AULA_10_TÉCNICAS BIO MOL

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AULA_10_TÉCNICAS BIO MOL
ACH4157 – Genética Molecular
BIOLOGIA MOLECULAR
• A partir do final dos anos 60 e começo dos anos 70, estudos na 
área de Biologia Molecular se intensificam cada vez mais, e o 
resultado disso foi o conhecimento de processos celulares 
revelando insumos e meios que proporcionaram a criação de 
metodologias e sua utilização em laboratórios de pesquisa e com o 
tempo, também utilizados como recursos tecnológicos. 
APLICAÇÕES
SÍNTESE DNA
SÍNTESE DNA
• INSUMOS PARA UMA REAÇÃO DE 
POLIMERIZAÇÃO DE DNA IN VITRO:
• DNA MOLDE
• DNA POLIMERASE
• PRIMERS (INICIADORES)
• NUCLEOTÍDEOS 
SÍNTESE DNA
• POSSIBILIDADE DE OBTER UMA SEQUÊNCIA DE DNA DE 
INTERESSE: GCTGTGATGTCGACTGTCTTTTTCCCTTCATTAGTATCGTACGTTAGTACTCGTCTCTCGAAATAGCTTTTCAGTATCCTACAGAGGT
AATCGGGGACTCTCATGACATGTAGCGCCTTGGCTATCTCTATCCAGCTTGCGCTATTAAAGGCATTTCTAACGTCTATCGTCGTTAT
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GTGTCGCACCCGTTCTGTTGATATTTTGAGGATGTCAGCTATTTCACTAACTTTAACTTTCCGATCAGCCACAACAATACGATGGATT
SÍNTESE DNA
• POSSIBILIDADE DE OBTER UMA SEQUÊNCIA DE DNA DE 
INTERESSE: GCTGTGATGTCGACTGTCTTTTTCCCTTCATTAGTATCGTACGTTAGTACTCGTCTCTCGAAATAGCTTTTCAGTATCCTACAGAGGT
AATCGGGGACTCTCATGACATGTAGCGCCTTGGCTATCTCTATCCAGCTTGCGCTATTAAAGGCATTTCTAACGTCTATCGTCGTTAT
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GTGTCGCACCCGTTCTGTTGATATTTTGAGGATGTCAGCTATTTCACTAACTTTAACTTTCCGATCAGCCACAACAATACGATGGATT
PCR
AMPLIFICAÇÃO DNA- PCR
• CICLOS SUCESSIVOS AMPLFICAM O DNA!
AMPLIFICAÇÃO DNA- PCR
• A AMPLIFICAÇÃO É EXPONENCIAL: 
AMPLIFICAÇÃO DNA- PCR
• EM CADA CICLO, TRÊ EVENTOS SUCESSIVOS SÃO NECESSÁRIOS: 
AMPLIFICAÇÃO DNA- PCR
• EM CADA CICLO, TRÊ EVENTOS SUCESSIVOS SÃO NECESSÁRIOS: 
• DESNATURAÇÃO DO DNA: ROMPER AS 
PONTES DE HIDROGÊNIO COM ALTA 
TEMPERATURA (95oC);
• ANELAMENTO: PERMITIR A INTERAÇÃO 
DOS PRIMERS COM AS REGIÕES 
COMPLEMENTARES- ABAIXANDO A 
TEMPERATURA DA REAÇÃO;
• EXTENSÃO DA CADEIA: ATUAÇÃO DA DNA 
POLIMERASE INCORPORANDO 
NUCLEOTÍDEOS A PARTIR DOS PRIMERS 
(68oC).
• PARA SER UM PROCESSO COM SIGNIFICADO, A SEQUÊNCIA DE DNA PRECISA 
SER OBTIDA EM GRANDE QUANTIDADE (NÚMERO DE MOLÉCULAS);
• ISSO É POSSÍVEL REPETINDO (AMPLIFICANDO) A SEQUÊNCIA DE DNA DESEJADA 
REITERADAS VEZES.
AMPLIFICAÇÃO DNA- PCR
RT-PCR
AMPLIFICAÇÃO DNA- PCR
AMPLIFICAÇÃO DNA- PCR
• DNA POLIMERASE DA Thermus aquaticus
SÍNTESE DNA
• POSSIBILIDADE DE CONHECER A SEQUÊNCIA DE UMA 
MOLÉCULA DE DNA GCTGTGATGTCGACTGTCTTTTTCCCTTCATTAGTATCGTACGTTAGTACTCGT
CTCTCGAAATAGCTTTTCAGTATCCTACAGAGGTAATCGGGGACTCTCATGACA
TGTAGCGCCTTGGCTATCTCTATCCAGCTTGCGCTATTAAAGGCATTTCTAACG
TCTATCGTCGTTATAGCACAGAAGCGGTTACCCCGTATTTTTTGCTTCCGCGCC
TTGTCGGTGGTCTCTATGACTTTTTTAATGGCCTCAATCGCCGATCTCCCTTTT
CGAAATCCGAATTGTTCGTTCGACAGTCCGTGCTCGCCCTCCGTGTGTTTTCTT
AGTCTATTCAGGATCGCGGTTTCCAGCATTTTTCCCAACCCATCCAACAAGCAT
ATAGGTCTATATGATGATGGCTTGTCTGGCGGTTTCCCTGGTTTTGGTATTAAG
ACCAACTTCTGTTTCTTCCATATTTGAGGAAAATATCCGTCGTCGAGGCACTTC
TGCATTGTCAATCTGAGCATGTTAGGCTTTGCGCATGCTGCTGTCTTCAGAGCT
ATATTGGGGATTCCATCTGGTCCTGGCGCTTTGTTATTTTTTGGCTTTTGTGCA
GCCATCTGGATCTCTTCTACAGTGATCGACCGTTCAAGTCTGACCTCTCTATTC
TAACATTCTCGTTTCTGGCCCTTTGCATCCTCCTTCTTGTCTTAAAACAAATTG
TTCGCAGAAGTCTTATTTCGTCGTTCCACCAAAATGCCGGTTTTCGCCCATTCC
TCGGTTCCATCCTACTTGGCATCGCCGCGTCACATGCATTCACCATTTCTTTCG
TCAATTCTTCTGCAGATTTCTCTTCGTGATCGTCTTTTGATTGGAGATATTCCT
TAAAAACTTCTTGATCGAAATTTCCGGTTCTCCATCTTCGCTCTCTTCTATGAG
TCATTTGTCTTGTTGCCTCTGTACACTTTTTCACGGTGTATCTCAATGCCTGGT
GATCGCTGTGTGTGTAACTTTCGTCGACTCTCCAGTTCAGACTTGGAACTAGTA
CTGGACTGCAGAATGTCACGTCAATAATCGACTCTCGCCCATTCTTGCGGAATG
TAGTTGCATTTCCCACGTTTGCCAGAACCAAATTTAATCTAGCTAGCGCTTCTT
GCAGACTGAAGCCTCTATCATTTGTGAATCTACTACCCCACTCAACTGCCCATG
CGTTAAAATCACCTCCAATATGAACTGGGTTGAGTCCCGTCAGTTCTCCTGTGA
GTAAATCTAACATTCGTTCAAACTGCAGAATCGTCCATCTTGGTGGTGCATAGC
AGCTGGCAATATACTACATGGGGTGAAAAG
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SEQUENCIAMENTO DE NUCLEOTÍDEOS
• INCORPORAÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS TERMINADORES DA 
POLIMERIZAÇÃO (DIDEOXINUCLEOTÍDEOS)
SEQUENCIAMENTO DE NUCLEOTÍDEOS
• INCORPORAÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS TERMINADORES DA 
POLIMERIZAÇÃO (DIDEOXINUCLEOTÍDEOS)
SEQUENCIAMENTO DE NUCLEOTÍDEOS
• 4 REAÇÕES DIFERENTES APLICADAS EM UM GEL PARA 
SEPARAÇÃO DOS FRAGMENTOS
SEQUENCIAMENTO DE NUCLEOTÍDEOS
• UTILIZAÇÃO DE FLUORÓFOROS
SEQUENCIAMENTO DE NUCLEOTÍDEOS
• GELEM CAPILAR
Bacteriófagos são vírus especializados em 
infectar bactérias.
Introduzem seu DNA na bactéria que passa a 
controlar a maquinaria da célula.
Com isso a bactéria replica o DNA do vírus e 
sintetiza proteínas para os componentes do 
capsídeo viral.
Os vírus são montados e liberados com o 
rompimento da célula. 
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Um mecanismo de defesa das bactérias para se 
precaverem da infecção é a utilização de 
enzimas de restrição que quebram o DNA viral 
As bactérias modificam sítios reconhecidos 
pela enzima de restrição presente no seu 
próprio DNA e dessa forma se protegem da 
clivagem
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
• As enzimas de restrição reconhecem e cortam sequências 
específicas de DNA.
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
• Cada bactéria com sua enzima de restrição reconhecendo 
diferentes sequências de DNA.
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
• Utilização das enzimas de restrição: cortar pedaços de DNA diferentes 
para poder juntá-los.
DNA RECOMBINANTE
DNAs DE ESPÉCIES DIFERENTES PODEM SER COMBINADOS 
Após o pareamento de bases complementares e a formação de pontes de hidrogênio, as 
cadeias são ligadas de forma covalente pela atuação da DNA ligase. 
PLASMÍDEO
São moléculas de DNA encontradas nas bactérias além do DNA cromossômico.
São pequenas moléculas circulares encontradas em dezenas de unidades e capazes de se 
replicar de forma independente do cromossomo.
Os plasmídeos carregam consigo alguns genes, dentre eles, genes que conferem resistência 
aos antibióticos.
Acredita-se que os plasmídeos confiram vantagem adaptativa num ambiente competitivo
PLASMÍDEO
As bactérias podem adquirir plasmídeos 
diretamente do meio, processo denominado 
transformação. 
Essa é uma forma de transmissão horizontal.
Os plasmídeos então, passam a ser 
transmitidos para células filhas com a divisão 
celular. 
PLASMÍDEO
Enzimas de restrição possibilitam obter fragmentos de DNA de interesse e ligá-los em 
plasmídeos. 
Os fragmentos de interesse são denominados inserto e o plasmídeo de vetor (carregador).
DNA RECOMBINANTE
Em laboratório, células sofrem tratamentos que as deixam mais competentes para a 
transformação (facilitando esse processo).
CLONAGEM
CLONAGEM
O vetor carregando o inserto pode usado para transformar 
bactérias competentes.
Bactérias portando plasmídeo (que foram transformadas) podem ser selecionadas 
favoravelmente em relação as bactérias não transformadas.
clone
CLONAGEM
Clones são crescidos em meio líquido com antibiótico;
Bactérias proliferam com plasmídeos;
Bactérias são lisadas e DNA plasmidial é purificado dos demais componentes celulares. 
clone
CLONAGEM
A clonagem pode ser checada utilizando enzimas de restrição no DNA plasmidial. 
CLONAGEM
	Número do slide 1
	BIOLOGIA MOLECULAR
	Número do slide 3
	SÍNTESE DNA
	SÍNTESE DNA
	SÍNTESE DNA
	Número do slide 7
	Número do slide 8
	Número do slide 9
	Número do slide 10
	Número do slide 11
	Número do slide 12
	RT-PCR
	Número do slide 14
	Número do slide 15
	SÍNTESE DNA
	SEQUENCIAMENTO DE NUCLEOTÍDEOS
	SEQUENCIAMENTO DE NUCLEOTÍDEOS
	SEQUENCIAMENTO DE NUCLEOTÍDEOS
	SEQUENCIAMENTO DE NUCLEOTÍDEOS
	SEQUENCIAMENTO DE NUCLEOTÍDEOS
	Número do slide 22
	Número do slide 23
	ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
	ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
	ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
	Número do slide 27
	Número do slide 28
	Número do slide 29
	Número do slide 30
	Número do slide 31
	Número do slide 32
	Número do slide 33
	Número do slide 34
	Número do slide 35
	Número do slide 36