HIV - metodos diagnosticos e laboratoriais

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Camila Mariana Castro de Oliveira 
Medicina Nove de Julho
HIV e Metodos Laboratoriais 
➛ Retrovírus da família Lentiviridae 
➛ Genoma: ssRNA+ 
➛ Capsídeo: camada de proteção de proteínas 
(p24) que envolvem esse RNA 
 ✓ Proteínas p24: específicas do vírus HIV - 
utilizadas para diagnóstico laboratorial do 
vírus 
➛ Envelope lipídico - constituído por lipídeos e 
glicoproteinas 
 ✓ Glicoproteína Gp120 e Gp41 
➛ Presença da enzima transcriptase reversa 
junto do seu RNA - responsável por 
transcrever RNA em DNA 
 ✓ Isso faz com que na célula alvo ele se torno 
um vírus de DNA - isso faz com que seja 
possível a invasão do núcleo e a integração ao 
nosso material genético 
Ciclo do HIV: 
➛ Afinidade por células que possuem: 
 ✓ Receptores CD4 - proteínas encontradas na 
superfície de algumas células do nosso corpo 
 ✓ Co-receptores CCR5 e CCX4 
 - Linfócitos T auxiliares 
 - Macrófagos/Monócitos 
1) Vírus HIV identifica os receptores e co-
receptores expressos na membrana 
2) Utiliza a Gp120 para se ligar aos receptores 
específicos 
3) Penetra na célula alvo por fusão 
4) Inclui o capsídeo (RNA+Transcriptase 
reversa) dentro da célula 
5) O capsídeo é removido e o RNA pode sofrer 
a ação da transcriptase reversa, tornando-
se uma molécula de DNA 
6) A molécula de DNA se integra ao núcleo da 
célula alvo 
Introdução: 
Linfocitos T CD4 - liberação de 
mediadores químicos que estimulam 
todas as células a desempenharem a 
sua função 
Camila Mariana Castro de Oliveira 
Medicina Nove de Julho
Transmissão: 
➛ Fluidos corpóreos - sangue, leite materno e 
sêmen (secreções) 
➛ Vertical - parto 
Fases da Doença: 
➛ Fase aguda: 
 ✓ Assintomática 
 ✓ Subclínica - síndrome retroviral aguda 
 - Semelhante a uma síndrome gripal: febre, 
linfadenopatia, rash cutâneo, cefaleia 
➛ Fase crônica/latente: 
 ✓ Portador assintomático 
 ✓ Infecção sintomática - infecções 
oportunistas (tuberculose, toxoplasmose) 
 - Quadro de AIDS 
Teste Molecular: 
➛ Detecção de RNA HIV: 7-10 dias (PCR) 
 ✓ Encontrado na parte líquida do sangue 
(soro) logo no início da infecção 
Imunoensaios: 
➛ Teste inicial/triagem: 
 ✓ Detecção de antígeno p24: 15-17 dias 
(ELISA) 
 ✓ Detecção de anticorpos IgM: 22 dias (ELISA) 
 ✓ Detecção de anticorpos IgG: 30 dias (ELISA) 
➛ Teste confirmatório: 30 dias 
➛ Reação em cadeia da Polimerase 
➛ Avaliação do soro (parte líquida do sangue 
sem as células) 
➛ Técnica que permite a amplificação da 
quantidade de DNA específico, utilizando a 
enzima Taq DNA polimerase, dNTP, sequências 
iniciadoras específicas (primers) e variações 
de temperatura controladas 
 ✓ Taq Polimerase - enzima que garante a 
replicação e cópias de material genético 
 ✓ dNTP - nucleotídeos 
 ✓ Primers - sequência genética desenhada 
em laboratório que permitem a identificação 
do início de um gene de interesse 
Fases: 
1) Denaturação - elevação da temperatura 
(98°C) para separar a dupla fita de DNA 
2) Anelamento - do primeiro com as bases 
complementares do DNA (55°C) 
Marcadores de Infecção:
PCR - Teste Molecular:
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3) Extensão - enzima Taq polimerase 
completa as bases nitrogenadas 
complementares (70°C) 
Carga Viral: 
➛ Estima o número de cópias do genoma viral 
circulando no paciente 
 ✓ Quanto maior a carga viral, maior a chance 
do desenvolvimento de doenças oportunistas 
➛ Expresso em número de cópias do RNA de 
HIV 
➛ Há vários métodos - PCR quantitativo (qPCR) 
 ✓ Maior que 5 mil cópias: reagente positivo 
 ✓ Menor que 5 mil cópias: indeterminado 
 ✓ Menos que 50 cópias: negativo ou não 
detectável 
➛ Fase crônica da doença 
➛ Testes para detecção de antígenos ou 
anticorpos específicos - a parir de 15 a 30 dias 
 
➛ Alvo: sequência antigênica viral/bacteriana/
fúngica 
➛ Diversas aplicações: infecções, alergias, 
marcadores tumorais, doenças autoimunes, 
hormônios 
Ensaios Não Marcados: 
➛ Não possuem substâncias cromogênicas 
que permitem a formação de cor ou 
fluorescência 
➛ São testes de aglutinação - resultado 
evidenciado a partir da formação de 
aglutinados/imunocomplexos (antígeno + 
anticorpo) 
 ✓ Podem ser aglutinação direita e indireta 
Aglutinação: 
➛ Aglutinação Indireta: 
 ✓ O antígeno é absorvido a uma partícula 
que servirá de fase sólida da reação 
 ✓ Ex: látex, hemácias 
Imunoensaios - Pesquisa de Anticorpos:
IgM: formada por 5 unidades de proteínas 
em forma de Y 
 - Grande e pesada 
 - Com o tempo passa a ser substituída 
pelo IgG 
IgG: produzida durante a fase crônica da 
doença, permitindo que o antígeno fique 
em fase de latência 
 - Pequena e leve 
Uso de partículas em látex: aglutinação 
Uso de hemácias: hemaglutinação 
Camila Mariana Castro de Oliveira 
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 ✓ Diagnóstico: TTPA (partículas de gelatina), 
MHA-TP (hemácias) 
➛ Aglutinação direta: 
 ✓ O antígeno está presente naturalmente na 
partícula que está servindo de fase sólida da 
reação 
 ✓ Ex: bactérias, protozoários, hemácias 
(tipagem sanguínea) 
➛ Resultados: 
 ✓ Reagente: 
 - Quando há aglutinação, forma-se uma 
rede ou “tapete” de hemácias unidas aos 
anticorpos, a qual se espalha por toda a 
superfície do poço da placa em que foi 
realizadas a reação 
 ✓ Não reagente: 
 - Quando não há aglutinação, as hemácias 
se depositam e formam um botão compacto 
no fundo do poço da placa em que a reação 
foi realizada 
 
 ✓ Inconclusiva: 
 - Não há formação completa da 
aglutinação nem do botão, por isso observa-
se um misto dos dois, não sendo possível 
definir se a amostra é reagente outro reagente 
 - Quando isso ocorrer o teste deve ser 
repetido 
Ensaios Marcados: 
➛ Possuem substâncias cromogênicas que 
permitem a formação de cor ou fluorescência 
na presença de imunocomplexos 
 ✓ Resultado incolor: negativo - ausência de 
imunocomplexos na amostra 
 ✓ Resultado colorido: positivo - presença de 
imunocomplexos na amostra 
➛ Podem ser: 
 ✓ Radioimunoensaio 
 ✓ Imunofluorescência/Ditometria de fluxo 
 ✓ Enzimaimunoensaio (ELISA) ou 
imunoensaio colorimétrico 
ELISA ou Imunoensaio Calorimétrico: 
➛ Realizada em placas de microtitulação, que 
indica a presença ou ausência e quantifica os 
antígenos ou anticorpos na amostra 
➛ Produto final (cor): substrato incolor -> 
enzima -> produto colorido 
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➛ A atividade enzimática (cor) pode ser 
proporcional à concentração de antígeno ou 
anticorpo da amostra 
➛ Ensaio HIV 1° e 2° geração: 
 ✓ Indireto: detecta IgG 
➛ Ensaio HIV 3° geração: 
 ✓ Indireto: detecta IgM e IgG 
➛ Ensaio HIV 4° geração: 
 ✓ Indireto: detecta anticorpo do tipo IgM e 
IgG 
 ✓ Direto: detecta antígeno p24 
Western Blot: 
➛ Consiste em um ensaio imunoenzimatico 
➛ Proteínas são separadas por diferença de 
peso molecular e transferidas para 
membranas de nitrocelulose/PVDF 
➛ É a técnica empregada na confirmação de 
testes positivos pela alta especificidade 
➛ Amostra: soro do paciente para detectar 
anticorpos (IgG) 
HIV Falso-Reagente: 
Falso-positivo: 
 - Doenças autoimunes, hepatopatias, 
medicamentos, múltiplas transfusões 
recentes, vacinação recente para A-H1N1 
Falso-negativo: 
 - Uso de terapia antirretroviral, infecção 
aguda pelo HIV, realização do teste 
anteriormente a soroconversao, sistema 
imunológico comprometido
Camila Mariana Castro de Oliveira 
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➛ Positivo: pelo menos 2 bandas fortes entre 
as três bandas - p24: gp41, gp120/160 
Imunocromatografia: 
➛ Testes rápidos - resultado em 30min 
➛ Presencial 
➛ Amostra: saliva, sangue, soro/plasma 
➛ S > 99,5% e E > 99% 
➛ Janela: 1-3 meses 
➛Uso restrito: situações em que o diagnóstico 
é essencial para a conduta imediata 
➛ Regiões sem infraestrutura laboratorial ou 
de difícil acesso 
➛ O diagnóstico sorológico da infecção pelo 
HIV é realizadocom pelo menos 2 testes: 
 ✓ O primeiro para triagem com máxima 
sensibilidade - ex: ELISA de 4° geração 
 ✓ O segundo confirmatório com máxima 
especificidade - ex: western blot 
➛ Os testes confirmatório utilizam diferentes 
formatos e princípios 
➛ A combinação de 2 ou mais testes formando 
um fluxograma tem como objetivo aumentar o 
valor preditivo positivo (VPP) 
 
Diagnóstico do HIV: