Projeto de Pesquisa João Simão 24032023

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PROJETO DE PESQUISA
1 - IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
TÍTULO DO PROJETO: Impacto do Hiperandrogenismo Gestacional no Sistema Urogenital de Ratos
Wistar Durante o Processo de Envelhecimento
GRANDE ÁREA DE CONHECIMENTO: (Ciências da Saúde
ÁREA DE CONHECIMENTO: Fisioterapia
SUB ÁREA: Morfologia e Histologia
INSTITUIÇÃO: Universidade Federal do Pará (UFPA)
CENTRO / DEPARTAMENTO: Instituto de Ciências da Saúde (ICS)
UNIDADE EXECUTORA: Unidade de Pesquisa Clínica e Experimental do Sistema Urogenital
ENDEREÇO: R. Augusto Corrêa, 01 - Guamá, Belém - PA, 66075-110
MUNICÍPIO
Belém
CEP
66.075-110
U.F.
PA
TEL/FAX
+5591 3201 8892
E-MAIL
jsmeloneto@ufpa.br
DEPARTAMENTO: Instituto de Ciências da Saúde (ICS)
COORDENADOR DO PROJETO: João Simão de Melo Neto
OUTRAS INSTITUIÇÕES PARTICIPANTES
Faculdade de Medicina Ceres (FACERES)
2 – EQUIPE DO PROJETO
Matrícula Nome completo Tipo* Titulação
máxima Unidade/Departamento Função no
projeto**
Carga horária
no projeto
2390797 João Simão de Melo Neto PE DR FFTO CD c
* TA: Técnico Administrativo ** CD: Coordenador
PV: Professor Visitante CL: Colaborador
PE: Professor Permanente (lotado no centro em que pertence o projeto) CS: Consultor
PP: Professor Participante (lotado em outro centro)
PPE: Professor Participante Externo
TE: Técnico Administrativo Externo
PB: Professor Bolsista de Agência de Fomento (CAPES, CNPQ, DAAD, etc.…)
PROJETO DE PESQUISA
3 – RESUMO
O quadro de hiperandrogenismo ou excesso de hormônios andrógenos, de origem ovariana ou
suprarrenal, configura-se como uma endocrinopatia frequente em mulheres em idade reprodutiva. A
testosterona é a principal substância envolta neste processo e diante do parâmetro do hiperandrogenismo
afeta a geração neonatal no que diz respeito ao desenvolvimento do sistema reprodutivo e urinário com
repercussões diretas na vida adulta. O presente trabalho tem como objetivo verificar os efeitos do
hiperandrogenismo gestacional induzido em ratas sobre o sistema urinário e genital da prole masculina
durante o processo de envelhecimento. Os animais do projeto serão os que nasceram nas ninhadas do projeto,
os quais as mães de indução à Síndrome dos Ovários Policísticos. Desse modo, serão utilizados somente a
prole masculina, a qual irá ser distribuída em 4 grupos (5/grupo): hiperandrogenizados intrauterinamente com
153 dias, não hiperandrogenizados intrauterinamente com 153 dias, não hiperandrogenizados
intrauterinamente com 313 dias e hiperandrogenizados intrauterinamente com 313 dias. Os ratos serão
obtidos a partir de mães tratadas com 5 mg de testosterona (s.c.) no 20° de prenhez, segundo modelo
experimental estabelecido para indução da doença. Os animais serão avaliados de acordo com o ciclo
correspondente ao adulto (313 dias) e jovem humanos (153 dias), sendo sacrificados para coleta dos órgãos
genitais (testículos, epidídimo e próstata) e urinários (rins, ureteres, bexiga e uretra), bem como
direcionamento para processamento histofisiológico.
4 – INTRODUÇÃO
Os androgênios são classificados como hormônios sexuais e se configuram como produtos da cascata
esteroidegênica. Tal classe de substâncias é representada principalmente pela testosterona, sendo sintetizada
nas mulheres, principalmente nos ovários e glândulas adrenais (YE et al., 2021). Em mulheres
normoandrogênicas, os hormônios androgênicos séricos possuem níveis de concentração em
dihidrotestosterona (DHT), testosterona, androstenediona, dehidroepiandrosterona (DHEA) e sulfato de
desidroepiandrosterona (DHEA-S) (BIENENFELD et al., 2019).
Os andrógenos são sintetizados a partir do estímulo do hormônio liberador de gonadotrofina – GnRH
(gonadotropin releasing hormone) através de um ciclo de feedback positivo no eixo hipotalâmico, o qual
contribui para a liberação de hormônio luteinizante – LH (luteinizing hormone) e hormônio folículo
estimulante – FSH (follicle stimulating hormone), desenvolvendo a anovulação e potencializando a indução
de andrógenos (HOLESH; BASS; LORD, 2022). Além disso, esse ciclo tem impacto direto no ovário, pois
dificulta o crescimento folicular e impede a seleção de um único folículo para a fecundação (HAMMES;
LEVIN, 2019), direcionando uma via que promove a infertilidade feminina.
Nesse sentido, o quadro de hiperandrogenismo ou excesso de hormônios andrógenos, de origem
ovariana ou suprarrenal, configura-se como uma endocrinopatia frequente em mulheres em idade
reprodutiva. A apresentação clínica dessa condição envolve hirsutismo, alopecia androgênica, indução de
obesidade, pilosidade, acnes e virilização, podendo se manifestar ao longo do ciclo de vida das mulheres em
momentos distintos, com tipos de diagnósticos classificados em: gestacional, pré-puberal, na idade fértil e
após a menopausa (ESCOBAR-MORREALE et al., 2012; MAKRANTONAKI; ZOUBOULIS, 2020).
Este estudo trará a perspectiva diante do âmbito gestacional, o qual, em sua etiologia, tem o
hiperandrogenismo definido de acordo com a presença de luteoma, cisto de teca-luteína, iatrogenia,
deficiência placentária de aromatase ou tumores produtores de andrógenos (de origem ovariana ou adrenal)
(ESCOBAR-MORREALE, 2018). O diagnóstico de hiperandrogenismo nessa fase pode gerar estímulos
prejudiciais, os quais têm propriedade de conferir alterações morfofuncionais permanentes nas mães. Este
fenômeno é denominado como programação fetal, que pode ser exemplificado por distúrbios endócrinos que
perpassam às barreiras biológicas, inclusive a placentária e, com isso, podem ser determinantes na saúde de
sua prole durante a vida adulta (KANEKO et al., 2022; VAISERMAN; LUSHCHAK, 2021).
5 – JUSTIFICATIVA
A testosterona é um dos principais hormônios andrógenos que afeta a geração neonatal no que diz
respeito ao desenvolvimento do sistema reprodutivo com repercussões diretas na vida adulta (LIZNEVA et
al., 2016). No entanto, até o presente momento, não há informações detalhadas sobre os efeitos diretos e
indiretos do hiperandrogenismo na formação histofisiológica do sistema urinário e genital da prole masculina
de mães com essa condição.
Em consonância, no que confere ao parâmetro gestacional sem alterações adversas, a formação da
prole masculina quanto à fisiologia e anatomia dos órgãos genitais externos está diretamente relacionada à
presença da testosterona. Nesse contexto, a diferenciação do epidídimo, ductos deferentes, ejaculatório e
vesículas seminais é influenciada pela presença ou ausência do hormônio antimulleriano (AMH) e
androgênios (testosterona) (LIBRETTI; AEDDULA, 2021). De outro modo, a administração de testosterona
intrauterina induz a hipertrofia celular, demonstrando influência sobre a diminuição no peso dos rins em
camundongos machos, bem como apresentação de efeitos deletérios sobre eles (BAIREY MERZ et al.,
2019).
Diante do exposto, é de suma relevância evidenciar os efeitos do hiperandrogenismo gestacional na
repercussão histomorfológica nos órgãos reprodutores (gônadas masculinas, epidídimo, ductos, glândulas
acessórias e escroto) e excretores (rins, ureteres, bexiga e uretra) da prole masculina no que diz respeito ao
sistema urogenital.
6 – OBJETIVO
O objetivo deste estudo é verificar os efeitos do hiperandrogenismo gestacional induzido em ratas
sobre o sistema urinário e genital da prole masculina durante o processo de envelhecimento.
6 – METODOLOGIA
Animais Experimentais
Os animais a serem avaliados serão obtidos do acasalamento de ratos adultos oriundos do Biotério
Central da Universidade Estadual Paulista (UNESP), campus Botucatu. No que se refere ao local
mantenedor, os animais serão alocados no Biotério e Laboratório de Pesquisa Experimental da FACERES,
conforme estruturação de ambientes padronizados com temperaturas de 22 C e ciclo controlado de
claro/escuro, recebendo dieta normoprotéica e água ad libitum.
A linhagem de ratos Wistar foi escolhida por ser indicada para pesquisa que envolva metabolismo,
farmacologias, toxicologia e oncologia, além da presença de tumores espontâneos, sendo usados em todos os
campos de pesquisasbiológicas e médicas (“Javier Gordon Ogembo Lab”, 2022).
Todo o experimento e os procedimentos cirúrgicos deste trabalho foram submetidos à aprovação da
Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da FACERES, sendo Certificado de Aprovação CEUA n°
9583110320 (APENDICE I). A pesquisa foi realizada de acordo com os princípios éticos em pesquisa animal
adotado pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL).
Verificação do início da puberdade
Um dos parâmetros do modelo é a abertura vaginal precoce em ratas androgenizadas no período
perinatal, a qual também é o parâmetro utilizado para estimar o início da puberdade (SENGUPTA, 2013). A
abertura será verificada diariamente com a inspeção visual da genitália a partir dos 30 dias de idade.
Obtenção das fêmeas com hiperandrogenismo
Ratas Wistar adultas (n = 8, idade 75-95 dias e peso corporal 170-190 g) serão colocadas para
acasalar, de forma que um casal (1 macho e 1 fêmea) será mantido em uma caixa de polipropileno (40 cm ×
34 cm × 16 cm) durante a noite. Na manhã seguinte, entre 7 e 8 horas, o macho será retirado da gaiola e a
vagina da fêmea inspecionada para a observação da presença de plugue vaginal e coleta da secreção. Esta
coleta será realizada por meio da inserção no canal vaginal de um cotonete embebido em soro fisiológico
estéril. O cotonete será girado 2 ou três vezes contra a parede vaginal e rolado em uma lâmina histológica,
coberta em seguida por soro fisiológico e lamínula para observação ao microscópio óptico. A visualização
dos espermatozoides será considerada o primeiro dia de gestação da rata.
Indução ao hiperandrogenismo gestacional
Neste estudo, para a indução ao quadro de hiperandrogenismo nas ratas fêmeas do grupo experimental
(n= 10) receberão tratamento com dose única de testosterona na vida intrauterina, por intermédio de injeção
subcutânea, diante da concentração de 5 mg dissolvidas em 500 μL de óleo de milho (veículo) no 20º dia de
prenhez segundo protocolo pré-estabelecido (TEHRANI et al., 2014). As ratas prenhes do grupo controle (n
= 10) receberão apenas 500μL do veículo. De modo a corroborar tal perspectiva quantitativa e logística, a
indução com testosterona na mesma concentração tem como desfecho a Síndrome dos Ovários Policísticos, a
qual emprega como um do seu principal sintoma a elevação expressiva do nível de androgênios
fisiologicamente (RUTH et al., 2020).
Quantitativo de animais experimentais
Para este estudo serão utilizados a prole masculina diante do quantitativo de 20 ratos Wistar
subdivididos em 4 grupos (5 animais cada), com idades equivalentes às fases de adolescência e adulta
correspondentes a faixa etária humana.
Ciclos de vida
A fase adolescência corresponde a indivíduos com idade aproximadamente entre 10 – 19 anos (1).
Adulto jovem é o ciclo de vida na idade entre 18 – 35 anos (2). Para obtenção da faixa etária, foi utilizado a
mediana de ambos os ciclos da vida. Portanto, obteve-se a mediana da idade para as fases adolescência (14,5
anos) e adultos jovens (26,5 anos) em humanos para que fizéssemos a correspondência na idade dos ratos. O
estabelecimento da idade animal em correspondência aos ciclos de vida humano foi realizado baseado em
estudos prévios (BAIREY MERZ et al., 2019; BIENENFELD et al., 2019). Os animais serão sacrificados em
dois momentos:
• Fase adolescência, com 153 dias de idade.
• Fase adulto jovem, com 313 dias de idade.
As fêmeas prenhes serão colocadas em caixas individuais e aleatoriamente divididas nos grupos
controle e tratados com testosterona (2 ratas/grupo). As fêmeas prenhes dos grupos tratados receberão uma
injeção única s.c. de 5 miligramas (mg) de testosterona dissolvida em óleo de milho (veículo) no 20º dia de
prenhez, enquanto as fêmeas dos grupos controle receberão somente o veículo. Após o parto, que ocorre no
22º dia de gestação pela manhã, as mães serão retiradas temporariamente da caixa, e após a determinação do
sexo pela distância anogenital, a ninhada contará com o número equivalente a 5 ratos machos por grupo (20
ratos no total). A mãe será devolvida em seguida para sua ninhada. A redução da ninhada é necessária para
que todos os filhotes tenham condições iguais de nutrição e desenvolvimento durante a amamentação, e os
recém-nascidos excedentes serão sacrificados por decapitação por tesoura após anestesia por inalação de
isoflurano.
Os filhotes serão mantidos com as mães até o desmame, aos 21 dias de idade, quando então serão
transferidos para gaiolas coletivas, mantidos em ambiente controlado, conforme descrito anteriormente. A
partir do desmame, o peso corporal dos animais será registrado semanalmente.
Grupos experimentais
Serão estudados os seguintes grupos experimentais:
G1: Ratos hiperandrogenizados intrauterinamente com 153 dias.
G2: Ratos não hiperandrogenizados intrauterinamente com 153 dias.
G3: Ratos não hiperandrogenizados intrauterinamente com 313 dias.
G4: Ratos hiperandrogenizados intrauterinamente com 313 dias.
Eutanásia dos animais
Para a eutanásia será administrado 100 mg do anestésico nas ratas que serão sacrificadas por overdose
de anestésico por kg de peso, seguido de colocação do animal em decúbito dorsal no campo cirúrgico, fixado
pelos membros superiores e inferiores. Após esse momento, será realizada uma incisão mediana abdominal
para identificação da cavidade.
Coleta de amostras e análise histopatológica dos órgãos
A coleta das amostras deste estudo será direcionada para a utilização dos órgãos genitais (testículos,
epidídimo e próstata) e urinária (rins, ureteres, bexiga e uretra). No que corresponde à próstata serão
avaliados os diferentes segmentos: ventral, lateral, dorsal, anterior ou glândula coaguladora.
Processamento do material coletado
Dentro deste contexto, os materiais coletados serão direcionados para fixação em paraformaldeído 4%
em tampão fosfato 0,1M (pH 7.4). Na sequência, os tecidos serão submetidos à microtomia com cortes na
espessura de 4µm, sendo confeccionadas as lâminas. O tecido foi submetido a coloração de Hematoxilina &
Eosina (H&E) para a análise morfométrica, estereológica e histopatológica. No entanto, em especial o
hemicorpo direito da próstata será direcionado para fixação em paraformaldeído e o esquerdo para
congelamento em nitrogênio líquido, seguido para manutenção em freezer -80º.
Análise Histomorfométrico
Para análise histomorfológica serão analisados 30 campos/grupo (40x) de modo randomizado,
evitando áreas com artefato de preparação, de cada região dos órgãos através do microscópio, modelo Zeiss
Primo Star acoplado a uma câmera modelo Zeiss Axiocam 105 color e utilizado o software Zeiss Zen 2.3
Lite.
Análise Estereológica
Serão obtidos 30 campos/grupo (40x) de forma randomizada, de cada estrutura, evitando áreas com
artefato de preparação. As mesmas, feitas através do microscópio modelo Zeiss Primo Star acoplado a uma
câmera modelo Zeiss Axiocam 105 color e utilizado o software Zeiss Zen 2.3 Lite. As imagens foram
estudadas usando o software ImageJ 1.47, versão windows (National Institutes of Health, USA), seguido de
análise estatística. Para a verificação estereológica, será utilizado o método descrito por Weibel; Paumgartner
(1978) com uma grade de 418 pontos de análise sobre as imagens fotografadas da coloração de H&E
(WEIBEL; PAUMGARTNER, 1978).
Análise Histopatológica
A análise histopatológica será realizada nas lâminas coradas com H&E comparando a presença de
modificações histológicas nos diferentes grupos. O tecido será analisado em objetivas de 20x e 40x. As
divergências decorrentes da comparação das lâminas, ao apresentarem aspectos de diferenciação patológica
serão planilhadas e analisadas (CREASY et al., 2012).
Análise Estatística
Os dados serão analisados usando estatística descritiva e inferencial. Os resultados descritivos serão
expressos conforme a distribuição de normalidade. Os dados paramétricos serão expressos como média ±
desvio padrão, enquanto os não-paramétricos serão descritos como mediana, mínimo, máximo e quartis (Q1,Q3). Para analisar a normalidade dos dados serão utilizados os testes Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk,
de acordo com a análise de cada quantidade amostral. Durante as comparações intergrupos serão aplicados os
testes: Análise de Variância (ANOVA) e o pós-teste de Tukey (dados paramétricos); Kruskal-Wallis e o
pós-teste de Dunn´s (dados não-paramétricos). Para presença de processos patológicos será utilizado à
análise do risco relativo com intervalo de confiança, sendo confirmada associação por meio do teste exato de
Fisher. Será considerado significativo p≤0,05. A análise estatística será realizada no software Instat (version
3.0, GraphPad, Inc., San Diego, CA, USA).
7 – METAS
Verificar se existe alterações na morfologia nos tecidos do sistema urinário e genital no processo de
envelhecimento;
Verificar a influência do hiperandrogenismo genital no sistema urinário e genital;
Verificar a histopatologia dos tecidos do sistema urinário e genital;
Analisar a estrutura dos órgãos do sistema urogenital, através da avaliação do percentual de seus
componentes teciduais.
8 – BIBLIOGRAFIA
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9 – CRONOGRAMA DE ATIVIDADES
ATIVIDADES Período: Agosto, 2022 – Julho, 2023.
AGO SET OUT NOV DEZ JAN FEV MAR ABR JUN JUL
Levantamento bibliográfico X
Acasalamentos e tratamento hormonal das fêmeas prenhes X
Estudo da puberdade X
Estudo do ciclo estral X
Tratamento com testosterona X X
Sacrifício e coleta das amostras X X
Início da micrometria, preparação de lâminas e Análise dos Resultados X X X
Envio de resultados para congresso Nacional e Internacional, escrita
dos artigos oriundos do projeto
X X
Redação do relatório final à CEUA, UFPA e
FASCERES
X
10 – ORÇAMENTO
As despesas do projeto estão apresentadas na lista abaixo, com previsão de gasto total de R$1.689,00.
Material Qtde Valor (R$) Total (R$)
Ratos para acasalamento 8 13,00 104,00
Testosterona (Androgenol100mg/10 ml) frasco 1 39,00 39,00
Inclusão em parafina, microtomia e coloração HE 20 60,00 1.200,00
Ração, pacote com 20 kg 2 120,00 240,00
Soro fisiológico estéril, frasco com 250 mL 5 4,00 20,00
Óleo de milho, frasco 500 mL 1 6,00 6,00
Seringa 1 ml com agulha 0,45 x 13 mm 100 0,80 80,00
Total R$1.689,00
11 – APENDICE I : CERTIFICADO DE APROVAÇÃO – CEUA