Aula 06 - Cromatografia (22-05-23) Slides da aula

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Departamento de Química – FFCLRP
Universidade de São Paulo
Docente responsável: 
Prof. Dr. Antônio Eduardo Miller Crotti
Aula 7
Cromatografia
Fundamentos de Química Experimental
O que é cromatografia?
Cromatografia é um método físico-químico de separação dos 
componentes de uma mistura, realizada por meio da distribuição 
desses componentes em duas fases (fase móvel e fase estacionária) 
que estão em íntimo contato.
KROMA + GRAPH
(COR) (ESCREVER)
Diferenças nas propriedades das fases móvel e estacionária possibilitam 
com que os componentes da amostra se desloquem através do material 
cromatográfico com velocidades desiguais, gerando a separação
DEFINIÇÃO
1897-1903
David 
Talbot Day
Separação 
de HC do 
petróleo
Separação de pigmentos; 
proposição do termo 
cromatografia
Mikhail Tswett
1903-1906
1930
Kuhn e Lederer
Cromatografia 
em coluna
Cromatografia em 
papel
Izmailov e Shraiber
1938
1941
Martin e Synge
Particição em 
cromatografia 
líquida; 
Princípios de 
fase gasosa
Primeira publicação 
em fase gasosa
Martin e Synge
1952
1958
Egon Stahl
Cromatografia em 
camada delgada
PRINCIPAIS FATOS HISTÓRICOS
• Cromatografia em Camada Delgada (Planar) : a fase estacionária é colocada
sobre uma placa.
• Cromatografia em Coluna : a fase estacionária é colocada em um tubo
cilíndrico.
Preparativas: 6->50 mm;
Analíticas: 2-6 mm;
Microdiâmetro: 1-2 mm;
Capilares: < 1 mm.
• Dependendo do estado físico da fase móvel pode-se ter:
Cromatografia gasosa: fase móvel é um gás inerte.
Cromatografia líquida: fase móvel é um líquido.
Cromatografia supercrítica: fase móvel é um vapor pressurizado em
temperatura e pressão acima do ponto crítico.
TIPOS DE CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA
CROMATOGRAFIA
PLANAR COLUNA
LÍQUIDA GÁS FLUÍDO 
SUPERCRÍTICO
Líquida (CP)
Sólida (CCD)
Ligada (CCD)
Ligada (CSFL)Sólido (CSS)
Líquida (CGL)
Sólida (CGS)
Ligada (CGFL) Líquida (CLL)
Sólida (CLS, CE)
Ligada (CFLF, CTI e CB)
Critérios de Avaliação
Técnica
Fase Móvel
Fase Estacionária
Tipos de Cromatografia
SIGLA NOME TIPO DE SEPARAÇÃO
CP Papel Partilha
CCD Camada Delgada Partilha
CCD-FL Camada Delgada com Fase Quimicamente Ligada Partilha e Adsorção
CGL Gás-Líquido Distribuição
CGS Gás-Sólido Adsorção
CGFL Gasosa com Fase Quimicamente Ligada Adsorção
CSS Sólida com Fase Móvel Super-crítica Adsorção
CSFL CSS com Fase Quimicamente Ligada Adsorção
CLL Líquido-Líquido Partilha
CLS Líquido-Sólido Adsorção
CE Exclusão Permeação
CLFL Líquida com Fase Quimicamente Ligada Partilha e Adsorção
CTI Troca Iônica Interações Polares
CB Bioafinidade Bioatividade
TIPOS DE CROMATOGRAFIA
TIPOS DE SEPARAÇÃO
• Os princípios físico-químico básicos de separação são:
– Adsorção: O soluto é retido pela superfície da fase estacionária
através de interações químicas ou físicas.
– Partição: O soluto se dissolve na parte líquida que envolve a
superfície do suporte sólido.
– Troca iônica: O íon da amostra se liga à carga fixa (grupo funcional)
da fase estacionária.
– Exclusão moléculas: As moléculas são separadas por tamanho,
havendo retenção das maiores.
– Bioafinidade: Ocorre uma ligação molecular específica e reversível
entre o soluto e o ligante fixado à fase estacionária.
Definição: Consiste na separação dos componentes de uma mistura por
meio da migração diferencial sobre uma camada delgada adsorvente
retido sobre uma superfície plana
Teve início em 1938, mas somente na década de 1960 começou a ser
largamente utilizada.
Vantagens:
•Fácil compreensão e execução;
•Separações rápidas;
•Fácil repetição;
•Baixo custo.
CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA
LD
. . .
FATOR DE RETARDAMENTO ou FATOR DE
RETENÇÃO – RF PARA CROMATOGRAFIA PLANAR
É definido pela razão entre as distâncias percorridas
pela substância e pela fase móvel.
RF=D/L
CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA
CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA
Cromatografia de Adsorção
Adsorvente polar (ex.: sílica ou alumina): terá afinidade por substâncias
polares.
Portanto:
•Substâncias apolares (ex.: hidrocarbonetos –possuem apenas C e H): não terão
afinidade pelo adsorvente. Nessa maneira, não serão retidas, deslocando-se
com a fase móvel.
•Substâncias polares (ex.: substâncias aromáticas –possuem oxigênio na
molécula) : serão retidas pela fase estacionária (adsorvente) polar, não se
deslocando.
CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA
1.Placas pré-fabricadas: são mais uniformes e homogêneas do que as feitas no
laboratório, melhorando a separação e tornando os valores de RF mais reprodutíveis.
2.Colocação da amostra: exatamente na linha de partida, para não ocorrem variações
nos valores de RF.
3.Seleção da fase móvel: o solvente ou mistura de solventes usados como fase móvel
devem ser escolhidos cuidadosamente, pois vai haver uma competição entre as
moléculas da fase móvel e da amostra pela superfície do adsorvente. Assim,deve-se
considerar a natureza química das substâncias a serem separadas e a polaridade da
fase móvel.
4.Dissolução das amostras: as amostras devem ser dissolvidas em solventes
bastante voláteis, que possam ser rapidamente eliminados após a aplicação, numa
concentração que varie de 0,1a1%. A aplicação pode ser feita com pipeta automática
ou tubos capilares de vidro.
PONTOS IMPORTANTES
5. Revelação: após o desenvolvimento dos cromatogramas, evapora-se o(s)
solvente(s) e as placas são reveladas, a fim de tornar visível as substâncias
incolores presentes na amostra.
Visualização pode ser feita por meio de: métodos físicos
• Luz UV –substâncias fluorescentes .
• Esse método não é destrutível.
• Métodos químicos –substâncias são borrifadas sobre as placas e depois
aquecidas a 100-120oC (ex.: vanilina-sulfúrica).
• Esse método é destrutível.
• Métodos biológicos –reações enzimáticas ou bacterianas
• Teste de substâncias antifúngicas.
7. Documentação:
• Fotografar as placas reveladas quimicamente.
• Desenhar em folha de papel de seda ou papel vegetal.
Cromatografia líquida “clássica” uma técnica de adsorção
• Iniciada nos primeiros anos do século XX
• Fase estacionária (sólida):colocada numa coluna de vidro de diâmetro
variado;
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
Reprodução do experimento de
Tswett-separação de um extrato
de folhas de espinafre por
cromatografia em coluna aberta.
• Amostra: colocada no topo da coluna;
• Fase móvel (eluente): passa através dela. Pode ser usada
para fins preparativos, dependendo do tamanho da coluna.
A resposta é NÂO.
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
Adsorventes: sílica gel, óxido de alumínio, silicato de magnésio,
carvão ativo, celulose micro cristalina.
O tamanho das partículas dos adsorventes para CC são maiores que
aquele para CCD (60-200 μm).
Eluentes: são selecionados de acordo com o seu poder de eluição.
Enchimento da coluna:
✓ Por via úmida: mistura se a fase móvel ao adsorvente até formar uma
pasta. Preenche-se a coluna com essa pasta. Coloca-se a amostra em
solução no topo da coluna (ex.:separação de flavonoide sem coluna de
PVPP; eluente=metanol).
✓ Por via seca: coloca-se o adsorvente na coluna. Coloca-se a amostra no
topo da coluna em mistura com um pouco de adsorvente. Passa-se a
fase móvel (eluente) (ex.: separação de hidrocarbonetos de ceras
epicuticulares em coluna de óxido de alumínio; eluente= hexano).
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
Compostos hidrossolúveis, ácidos orgânicos e íons metálicos
• Princípio: partição (solubilidade)
• Quantidade de amostra necessária 10-3 a 10-6 g
• Tipos: ascendente, descendente, bidimensional, circular
• F.M. - Sistema de solventes
• F.E. - Água retida na celulose (papel Whatman)
• Métodos de detecção: físico químicos
• Análise qualitativa: Rf (fator de retenção) - problema: reprodutibilidade
• Análise quantitativa: densitômetro,
extração dos solutos
CROMATOGRAFIA EM PAPEL
CROMATOGRAFIA CAMADA DELGADA
Vantagens:
•maior sensibilidade
•mais rápido
•> repetibilidade
•< difusão
•> faixa de aplicação
•reveladoresreativos
•permite aquecimento
Desvantagens:
•degradação de compostos lábeis devido á 
grande superfície de exposição
•dificuldades na quantificação
CROMATOGRAFIA PAPEL
Vantagens:
•técnica simples
•não requer
instrumentação sofisticada
•baixo custo
Desvantagens:
•uso limitado
•alargamento de banda-difusão-
•pouca alternativa de reveladores
CROMATOGRAFIA EM PAPEL vs CAMADA DELGADA
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