Gabarito cinética enzimática

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Gabarito	
	
1) A	cinética	de	uma	enzima	foi	medida	em	função	da	concentração	de	substrato	na	presença	e	
ausência	de	2	mM	do	inibidor	“I”.	
[S] µM Velocidade (µmol/min) 
 Sem inibidor Com inibidor 
3 10.4 4.1 
5 14.5 6.4 
10 22.5 11.3 
30 33.8 22.6 
90 40.5 33.8 
	
a) Quais	são	os	valores	de	Vmax	e	KM	na	ausência	e	presença	de	inibidor?	Quais	as	equações	
de	reta?	
A	primeira	coisa	a	fazer	é	converter	os	dados	em	M	e	mol/s	e	calcular	os	valores	recíprocos.	
	 Sem	Inibidor	 Com	inibidor	
1/[S]	M-1	 1/v	(s/mol)	 1/v	(s/mol)	
333333.333333333	 5769230.76923077	 14634146.3414634	
200000.000000000	 4137931.03448276	 9375000.00000000	
100000.000000000	 2666666.66666667	 5309734.51327434	
33333.3333333333	 1775147.92899408	 2654867.25663717	
11111.1111111111	 1481481.48148148	 1775147.92899408	
	
I. 𝑦 = 13. 𝑥 + 1,3. 10! (Equação sem inibidor)			
II. 𝑦 = 40. 𝑥 + 1,3. 10! (Equação com inibidor)			
Uma	vez	que	ambas	as	equações	de	reta	possuem	o	mesmo	coeficiente	linear,	a	Vmax	será	igual	para	
ambas:	 𝑉!"# = 𝑉!"# !"# !"!#!$%& = 11,3×10! = 7,69. 10!! 𝑚𝑜𝑙. 𝑠!! = 46,2 µ𝑚𝑜𝑙.𝑚𝑖𝑛!!	
Como	já	fora	visto	anteriormente,	podemos	calcular	Km	a	partir	do	coeficiente	angular	de	cada	
equação	de	reta:	𝐾! !"# !"!#!$%& = 131,3×10! = 𝟏𝟎.𝟏𝟎!𝟔 𝑴 = 𝟏𝟎𝝁𝑴 (𝒄𝒉𝒂𝒎𝒂𝒅𝒐 𝑲𝒎 𝒂𝒑𝒂𝒓𝒆𝒏𝒕𝒆)	
	𝐾! !"# !"!#!$%& = 401,3×10! = 𝟑𝟎.𝟎𝟖×𝟏𝟎!𝟔 𝑴 = 𝟑𝟎.𝟖 𝝁𝑴 	
	
	
b)	Qual	é	o	tipo	de	inibição?	
	 𝐶𝑜𝑚𝑝𝑒𝑡𝑖𝑡𝑖𝑣𝑎, 𝑝𝑜𝑖𝑠 𝑉!"# 𝑛ã𝑜 𝑠𝑒 𝑎𝑙𝑡𝑒𝑟𝑎	e		𝐾! !"# !"!#!$%& > 𝐾! !"# !"!#!$%&.		
	
c) Qual	é	a	constante	de	afinidade	do	inibidor?	
	 2	
	𝐾! !"!#$%&$ = 𝐾! 1 + [𝐼]𝐾! 	
	𝐾! = 𝐾![𝐼]𝐾! !"!#$%&$ − 𝐾! = 10 𝜇𝑀. 2𝑚𝑀30,7 𝜇𝑀 − 10 𝜇𝑀 ≅ 𝟏𝒎𝑴 	
	
d) Se	[S]=10uM	e	[I]=2mM	qual	é	a	fração	de	moléculas	de	enzima	ligadas	ao	substrato,	e	
ao	inibidor?	
	
	 A	fração	de	moléculas	ligadas	ao	substrato	é	dada	por:	𝑓!" = 𝑣𝑉!"# = [𝑆]𝑆 + 𝐾!	
	 Enquanto	que	fEI,	a	fração	de	moléculas	ligadas	ao	inibidor,	poderia	ser	calculada	por:	𝑓!" 𝑠𝑒𝑚 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖𝑑𝑜𝑟 − 𝑓!" 𝑐𝑜𝑚 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖𝑑𝑜𝑟 = 10𝜇𝑀10𝜇𝑀 + 10𝜇𝑀 − 10𝜇𝑀10𝜇𝑀 + 30.76𝜇𝑀 = 0.5 − 0.26= 0.24	
	
e) Se	 [S]=30	 µM,	 qual	 fração	 de	 moléculas	 de	 enzima	 estariam	 ligadas	 ao	 substrato	 na	
presença	e	na	ausência	de	2	mM	de	inibidor?	
	 𝑓!"! = 𝑆𝑆 + 𝐾!!" = 3030 + 30.8 = 0.49	
	 𝑓!" = [𝑆]𝑆 + 𝐾! = 3030 + 10 = 0.75	
	O	aumento	da	concentração	de	substrato	de	10	para	30	mM	 levou	a	um	aumento	de	
duas	 vezes	 da	 fração	 de	moléculas	 de	 enzima	 ligadas	 ao	 substrato	 de	 0.26	 para	 0.49,	
dessa	forma	a	velocidade	da	reação	aumentou	da	mesma	ordem:	
	 𝑣!! !!"!" = 𝑉!"#[𝑆]𝐾!!" + [𝑆] = 0.77𝜇𝑚𝑜𝑙𝑠!!×10𝜇𝑀30.8𝜇𝑀 + 10𝜇𝑀 = 0.19𝜇𝑚𝑜𝑙𝑠!!	
	 𝑣!! !!"!" = 𝑉!"# 𝑆𝐾!!" + 𝑆 = 0.77𝜇𝑚𝑜𝑙𝑠!!×30𝜇𝑀30.8𝜇𝑀 + 30𝜇𝑀 = 0.38𝜇𝑚𝑜𝑙𝑠!!	
	
2)	A	cinética	de	uma	enzima	foi	medida	na	presença	de	um	inibidor.	A	concentração	do	inibidor	é	
100	µM	e	os	dados	cinéticos	são	mostrados	abaixo:	
	 Velocidade	(µmol/min)	
[S]	µM	 Sem	inibidor	 Com	inibidor	
3	 10.4	 2.1	
5	 14.5	 2.9	
10	 22.5	 4.5	
	 3	
30	 33.8	 6.8	
90	 40.5	 8.1	
	
a)	Quais	 são	os	valores	de	KM	e	Vmax	na	presença	do	 inibidor?	Compare	com	os	valores	obtidos	no	
exercício	anterior	
	
Para	obter	os	valores	de	KM	e	Vmax	devemos	converter	os	dados	da	tabela	acima	para	mol/segundo,	
fazer	o	gráfico	de	Linewaver-Burk	(duplo-recíproco)	e	uma	regressão	linear	para	obter	os	coeficientes	
de	reta.	A	figura	abaixo	mostras	um	gráfico	de	velocidade	de	reação	em	função	da	concentração	de	
substrato	(esquerda)	na	ausência	(azul)	e	na	presença	do	inibidor	(vermelho),	e	o	gráfico	de	duplo-
recíproco	correspondente	à	direita.	
	 	
	
As	equações	de	reta	ajustadas	para	os	dados	obtidos	na	ausência	e	presença	do	inibidor	são:	
	𝑦 = 13𝑥 + 1.3×10!	(ausência	do	inibidor).		
Os	valores	de	KM	e	Vmax	na	ausência	do	inibidor	são	dados	por:	𝑉!"# = 11.3×10! = 0.77𝜇𝑚𝑜𝑙𝑠!!	𝐾! = 131.3×10! = 10𝜇𝑀	𝑦 = 67𝑥 + 6.8×10!	(presença	do	inibidor).		
Os	valores	de	KM	e	Vmax	na	presença	do	inibidor	são	dados	por:	𝑉!"# = 16.8×10! = 0.15𝜇𝑚𝑜𝑙𝑠!!	𝐾! = 676.8×10! = 10𝜇𝑀	
Claramente,	ao	contrário	do	exercício	anterior	este	 inibidor	não	alterou	o	KM,	apenas	a	velocidade	
máxima.	
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
x 10−5
0
1
2
3
4
5
6
7
x 10−7
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
x 105
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
x 107
	 4	
b)	Qual	é	o	tipo	de	inibição?	
Observa-se	que	na	adição	do	inibidor	diminuiu	a	Vmax	em	aproximadamente	cinco	vezes,	de	0.77	para	
0.15	 µmols-1,	 	 enquanto	 que	 o	 KM	 manteve-se	 igual.	 Trata-se,	 portanto,	 de	 um	 inibidor	 não-
competitivo.		
c)	Qual	é	a	constante	de	dissociação	do	inibidor?	
A	constante	de	dissociação	pode	ser	obtida	através	da	Vmax	aparente:	𝑉!"#!" = 𝑉!"#1 + [𝐼]𝐾! ⟹ 𝐾! = 𝑉!"#
!" 𝐼𝑉!"# − 𝑉!"#!" = 0.15𝜇𝑚𝑜𝑙𝑠!!×100𝜇𝑀0.77 − 0.15 𝜇𝑚𝑜𝑙𝑠!! = 24.2𝜇𝑀	
d)	Se	 [S]	=	30	µM,	qual	 fração	das	moléculas	de	enzima	estarão	em	complexo	com	o	 substrato	na	
presença	e	ausência	de	100	µM	deste	inibidor?	
Assim	como	no	exercício	anterior,	a	fração	de	moléculas	de	enzima	em	complexo	com	o	substrato	na	
preseça	do	inibidor	é	dada	por:	
𝑓!"! = 𝑣𝑉!"# = 𝑉!"#!"𝑉!"#!" [𝑆]𝐾! + [𝑆] = 3030 + 10 = 0.75	
Enquanto	que	na	ausência	do	inibidor	podemos	fazer:	𝑓!" = 𝑣𝑉!"# = [𝑆]𝑆 + 𝐾! = 3030 + 10 = 0.75	
Observa-se,	portanto,	que	a	adição	de	100	µM	do	inibidor	não	competitivo	não	alterou	a	fração	de	
moléculas	 em	 complexo	 com	 o	 substrato.	 O	 inibidor	 não-competitivo	 não	 altera	 a	 fração	 de	
moléculas	 de	 enzima	 em	 complexo	 com	 o	 substrato	 mas	 altera	 o	 número	 total	 de	 moléculas	 de	
enzima	disponíveis	para	interagir	com	o	substrato.	
	
3. A	enzima	urease	aumenta	a	velocidade	da	hidrólise	da	uréia	em	pH	8,0	e	20º	C	por	um	fator	de	1014.	
Uma	dada	quantidade	de	urease	pode	hidrolisar	completamente	uma	certa	quantidade	de	uréia	em	
5	minutos	a	20º	C	e	pH	8,0.		
a) Quanto	tempo	(em	anos)	levaria	para	que	essa	mesma	quantidade	de	uréia	fosse	hidrolisada	sob	
as	mesmas	condições	na	ausência	da	urease?	
Se	a	enzima	aumenta	a	velocidade	da	reação	de	hidrólise	da	uréia	em	um	fator	de	1014,	o	tempo	
para	 que	 a	 reação	 se	 complete	 também	 é	 acelerado	 nesta	 mesma	 ordem	 de	 grandeza.	 Se	 a	
reação	não	for	catalisada	pela	enzima	(ausência	da	enzima),	o	tempo	necessário	para	a	reação	se	
completar	será	1014	vezes	maior,	logo	a	resposta	seria	t	=	5	min	x	1014	=	9,5	x	108	anos	
	
b) Dois	 tipos	 de	 urease	 (A	 e	 B)	 foram	 isoladas	 de	 2	 espécies	 de	 	 animais	 diferentes.	 As	 enzimas	
possuem	a	mesma	Vmáx,	mas	diferentes	valores	de	Km.	A	enzima	A	tem	Km=2	µM	e	a	enzima	B	
tem	 Km=0,5	 µM.	 Qual	 destas	 enzimas	 possui	 maior	 afinidade	 pelo	 substrato?	 	 Calcule	 a	 Vmax	
utilizando	a	Equação	de	Michelis-Menten.	
A	enzima	B,	devido	ao	seu	menor	valor	de	Km,	para	se	cacular	Vmax	basta	montar	a	equação	de	
MM	para	cada	enzima	e	iguala-las.		
	
	 5	
c) Para	as	duas	ureases	(A	e	B)	foram	realizadas	experimentos	cinéticos	e		o	gráfico	resultante	está	
mostrado	abaixo.	Aponte	qual	é	a	curva	que	corresponde	a	Urease	A	e	qual	corresponde	à	B,	e	
demonstre	como	você	chegou	a	esta	conclusão.