
· Colesterol HDL — com frequência chamado colesterol “bom”;
· Colesterol LDL — com frequência chamado colesterol “mau”;
· Triglicerídeos.
Pode-se, ainda, acrescentar ao pedido os exames de colesterol VLDL (lipoproteínas de muito baixa densidade) e colesterol não-HDL.
Até 2017, a coleta da amostra de sangue para avaliar o perfil lipídico era realizada em jejum. Contudo, o desenvolvimento de hipoglicemia em pacientes com diabetes mellitus por uso de insulina ou provocada pelo jejum prolongado em gestantes, crianças e idosos motivaram a flexibilização do tempo de jejum. Porém, é necessário informar no laudo as situações referentes ao jejum e atender a orientação do médico solicitante. Os valores de referência desejáveis de colesterol total (CT) e HDL-C não sofreram alterações nas amostras analisadas em indivíduos acima de 20 anos em estado pós-prandial, enquanto que os triglicérides sofreram pequena alteração (SBPC/ML, 2019).
A metodologia mais utilizada para a determinação do colesterol total, HDL e triglicérides é a enzimática colorimétrica, havendo diversos kits comerciais disponíveis e que exibem boa correlação e baixo coeficiente de variação entre si.
A avalição do LDL podeser realizada pelo método direto por meio de diversos ensaios colorimétricos disponíveis, mas que ainda apresentam grande variação de resultados, podendo chegar a 30% de diferença entre si. Isso é um fator limitante para a utilização da dosagem direta na prática clínica. Também é possível estimar a quantidade de LDL por meio da fórmula de Friedewald, que possui a limitação de subestimar elevações dos triglicerídeos, e da fórmula de Martin.
// Proteína C-reativa de alta sensibilidade (PCR-us) e doenças cardiovasculares
A inflamação do vaso sanguíneo está envolvida com o processo de formação da placa de ateroma, participando desde a formação da estria lipídica até seu eventual rompimento, o qual precede as síndromes clínicas da doença cardiovascular. A mensuração de biomarcadores inflamatórios permite acompanhar a evolução deste processo, assim como mensurar o efeito das medidas terapêuticas utilizadas.
A proteína C reativa (PCR) é uma proteína de fase aguda sintetizada pelo fígado e cuja produção aumenta rapidamente em condições inflamatórias de diferentes etiologias. Seu monitoramento para acompanhar pacientes sob risco de doenças cardiovasculares é investigado há muito tempo; contudo, o desenvolvimento de métodos de alta sensibilidade para quantifica-la contribuiu para que ela fosse o biomarcador mais extensamente estudado.
Os níveis de PCR correlacionam-se a diferentes fatores de risco cardiovasculares: Índice de Massa Corporal, tabagismo, pressão arterial sistólica, níveis de triglicérides e de colesterol total, frequência cardíaca, níveis de glicemia em jejum e histórico de doença coronária ou acidente vascular cerebral (AVC). Por outro lado, os níveis de PCR se correlacionam de forma inversa com os níveis de colesterol-HDL e pressão arterial diastólica de crianças e adultos.
A dosagem de proteína C-reativa de alta sensibilidade (PCR-us) por reação imunoquímica permite monitorar a inflamação em indivíduos sob risco de desenvolver doença cardiovascular (DCV), incluindo infarto do miocárdio. Essa proteína participa do processo de formação do ateroma, havendo um gradiente de concentração nessa região. A dosagem por imuno-histoquímica é estável e apresenta coeficientes de variação aceitáveis (< 10%). A presença de concentrações de PCR-us superiores a 2 mg/L indica a necessidade de intensificar o tratamento hipolipemiante. 
Aplicação das técnicas em microbiologia e patologia
As técnicas de microbiologia permitem realizar a identificação e isolamento do agente etiológico responsável pela doença, bem como avaliar a susceptibilidade dos microrganismos aos antimicrobianos. Elas podem ser aplicadas em diferentes tipos de amostras biológicas, tais como urina, sangue, fezes, líquidos corporais e tecidos obtidos por biópsia, mas requerem que a coleta se dê nas condições mais assépticas possíveis, a fim de evitar contaminação com microrganismos da microbiota. Também é necessário estar atento aos meios utilizados para transporte e cultivo das amostras.
As técnicas mais utilizadas em microbiologia são a bacterioscopia e a cultura, que são rápidas e permitem realizar o diagnóstico presuntivo das infecções e, dessa forma, auxiliar no tratamento. Contudo, o diagnóstico de certeza depende do isolamento e identificação do microrganismo a partir da amostra colhida no sítio de infecção (TRABULSI, 2015).
// Isolamento da bactéria a partir da amostra biológica
Para saber qual bactéria é responsável pela infecção, a amostra é inicialmente submetida à coloração de Gram, que fornece informações bioquímicas sobre a composição da parede celular da bactéria. Além disso, a análise microscópica permite reconhecer a forma da bactéria: coco, bacilo ou espirilo e o arranjo bacteriano: diplococo, estafilococo ou estreptococo, entre outros. Essa técnica é simples, permite rápido diagnóstico e auxilia na escolha do antimicrobiano a ser utilizado. Assim:
· A parede das bactérias Gram-positivas tem, além das proteínas que podem ser utilizadas para testes sorológicos, grande quantidade de peptideoglicana e ácidos tecóicos e, por isso, retêm o complexo cristal de violeta-iodo usado na coloração de Gram, mostrando-se roxas quando analisadas no microscópio. A penicilina é mais eficiente para o tratamento de infecções provocadas por bactérias Gram-positivas;
· As bactérias Gram-negativas por sua vez exibem parede celular bem mais fina e com pouco conteúdo de peptideoglicana, sendo incapazes de reter o complexo cristal de violeta-iodo durante a descoloração, voltando a ser transparentes e adquirindo a cor vermelha da fucsina utilizada no final do procedimento da coloração de Gram. Em volta da parede celular há uma membrana externa, a qual controla a entrada e saída de algumas substâncias.Nela, está disperso um importante fator de virulência das bactérias Gram-negativas: o lipopolissacarídeo (LPS), cuja parte de polissacarídeos é conhecida por antígeno O e se prolonga para fora da célula. Já a parte lipídica do LPS é a endotoxina, responsável por provocar febre, diarreia, hemólise e choque séptico. Por isso, antibióticos bactericidas são contraindicados para o tratamento de pacientes infectados por bactérias Gram-negativas, posto que a morte maciça das bactérias e liberação da endotoxina poderia provocar choque e até o óbito do paciente;
· As micobactérias (Mycobacterium tuberculosis e M. leprae, por exemplo) exibem grande conteúdo de lipídeos na parede celular e, por isso, não se coram facilmente pelo método de Gram. Para visualizá-las, é necessário utilizar a técnica de Ziehl Neelsen, que utiliza fucsina à quente e depois descoloração com ácido. As bactérias que não têm grandes quantidades de lipídeos se descoram e, posteriormente, assumem a coloração do segundo corante, o azul de metileno, ao passo que as micobactérias se mantém fúcsias. São, por isso, referidas como bacilos álcool ácido resistente (BAAR).
Na sequência, a amostra é semeada em meios de cultura líquido e sólido, o caldo e o ágar nutriente, respectivamente, os quais oferecem recursos nutritivos para o crescimento da maioria das bactérias. As bactérias fastidiosas são aquelas que precisam de meios enriquecidos com soro, sangue, vitaminas ou material de tecidos animais para que cresçam.  
O padrão de crescimento das colônias no meio sólido é utilizado para caracterizar as bactérias, e são observados cor, tamanho, borda e relevo da colônia. Associadas às informações obtidas pela coloração de Gram, essa análise auxilia a caracterizar a bactéria, mas não é suficiente para realizar a identificação da espécie. A partir das colônias obtidas em meio sólido, é possível isolar amostras para dar continuidade ao processo de caracterização da bactéria.
// Caracterização da bactéria após o isolamento
As amostras obtidas passarão por cultivos em diferentes meios de cultura e provas bioquímicas, os quais permitirão conhecer mais características do espécimen. Os meios de cultura podem ser:
· Meios de cultura seletivos: permitem o crescimento de um grupo de bactérias, mas impede o de outro. Por exemplo: a adição de determinada concentração de cristal violeta ao ágar impede o crescimento de bactérias Gram-positivas, permitindo o crescimento normal das Gram-negativas;
· Meios de cultura diferenciais: utilizados para evidenciar características das bactérias como, por exemplo, a capacidade de provocar hemólise. Nesse caso, adiciona-se sangue ao meio de cultura sólido e aparecerá um halo amarelado ao redor das colônias formadas por bactérias hemolíticas.
As bactérias que provocam doenças humanas crescem em pH entre 6,5 e 7,5 e são mesófilas, ou seja, crescem bem na temperatura do corpo, resistindo a uma variação entre 25 °C e 40 °C. Muitas bactérias se mostram sensíveis ao oxigênio e, de acordo com essa sensibilidade, são classificadas em:
· 1
Bactérias aeróbias: crescem na presença de oxigênio livre;
· 2
Bactérias anaeróbias: crescem na ausência de oxigênio livre;
· 3
Bactérias anaeróbias facultativas: crescem tanto na presença quanto na ausência de oxigênio livre;
· 4
Bactérias microaerófilas:crescem em pequenas concentrações de oxigênio livre.
// Técnicas de imunologia utilizadas em microbiologia
Atualmente, há crescente interesse nas técnicas de diagnóstico que utilizam recursos da imunologia, pois, além de serem rápidas, apresentam alta especificidade e sensibilidade. As técnicas mais frequentemente utilizadas são:
· Reação de hemaglutinação: Utiliza partículas de látex adsorvidas com anticorpos específicos para antígenos bacterianos de superfície. Tem sido utilizada para o diagnóstico de infecções provocadas por Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes e C. neoformans. Esse método é particularmente útil nos casos de meningites, em que a rapidez do diagnóstico é fundamental para o sucesso do tratamento;
· Reação de imunofluorescência: Identifica antígenos na superfície da bactéria por meio de anticorpos específicos marcados com isotiocianato de fluoresceína e que podem ser visualizados no microscópio de imunofluorescência, apresentando-se coloridos. O alto custo de manutenção do microscópio e do conjugado, além da necessidade de profissional especializado, tem provocado a substituição da reação de imunofluorescência por ELISA e hemaglutinação. Contudo, ela ainda é utilizada para o diagnóstico de sífilis primária, legionelose, tracoma, linfogranuloma venéreo, uretrites e cervicites por Chlamydia trachomatis;
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) de captura: Permite a detecção de antígenos e é empregada para diagnosticar Chlamydia trachomatis, rotavírus, citomegalovírus e Legionella pneumophila. Existem três variações do método: competitivo, direto ou indireto. 
· No método competitivo a amostra clínica na qual pretende-se investigar o antígeno é misturada com o antígeno marcado com enzima ou com iodo radioativo. Os antígenos da amostra e os marcados vão competir por uma quantidade limitada de anticorpos previamente adsorvidos à uma placa de poliestireno. Os antígenos não ligados são removidos por lavagens sucessivas. O resultado é dado pela diferença entre a leitura do controle negativo, contendo somente o antígeno marcado, e o da amostra clínica;
· No método de captura direto a amostra clínica é adicionada à uma placa de poliestireno revestida com anticorpos específicos. Após as lavagens, adiciona-se o anticorpo marcado (conjugado), geralmente com uma enzima;
· O método indireto é similar ao direto, com a diferença que utiliza-se um terceiro anticorpo anti-imunoglobulina marcado com uma enzima. Ele apresenta duas vantagens: pode-se pesquisar diferentes antígenos com um mesmo conjugado e sua maior sensibilidade, posto que amplifica o sinal. 
· Pesquisa de anticorpos específicos: Para o microrganismo em amostras do paciente como soro, saliva e líquor cefalorraquidiano: por meio de técnicas como hemaglutinação e reação de imunofluorescência, entre outras, permite rastrear a infecção e determinar se ela é aguda ou crônica
· Intradermoreação: Investiga a resposta imunológica celular específica para o microrganismo por meio da injeção intradérmica de antígenos. A formação de eritema e edema indica que os linfócitos T do paciente foram previamente expostos ao microrganismo que está sendo testado.
// Detecção de ácidos orgânicos
Alguns microrganismos produzem substâncias durante o metabolismo, sobretudo ácidos graxos específicos, as quais podem ser detectadas por cromatografia a gás e assim caracterizar a bactéria em espécies ou gêneros. Ela é utilizada para a identificação de Pseudomonas aeruginosa, M. tuberculosis, Staphylococcus sp. e Streptococcus sp., além de diversos gêneros de bactérias anaeróbias. É especialmente útil para o diagnóstico de septicemias provocadas por estafilococos e estreptococos e meningites causadas por M. tuberculosis. Entretanto, o aparelho tem alto custo (TRABULSI, 2015).
// Pesquisa de DNA 
A pesquisa de DNA é particularmente útil para o diagnóstico de microrganismos como Mycobacterium leprae e Chlamydia sp., as quais não crescem em meio de cultura. As técnicas moleculares pesquisam ácidos nucleicos por meio de hibridação com sondas genéticas e amplificação de seus fragmentos a partir de um oligonucleotídeo cuja sequência é conhecida. Essa técnica oferece diagnóstico com rapidez, precisão e segurança. 
O filtro de nitrocelulose é colocado sobre a superfície do ágar com as colônias bacterianas e então tratado para lisar as bactérias e expor o DNA desnaturado. Então, o filtro é incubado com uma solução contendo a sonda genética para o fator que se pretende pesquisar. É possível transferir diretamente o DNA ou RNA do microrganismo para a membrana de nitrocelulose a partir de gel de agarose, e então realizar a hibridação. Estas reações são chamadas de Southern blot e Northern blot, respectivamente.
A hibridação in situ apresenta-se como a mesma técnica, com a diferença que a sonda é incubada com fragmentos de tecido ou mesmo células íntegras embebidos em parafina ou formalina e fixados em lâminas de microscopia. Tem sido muito utilizada para detecção e tipagem do papilomavírus humano (HPV).
// Patologia
As amostras sólidas obtidas por biópsias devem ser fragmentadas em salina estéril e semeadas em meio de cultura, podendo oferecer resultados quantitativos: o número de colônias encontradas deve ser multiplicado pelo fator de diluição e dividido pelo número de gramas de tecido usado. O resultado final é expresso em número de unidades formadoras de colônia - UFC/grama de tecido, sendo considerados significativos quando forem superiores a 100.000 UFC/gr (BRASIL, 2013).
A análise patológica de gânglio pode revelar agentes importantes de doenças localizadas ou sistêmicas provocadas por bactérias inclusive fastidiosas, mas raramente anaeróbias, micobactérias, fungos, protozoários e vírus. Indica-se a realização de cultura para bactérias em meios ricos, fungos e micobactérias: caldo BHI com suplemento, tioglicolato com suplemento e Lowenstein Jensen, respectivamente. Parte da amostra deverá analisada por método histológico e exame microscópico pelos métodos de Gram, direto com KOH 10% e Giemsa (BRASIL, 2013).
SINTETIZANDO
As técnicas de diagnostico laboratorial são utilizadas para detectar alterações em amostras biológicas relacionadas a processos patológicos e, assim, subsidiar o diagnóstico clínico e decisões de tratamento. Elas devem obedecer a vários critérios, a fim de garantir a qualidade e segurança dos resultados.
As técnicas de hematologia permitem investigar os diferentes componentes do sangue e avaliar as inúmeras funções por ele desempenhadas: trocas gasosas, defesa e hemostasia, entre outras. O hemograma completo é o exame mais utilizado para triagem das doenças. Ele permite quantificar e analisar a morfologia dos componentes celulares do sangue e as alterações encontradas podem sugerir patologias como desnutrição, infecções, doenças inflamatórias e neoplásicas, entre outras. O mielograma é realizado quando é necessário avaliar a produção do sangue na medula óssea. 
A aplicação das técnicas de imunologia pode ser utilizada para investigar uma enorme gama de doenças e com diversas origens, além daquelas de ordem imunológica. A reação entre antígeno e anticorpos é avaliada por diversas técnicas como ELISA, reação de imunofluorescência, imuno-histoquímica, citometria de fluxo, hemaglutinação, aglutinação em látex etc. Tratam-se de técnicas de alta sensibilidade e alta especificidade, capazes de identificar as doenças infecciosas e estadiar as fases aguda e crônica das doenças. Por meio dessas técnicas, pode-se avaliar a eficácia das vacinas, que pode variar de acordo com o indivíduo, e realizar procedimentos de imunoterapia.
As técnicas de urinálise constituem os exames analíticos mais realizados nos laboratórios de análises clínicas. Tratam-se de um conjunto de procedimentos físicos, químicos e de microscopia e/ou citometria de fluxo para analisar a composição da urina. A alteração do aspecto e da cor, avaliados visualmente pela observação da amostra acondicionada em tubo transparente, já é sugestiva de processospatológicos. A investigação por métodos químicos permite detectar vários componentes que não estão presentes em urinas de pessoas sem comprometimento da saúde. Além das doenças das vias urinárias, as alterações são encontradas em doenças metabólicas, como a presença de glicose em pacientes com diabetes, por exemplo.
A aplicação das técnicas em bioquímica para avaliar o perfil de moléculas orgânicas e inorgânicas permite a quantificação das diversas substâncias presentes no soro. A quantificação de tais substâncias é utilizada na prevenção e monitoramento do tratamento de diversas doenças metabólicas e é particularmente útil na prevenção de doenças coronarianas. O acompanhamento do perfil lipídico dos pacientes é utilizado em conjunto com a proposta de mudanças no estilo de vida, como alimentação e inclusão de atividades físicas, podendo modificar o curso das doenças.
A aplicação das técnicas em microbiologia e patologia depende muito do microrganismo que se pretende identificar. O diagnóstico microbiológico convencional envolve o isolamento do microrganismo utilizando meios de cultura e sua caracterização fenotípica e bioquímica. Porém, muitas vezes estas etapas consomem um tempo não disponível para iniciar o tratamento, fazendo com que cada vez mais sejam utilizadas metodologias imunológicas e moleculares.