Introdução ao laboratório de imunologia clínica

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<p>Introdução ao laboratório de imunologia clínica</p><p>A imunologia clínica é uma área extremamente importante que emprega o conhecimento do sistema imune e dos mecanismos de resposta imunológica</p><p>para diagnosticar e compreender diversas patologias humanas.</p><p>O sistema imune, definido como o conjunto de células e moléculas responsáveis pelo desencadeamento da imunidade, é essencial para manutenção da homeostasia, uma vez que atua constantemente na tentativa de manter o organismo livre de agentes patogênicos, sejam eles de origem infecciosa ou não.</p><p>De acordo com Abbas, Lichtman e Pilai, em Imunologia celular e molecular, publicado em 2015, quando o sistema imune identifica e reconhece componentes microbianos e agentes estranhos não infecciosos, tais como células necróticas e tumorais, ocorre uma ação conjunta de células imunes e moléculas presentes no soro para elaboração de uma resposta contra as ameaças detectadas.</p><p>No contexto da imunologia clínica, diversos exames laboratoriais complementares são realizados com intuito de auxiliar no diagnóstico clínico de patologias humanas. Estes testes laboratoriais, em sua grande maioria, avaliam a presença e a interação dos antígenos com componentes celulares e moleculares do sistema imune, principalmente de anticorpos e linfócitos.</p><p>Dessa forma, a imunologia clínica tem como objetivo o estudo da resposta imunológica frente às doenças infecciosas, além do estudo da ativação anormal do sistema imune em casos de autoimunidade, reações de hipersensibilidade, imunodeficiências e crescimento anormal de células de fenótipo maligno.</p><p>Adicionalmente, a imunologia clínica visa o entendimento da modulação do sistema imune por meio de fármacos diversos, em especial os empregados para inibição da rejeição de transplantes. Por fim, ela estuda o desenvolvimento de vacinas e outros agentes imunizantes que são essenciais para a prevenção de doenças infecciosas, conforme pontuam Voltarelli e outros autores, em Imunologia clínica na prática médica, publicado em 2009.</p><p>SOROLOGIA: CONCEITOS, DEFINIÇÕES E OBTENÇÃO DA AMOSTRA DE SORO</p><p>Um dos mais importantes ramos da área é a sorologia, definida como o estudo analítico do soro sanguíneo. Na prática, um exame sorológico é aquele que visa identificar e quantificar a presença de antígenos e anticorpos no soro de um(a) paciente. Mas antes de se compreender a fundo os exames sorológicos, é preciso relembrar o que é o soro.</p><p>O sangue é um tecido conjuntivo formado por elementos celulares e plasma, que podem ser facilmente separados entre si por meio de centrifugação. Após centrifugação simples, observa-se que aproximadamente 45% do volume sanguíneo corresponde aos eritrócitos, também chamados de hemácias. Logo acima dos eritrócitos, sedimenta-se a camada leucoplaquetária, composta por leucócitos e plaquetas. Sobre o sedimento celular, é possível encontrar a fração sobrenadante, que corresponde à parte líquida do sangue, denominada plasma (Figura 1).</p><p>Conforme pontuado por Kierszenbaum, em Histologia e biologia celular: uma introdução à patologia, publicado em 2016, o plasma contém diversos elementos orgânicos e inorgânicos, tais como:</p><p>- Aminoácidos;</p><p>· Proteínas;</p><p>· Lipídios;</p><p>· Vitaminas;</p><p>· Hormônios;</p><p>· Fatores de coagulação;</p><p>· Sais minerais.</p><p>Figura 1. Sangue total e componentes do sangue após centrifugação. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 19/01/2021. (Adaptado).</p><p>Em termos práticos, o plasma corresponde in vivo à parte líquida do sangue que contém fibrinogênio e fatores de coagulação entre seus componentes. A obtenção de plasma in vitro por centrifugação requer a adição de anticoagulantes à amostra de sangue. Por outro lado, quando a amostra é coletada na ausência de anticoagulantes, os elementos celulares formam um coágulo de sangue juntamente com o fibrinogênio e os fatores de coagulação.</p><p>Sendo assim, após a centrifugação de uma amostra de sangue sem anticoagulantes, obtêm-se o soro, que nada mais é que a parte líquida do sangue sem a presença de fibrinogênio e fatores de coagulação.</p><p>Na rotina de um laboratório de análises clínicas, os principais anticoagulantes empregados para obtenção de plasma incluem ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), heparina e citrato de sódio. A escolha do tipo de anticoagulante usado depende diretamente do teste que será feito com a amostra de plasma.</p><p>Clique nas setas para saber mais</p><p>1</p><p>EDTA</p><p>O EDTA, indicado para amostras destinadas à realização do hemograma, é um quelante de cálcio que atua sequestrando os íons Ca2+ presentes no plasma, o que resulta no bloqueio da agregação plaquetária e da cascata de coagulação. Em termos comerciais, o EDTA é disponibilizado como um spray seco com aderência na parede dos tubos, que pode estar nas formas dipotássico (EDTA-K2), tripotássico (EDTA-K3) ou dissódico (EDTA-Na2), com pequenas diferenças de uso entre eles, conforme pontuam Silva e outros autores, em Hematologia laboratorial: teoria e procedimentos, publicado em 2016.</p><p>1</p><p>2</p><p>3</p><p>2</p><p>Heparina</p><p>A heparina é um mucopolissacarídeo que bloqueia a cascata de coagulação por meio da interação com a molécula de antitrombina, importante anticoagulante natural plasmático. Tal interação resulta na inibição dos fatores de coagulação Xa, IXa e trombina, o que aumenta significativamente a ação anticoagulante da antitrombina. O uso de tubos de coleta de sangue com heparina é indicado principalmente para testes de bioquímica e também para imunofenotipagem leucocitária, uma vez que tal anticoagulante preserva a viabilidade dos leucócitos por até 24 horas.</p><p>3</p><p>Citrato de sódio</p><p>O citrato de sódio, indicado como anticoagulante de escolha para testes de coagulação, atua como agente quelante de cálcio. Ao sequestrar os íons Ca2+ presentes na circulação, o citrato impede diretamente a continuidade da cascata de coagulação.</p><p>Para facilitar a rotina e reduzir o risco de erros pré-analíticos, os tubos de coleta de sangue apresentam padronização das tampas, de acordo com o tipo de aditivo presente. Dessa forma, os tubos com EDTA, heparina e citrato de sódio possuem tampas roxa, verde e azul, respectivamente. Já os tubos para obtenção de soro, que podem ser secos ou com adição de ativador de coágulo, apresentam tampa vermelha.</p><p>Há, ainda, os tubos para obtenção de soro com gel separador, que apresentam tampa amarela. Outra importante padronização durante as etapas pré-analíticas é a ordem dos tubos de coleta de sangue, que visa impedir a contaminação da amostra com aditivos, microrganismos e líquido tecidual.</p><p>De acordo com Andriolo e outros autores, em Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial para coleta de sangue venoso, publicado em 2010, a ordem atualmente aceita foi determinada pelo documento H3-A6 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e pode ser observada no Quadro 1.</p><p>Quadro 1. Padronização da ordem dos tubos de coleta de sangue.</p><p>Outro aspecto a ser considerado antes da coleta de sangue é o material do tubo, que pode ser de vidro ou de plástico. Os tubos de vidro foram considerados padrão-ouro por muitos anos nos laboratórios clínicos, entretanto, com a crescente preocupação com biossegurança, o uso de tubos de plástico tem ganhado força, uma vez que são mais resistentes, toleram maiores velocidade de centrifugação e geram menores quantidades de resíduo após incineração.</p><p>No contexto da sorologia, as opções disponíveis para coleta de sangue são tubo de vidro seco siliconado (tampa vermelha), tubo de vidro com ativador de coágulo e gel separador (tampa amarela), tubo de plástico com ativador de coágulo sem gel separador (tampa vermelha) e tubo de plástico com ativador de coágulo e gel separador (tampa amarela).</p><p>Após a coleta do sangue nos tubos específicos, é necessário aguardar um determinado período de tempo para que ocorra a coagulação e a retração do coágulo antes que seja feita a centrifugação para obtenção do soro.</p><p>Para amostras coletadas em tubos de vidro siliconado, deve-se aguardar aproximadamente 60 minutos, já para os tubos com ativador de coágulo</p><p>(com ou sem gel separador), o tempo de espera é reduzido para 30 minutos. Logo após esse período, os tubos devem ser submetidos à centrifugação entre dez a quinze minutos com rotação aproximada de 1000–3000 g (ANDRIOLO et al., 2010).</p><p>SOLUÇÕES: CONCENTRAÇÃO E DILUIÇÃO</p><p>As soluções são definidas como misturas homogêneas compostas por duas ou mais substâncias, nas quais a substância dissolvida é chamada de soluto e a substância que dissolve é chamada de solvente. De modo simplificado, a concentração de uma solução representa a quantidade de soluto presente em uma certa quantidade de solvente.</p><p>Vale salientar que existem diferentes tipos de concentração, uma vez que as unidades de medida das substâncias envolvidas na solução podem ser diferentes.</p><p>A concentração comum ou concentração em massa é aquela determinada pela relação entre a massa do soluto e o volume do solvente, que tem como unidade no Sistema Internacional (SI) gramas por litro (g/L):</p><p>A densidade, cuja unidade no SI é dada em gramas por microlitro (g/mL), é determinada pela relação entre a massa total e o volume total da solução:</p><p>Por fim, tem-se a concentração molar ou molaridade, que é determinada pela relação entre o número de mols do soluto e o volume total da solução cuja unidade no SI é dada em mol/L:</p><p>A capacidade que um soluto tem se ser diluído em determinado solvente é chamada de coeficiente de solubilidade, e, em termos gerais, uma solução concentrada é aquela cuja quantidade de soluto é maior do que a quantidade de solvente. Já uma solução diluída é aquela cuja quantidade de soluto é menor do que a quantidade de solvente.</p><p>Dessa forma, quando se quer aumentar a concentração de uma solução, deve-se aumentar o soluto ou reduzir o solvente; por outro lado, quando se quer diluir uma concentração, deve-se aumentar a quantidade de solvente.</p><p>Nesse contexto, é possível definir diluição como o procedimento de redução da concentração de uma solução por meio de adição de solvente, sem alterar a quantidade de soluto. Na prática, a diluição de uma solução costuma ser indicada pelo fator de diluição.</p><p>Por exemplo: quando se faz uma diluição de fator 10 de uma determinada solução, entende-se que a solução foi diluída 1/10 ou 1:10 (leia-se 1 para 10), ou seja, em dez partes da solução, uma parte é de soluto e nove partes são de solvente. Da mesma forma, para preparar uma diluição 1:5, utiliza-se uma parte de soluto para quatro partes de solvente, e assim por diante.</p><p>EXEMPLIFICANDO</p><p>Suponha que você tenha comprado um kit de ELISA para dosagem de prolactina. No kit, a maioria dos reagentes veio pronto para uso, entretanto, um deles veio concentrado 10x. Nesse caso, como se deve preparar 10 ml do reagente de uso? Bem, antes de usar esse reagente, você deve diluir 1:10 para que atinja a concentração desejada. Para isso, basta usar uma alíquota de 1 mL do reagente concentrado (uma parte) e diluir em 9 mL de diluente (nove partes), formando assim uma solução diluída de 10 mL (dez partes).</p><p>Um tipo de diluição muito empregada na rotina laboratorial é a chamada diluição seriada, que representa um procedimento de diluição progressiva na qual o fator de diluição é rapidamente amplificado, o que permite obter soluções com concentrações bem reduzidas de forma eficaz, além de ser extremamente útil quando o volume da solução inicial é escasso.</p><p>Nas diluições seriadas, a alíquota (amostra que será diluída) é sempre proveniente do material diluído na etapa anterior e o fator de diluição final é o produto dos fatores de diluição em cada etapa. Por exemplo, se você preparar uma diluição 1:2 (fator de diluição 2) a partir de uma solução-estoque. Para fazer uma diluição seriada, você deve diluir novamente essa solução no fator 2, obtendo uma nova solução que agora estará diluída 1:4.</p><p>Após diluir novamente essa nova solução 1:4, você terá uma solução 1:8, e assim por diante. Apesar da diluição seriada no fator 2 ser a mais comum, outros fatores podem ser empregados, conforme podemos observar na Figura 2, que demonstra uma diluição seriada de fator 10.</p><p>Observe que, para preparar a diluição A, utilizou-se 1 mL da solução estoque e 9 mL de diluente, originando uma diluição 1:10. Em seguida, 1 mL da solução A foi acrescentado em outro tubo contendo 9 mL de diluente, o que formou uma diluição B de 1:100. Essa solução B foi utilizada para preparar a solução C, com adição de 1 mL em 9 mL de diluente, dando origem à diluição de 1:1000. Por fim, 1mL da solução C foi adicionado em 9 mL de diluente, o que originou a solução D com diluição 1:10000.</p><p>Figura 2. Esquematização de diluição seriada. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 20/01/2021. (Adaptado).</p><p>VAMOS REFORÇAR O QUE APRENDEMOS ATÉ AGORA?</p><p>Se uma solução A está mais concentrada uma solução B, pode-se concluir que:</p><p>Ambas as soluções têm a mesma quantidade de soluto e o que varia é o solvente.</p><p>Em um mesmo volume, há mais soluto na solução A do que na solução B.</p><p>Se forem misturados volumes iguais de A e B, a concentração final não será alterada.</p><p>ENVIAR</p><p>TENTE NOVAMENTE</p><p>Seção 4 -</p><p>Interação antígeno-anticorpo, anticorpos monoclonais e imunização</p><p>Interação antígeno-anticorpo, anticorpos monoclonais e imunização</p><p>Seção 4 de 5</p><p>O estudo da imunologia clínica requer uma base adequada de conhecimentos sobre imunologia básica, principalmente no que se refere à interação entre antígenos e anticorpos, que é o ponto crucial para o desenvolvimento dos imunoensaios empregados na rotina de um laboratório clínico.</p><p>Nesse contexto, torna-se de importante relembrar diversos conceitos básicos de imunologia, como antígeno, epítopo, imunógeno e anticorpo, além de compreender os tipos de forças presentes na formação do complexo antígeno anticorpo, também conhecido como complexo imune ou imunocomplexo.</p><p>Adicionalmente, várias técnicas laboratoriais empregadas requerem a produção artificial de anticorpos específicos contra determinados antígenos. A produção de uma grande variedade de anticorpos monoclonais com diferentes especificidades se tornou possível por meio do desenvolvimento da tecnologia do hibridoma, em 1975, o que representou um grande avanço científico que tem sido amplamente empregado desde seu surgimento.</p><p>Por fim, outro aspecto importante no estudo da imunologia clínica é o entendimento dos diferentes tipos de imunização e agentes imunizantes. O processo de imunização, tanto ativa quanto passiva, pode ser conferido de modo não natural aos indivíduos, o que torna possível o controle de inúmeras doenças de origem infecciosa (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015; LEVINSON, 2014).</p><p>RELEMBRANDO CONCEITOS BÁSICOS EM IMUNOLOGIA</p><p>Para compreender a formação dos complexos imunes, primeiramente é necessário relembrar conceitos importantes de imunologia básica, o que facilitará o entendimento da interação antígeno-anticorpo.</p><p>Os antígenos são substâncias que apresentam capacidade de se ligar de modo específico aos anticorpos ou aos receptores dos linfócitos T, que atuam como componentes do sistema imune adaptativo.</p><p>Já os anticorpos, também chamados de imunoglobulinas (Ig), são proteínas globulínicas produzidas por plasmócitos derivados de linfócitos B capazes de se ligar especificamente aos antígenos que desencadeiam sua produção durante a resposta imune adaptativa.</p><p>As imunoglobulinas desempenham diversos papéis na imunidade adaptativa humoral, dentre as quais se destacam neutralização de microrganismos, opsonização e consequente facilitação da fagocitose de patógenos, além da ativação do sistema complemento pela via clássica.</p><p>Em termos estruturais, as moléculas de imunoglobulina são simétricas, com formato semelhante à letra Y e compostas por quatro cadeias polipeptídicas: duas cadeias leves idênticas com cerca de 25 kDa e duas cadeias pesadas também iguais entre si, com 50-70 kDa cada. Todas as cadeias da molécula do anticorpo apresentam regiões constantes, que são essenciais para as funções efetoras, e regiões variáveis, que atuam no reconhecimento específico dos epítopos.</p><p>Dessa forma, o sítio de reconhecimento dos antígenos está localizado</p><p>na justaposição das regiões variáveis das cadeias leve e pesada nas imunoglobulinas (Figura 3).</p><p>Diferenças na composição peptídica das regiões variáveis das imunoglobulinas são essenciais para determinar a especificidade do reconhecimento antigênico. Entretanto, epítopos muito semelhantes podem desencadear uma reação cruzada, na qual o sítio de reconhecimento se liga a um antígeno diferente daquele para o qual foi especificamente produzido.</p><p>Figura 3. Esquematização da estrutura básica das imunoglobulinas. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 20/01/2021. (Adaptado).</p><p>Diferenças na organização estrutural das regiões constantes das cadeias pesadas determinam a existência de cinco diferentes classes de imunoglobulinas, denominadas IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.</p><p>Clique nas setas para saber mais</p><p>1</p><p>IgA</p><p>Anticorpos da classe IgA são encontrados na forma de monômeros e dímeros no soro e na forma secretada nos fluidos corporais, como saliva, leite, lágrimas e suor. Sua função primordial é atuar na proteção de superfícies mucosas.</p><p>1</p><p>2</p><p>3</p><p>4</p><p>2</p><p>IgD e IgE</p><p>Os anticorpos da classe IgD e IgE são encontrados apenas na forma de monômeros.</p><p>Enquanto os IgDs atuam como receptores de superfície de linfócitos B, os pertencentes à classe IgE estão presentes no soro ou ligados aos mastócitos e basófilos, e atuam nas reações de hipersensibilidade de tipos I (também conhecidas como hipersensibilidade imediata ou alergia) e na defesa do organismo contra parasitas helmínticos.</p><p>1</p><p>2</p><p>3</p><p>4</p><p>3</p><p>IgG</p><p>As IgGs, classe de imunoglobulinas predominante no soro, são anticorpos monoméricos encontrados tanto na forma secretada quanto na forma de membrana. Entre as funções da IgG na imunidade humoral, incluem-se opsonização de microrganismos, ativação do sistema complemento e citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Outra característica importante da IgG é que essa classe é a única com capacidade de atravessar a barreira transplacentária.</p><p>1</p><p>2</p><p>3</p><p>4</p><p>4</p><p>IgM</p><p>Por fim, os anticorpos da classe IgM podem ser encontrados na forma de monômeros, quando atuam como receptores de linfócitos B, e na forma de pentâmeros no soro. A conformação pentamérica da IgM faz com que cada molécula desse anticorpo apresente dez sítios de reconhecimento antigênico, o que permite a aglutinação de partículas infecciosas. Além disso, a IgM é capaz de ativar o sistema complementar pela via alternativa (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015; LEVINSON, 2014).</p><p>1</p><p>2</p><p>3</p><p>4</p><p>EXPLICANDO</p><p>Os anticorpos IgG predominam no soro de recém-nascidos, uma vez que são os únicos capazes de atravessar a placenta. Como são originadas pelo sistema imune materno, atuam somente na proteção contra patógenos que a mãe já tenha encontrado durante a vida, seja de modo natural ou por meio de imunização ativa.</p><p>Diversos tipos de moléculas biológicas simples e complexas podem atuar como antígenos, tais como carboidratos, lipídios, ácidos nucleicos e proteínas. Entretanto, a região dos anticorpos responsável pelo reconhecimento antigênico é bem menor do que a grande maioria das macromoléculas e, dessa forma, apenas uma pequena porção do antígeno realmente se liga ao anticorpo.</p><p>Essa região delimitada do antígeno que se liga diretamente à molécula do anticorpo é denominada determinante antigênico ou epítopo. Quando um antígeno apresenta um único epítopo, é chamado de monovalente, já os antígenos que possuem vários epítopos idênticos são denominados multi ou polivalentes.</p><p>O termo imunógeno descreve toda e qualquer molécula que apresenta capacidade de desencadear uma resposta imunológica quando reconhecida pelo sistema imune. Embora todo imunógeno seja um antígeno, o inverso não é verdadeiro, pois alguns antígenos pequenos, chamados de haptenos, conseguem se ligar aos anticorpos, mas não são capazes de estimular a montagem de uma resposta imunológica específica.</p><p>Isso ocorre porque, apesar da possível interação com anticorpos, os haptenos não conseguem ativar linfócitos T auxiliares devido à incapacidade de se ligar às proteínas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) (ABBAS; LICHTMAN; PILAI, 2015; LEVINSON, 2014.).</p><p>TIPOS DE FORÇAS ENVOLVIDAS NA INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO</p><p>O reconhecimento do antígeno pela molécula de anticorpo ocorre na justaposição das regiões variáveis das cadeias leve e pesada e, para que isso ocorra, é necessária a formação de uma ligação covalente reversível.</p><p>A reversibilidade da interação antígeno-anticorpo está diretamente relacionada a fatores como pH extremo, concentrações elevadas de sal, presença de detergentes e competição por altas concentrações do epítopo.</p><p>A ligação covalente reversível entre antígeno e anticorpo é resultante de diversos tipos de interações, que incluem forças eletrostáticas, pontes de hidrogênio, forças de van der Waals e ligações hidrofóbicas.</p><p>Forças eletrostáticas</p><p>As forças eletrostáticas representam a interação entre duas cargas elétricas por meio de atração (quando as cargas são iguais) ou repulsão (quando as cargas são opostas).</p><p>Forças de van der Waals</p><p>Já as forças de van der Waals, por sua vez, são forças intermoleculares resultantes da união entre nuvens de cargas elétricas opostas presentes no antígeno e no anticorpo, as quais podem ser do tipos dipolo-dipolo, dipolo induzido-dipolo induzido e ligações de hidrogênio.</p><p>Pontes de hidrogênio</p><p>As ligações ou pontes de hidrogênio são forças intermoleculares permanentes, nas quais o polo positivo é sempre o hidrogênio e o polo negativo pode ser nitrogênio, oxigênio ou flúor (FORTE, 2015; ABBAS; LICHTMAN; PILAI, 2015).</p><p>Para avaliar a força da interação entre o antígeno e a molécula de anticorpo, são empregados os conceitos de afinidade, avidez e valência.</p><p>Clique nos botões para saber mais</p><p>Afinidade</p><p>–</p><p>A afinidade de um anticorpo é determinada pela força de ligação entre uma única região de reconhecimento na molécula de imunoglobulina e o epítopo do antígeno. Como antígenos polivalentes apresentam vários epítopos em sua estrutura, a força da ligação do antígeno ao anticorpo é decorrente da interação de todos esses epítopos com as regiões de reconhecimento disponíveis.</p><p>Avidez</p><p>–</p><p>Dessa forma, na presença de vários epítopos no mesmo antígeno, pode-se dizer que a avidez é a soma de todas as afinidades. Na prática, a avidez está mais diretamente relacionada à força de ligação entre antígeno e anticorpo, uma vez que moléculas de anticorpos como a IgM, que apresentam estrutura pentamérica, podem se ligar fortemente a antígenos polivalentes, pois apresentam grande quantidade de sítios de reconhecimento disponíveis, o que aumenta a avidez da interação.</p><p>Valência</p><p>–</p><p>Por fim, a valência de um anticorpo pode ser definida como o número de epítopos que ele pode reconhecer. Lembrando que anticorpos na forma de monômeros, dímeros e pentâmeros apresentam dois, quatro e dez sítios de reconhecimento, respectivamente.</p><p>ANTICORPOS MONOCLONAIS: OBTENÇÃO POR HIBRIDOMAS E APLICAÇÕES</p><p>Os anticorpos monoclonais (mAB, do inglês monoclonal antibody) são imunoglobulinas produzidas por um único clone de linfócitos B e, portanto, apresentam a mesma especificidade de reconhecimento de antígenos, uma vez que as imunoglobulinas produzidas por plasmócitos idênticos têm exatamente a mesma estrutura nas regiões variáveis das cadeias leve e pesada, que são responsáveis pelo reconhecimento dos epítopos antigênicos.</p><p>EXPLICANDO</p><p>Um clone de células é definido como o conjunto de células geneticamente idênticas derivadas de uma única célula precursora. Cada clone de linfócitos B apresenta o mesmo receptor de superfície (BCR, do inglês B cell receptor), que é um complexo formado por uma imunoglobulina (IgD ou IgM) e duas moléculas de sinalização denominadas Igα e Igβ.</p><p>As células clonais são observadas na composição das massas tumorais, uma vez que os tumores são originados a partir da expansão clonal de células inicialmente mutadas. Nesse contexto, um tipo específico de tumor maligno denominado plasmocitoma é formado pela proliferação excessiva e descontrolada de plasmócitos idênticos, todos produtores de um mesmo tipo de anticorpo.</p><p>A partir</p><p>do estudo dos plasmocitomas produtores de anticorpos monoclonais, tornou-se possível o desenvolvimento da tecnologia dos hibridomas. Isso ocorreu no ano de 1975 e foi descoberto pelos cientistas César Milstein e Georges Köhler, que publicaram suas descobertas no artigo intitulado “Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity”. Tal descoberta rendeu aos autores o Prêmio Nobel em Medicina, no ano de 1984.</p><p>A nova tecnologia descrita no artigo possibilitou uma revolução na produção de imunoglobulinas, o que permitiu o desenvolvimento de uma gama enorme de anticorpos monoclonais com especificidades distintas.</p><p>A tecnologia do hibridoma, também chamada de hibridização celular somática, é baseada na formação de uma célula híbrida que resulta da fusão de plasmócitos produtores de determinado anticorpo com células tumorais de mieloma. O uso de células tumorais juntamente com os plasmócitos confere uma elevada capacidade proliferativa ao hibridoma, o que é essencial para a obtenção de grandes quantidades de anticorpos.</p><p>A diferenciação de linfócitos B em plasmócitos produtores do tipo específico de imunoglobulina de interesse é estimulada por meio da injeção do antígeno em uma cobaia de laboratório. Após a fusão celular, a célula híbrida obtida é estimulada a proliferar, dando origem a um clone de células-filhas idênticas, todas produtoras do mesmo anticorpo monoclonal. Os hibridomas são, portanto, células híbridas com capacidade de replicação contínua e produção simultânea de imunoglobulinas específicas direcionadas contra um determinado antígeno.</p><p>Resumidamente, a produção dos hibridomas ocorre em diversas etapas sequenciais da seguinte maneira: primeiramente, é feita a administração do antígeno de interesse em camundongos, os quais se tornam imunizados e passam a produzir anticorpos específicos contra o antígeno.</p><p>Em seguida, células do baço dos camundongos imunizados contendo plasmócitos são retiradas e incubadas na presença de células de mieloma, que são negativas para expressão do gene que codifica a enzima hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (HGPRT).</p><p>A incubação das células deve ser feita na presença de polietilenoglicol (PEG) diluído em meio de cultura com dimetilsulfóxido (DMSO), para que ocorra a fusão das membranas celulares. Depois da fusão, as células são transferidas para o meio de cultura HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina), que mantém a viabilidade das células que expressam HGPRT (Figura 4).</p><p>Dessa forma, as células do mieloma que não se fundiram não sobrevivem, pois expressam a enzima. Já os linfócitos B são células sensíveis à cultura e não sobrevivem por longos períodos incubados in vitro. Sendo assim, após um período de tempo, somente as células híbridas permanecem viáveis no meio HAT.</p><p>Por fim, é feita a detecção e a quantificação das imunoglobulinas produzidas para verificar a especificidade do hibridoma produzido e, em seguida, é feita a clonagem e a preservação das células híbridas (COELHO, 2014; PRAMPERO, 2017).</p><p>Figura 4. Tecnologia dos hibridomas para produção de anticorpos monoclonais. Fonte: TORTORA; FUNKE; CASE, 2012, p. 508.</p><p>A princípio os anticorpos monoclonais disponíveis eram produzidos em laboratório, a partir de linfócitos B isolados de camundongos sensibilizados com o antígeno de interesse. Devido à origem murina dos linfócitos B que formavam o hibridoma, a administração dos anticorpos monoclonais desencadeava uma forte resposta imune direcionada contra as imunoglobulinas administradas, com produção de anticorpos anti-imunoglobulinas pelo sistema imune do paciente.</p><p>Tal resposta imune indesejada inativava a ação terapêutica dos anticorpos monoclonais, além de induzir possíveis reações adversas no organismo. Essa limitação do uso dos anticorpos monoclonais fez com que, inicialmente, eles fossem empregados apenas com finalidade de pesquisa científica e de diagnóstico laboratorial em imunoensaios diversos, o que aumentou significativamente a especificidade dos testes imunológicos.</p><p>Com o desenvolvimento da biotecnologia e da engenharia genética, a tecnologia para produção de anticorpos monoclonais foi progressivamente aprimorada, com o intuito de reduzir a imunogenicidade dos anticorpos monoclonais produzidos.</p><p>Primeiramente, foram desenvolvidos anticorpos quiméricos, nos quais a tecnologia do DNA recombinante permite a substituição de partes da estrutura das imunoglobulinas murinas por humanas, com redução significativa da imunogenicidade do anticorpo produzido, conforme pontuado por Delves e colaboradores, em Roitt, Fundamentos de imunologia, publicado em 2013.</p><p>EXPLICANDO</p><p>A tecnologia do DNA recombinante é um conjunto de procedimentos e técnicas que permite a manipulação do material genético dos organismos, com consequente alteração de determinada característica fenotípica. Em termos práticos, com essa tecnologia é possível identificar, extrair e isolar genes de interesse de uma célula doadora, que posteriormente são transferidos para outra célula que não possui tal gene em seu genoma. Dessa forma, uma molécula de DNA recombinante possui material genético de duas ou mais fontes diferentes.</p><p>Posteriormente, com o intuito de reduzir ainda mais a imunogenicidade dos anticorpos monoclonais produzidos, teve início o desenvolvimento dos chamados anticorpos humanizados. Em termos práticos, nas imunoglobulinas humanizadas os sítios de reconhecimento antigênico têm origem animal, enquanto o restante da molécula tem origem humana.</p><p>O avanço das técnicas de engenharia genética e a tecnologia do DNA recombinante possibilitaram a produção de anticorpos monoclonais totalmente humanos, sem qualquer vestígio de origem animal em sua composição (MARQUES, 2005; MURPHY, 2014).</p><p>Desde seu desenvolvimento, os anticorpos monoclonais têm sido empregados no contexto da imunologia clínica como reagentes em testes laboratoriais para imunodiagnóstico de tumores, doenças infecciosas, problemas autoimunes e imunodeficiências. Mais recentemente, o uso dos anticorpos monoclonais para imunoterapia tem ganhado destaque, especialmente no tratamento do câncer e doenças autoimunes.</p><p>Para nomear os fármacos de origem monoclonal, utiliza-se um padrão pré-estabelecido que facilita o entendimento do alvo terapêutico e da origem do anticorpo. De acordo com essa norma, o nome do fármaco é formado por quatro partes, sendo um prefixo, dois infixos e um sufixo.</p><p>Clique nos botões para saber mais</p><p>+Prefixo</p><p>–</p><p>O prefixo é dado pela sílaba inicial escolhida para nomear o medicamento.</p><p>Infixo</p><p>–</p><p>O primeiro infixo é usado para indicar o seu alvo de ação, enquanto o segundo infixo é relacionado à origem do anticorpo monoclonal. Os principais infixos utilizados estão demonstrados no Quadro 2.</p><p>Sufixo</p><p>–</p><p>O sufixo utilizado é sempre mabe, que indica que o fármaco é um anticorpo monoclonal (SANTOS et al., 2006).</p><p>Quadro 2. Infixos empregados na nomenclatura de anticorpos monoclonais.</p><p>No Brasil, de acordo com a lista de preço de medicamentos disponibilizada pela Câmara de Regulação do Mercado de Medicamentos (CMED) da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), estão atualmente disponíveis aproximadamente 60 anticorpos monoclonais com atividade terapêutica. No Quadro 3, estão alguns dos anticorpos monoclonais mais utilizados para terapêutica no país.</p><p>ASSISTA</p><p>Para saber mais sobre a produção de anticorpos monoclonais para uso em imunoterapia do Instituto Butantã, assista ao vídeo Fábrica de Anticorpos Monoclonais.</p><p>Quadro 3. Principais anticorpos monoclonais (mABs) de uso terapêutico no Brasil.</p><p>IMUNIZAÇÃO ATIVA E PASSIVA</p><p>A aquisição de proteção imunológica contra doenças infecciosas, processo denominado imunização, pode ser adquirida pelo organismo de modo ativo ou passivo.</p><p>Clique nas abas para saber mais</p><p>IMUNIZAÇÃO ATIVAIMUNIZAÇÃO PASSIVA</p><p>Na imunização ativa, o desenvolvimento da resposta imunológica ocorre após a exposição ao antígeno específico, o que confere participação ativa do sistema imune do indivíduo no processo de produção de anticorpos e células T efetoras,</p><p>com aquisição de resposta imune humoral e celular. Essa imunização geralmente é de longa duração, porém requer um período de tempo maior para sua elaboração.</p><p>O contato com o antígeno na imunização ativa pode ocorrer de forma natural, durante infecções clínicas e subclínicas, e também de modo artificial, por meio da administração de vacinas produzidas com antígenos vivos ou inativos, além de produtos microbianos como toxinas e toxoides (Figura 5).</p><p>Outro exemplo clássico de imunização passiva é o que ocorre nos recém-nascidos, que recebem anticorpos da classe IgG produzidos pelo sistema imune materno por meio da circulação transplacentária. A grande desvantagem da imunização passiva é que ocorre apenas imunidade humoral, com aquisição de proteção de curta duração.</p><p>Figura 5. Tipos de imunização da imunidade adquirida. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 21/01/2021.</p><p>O soro homólogo, produzido por organismos da mesma espécie do indivíduo que irá recebê-lo, apresenta baixo risco de desencadear reações de hipersensibilidade, porém tem risco maior de transmissão de doenças infecciosas.</p><p>Por outro lado, o soro heterólogo, produzido por espécies diferentes da espécie-alvo, não traz risco de transmissão de doenças infecciosas, mas apresenta risco elevado de desencadear reações de hipersensibilidade, com possível desencadeamento de reação anafilática grave, além de deposição de imunocomplexos (LEVINSON, 2014; ABBAS; LICHTMAN; PILAI, 2015).</p><p>VAMOS REFORÇAR O QUE APRENDEMOS ATÉ AGORA?</p><p>O tratamento de indivíduos picados por cobras geralmente é feito pela administração de soro heterólogo contendo anticorpos antiofídicos. Tal opção terapêutica representa um exemplo de imunização:</p><p>Seção 5 -</p><p>Boas práticas e controle de qualidade laboratorial</p><p>O soro homólogo, produzido por organismos da mesma espécie do indivíduo que irá recebê-lo, apresenta baixo risco de desencadear reações de hipersensibilidade, porém tem risco maior de transmissão de doenças infecciosas.</p><p>Por outro lado, o soro heterólogo, produzido por espécies diferentes da espécie-alvo, não traz risco de transmissão de doenças infecciosas, mas apresenta risco elevado de desencadear reações de hipersensibilidade, com possível desencadeamento de reação anafilática grave, além de deposição de imunocomplexos (LEVINSON, 2014; ABBAS; LICHTMAN; PILAI, 2015).</p><p>image5.png</p><p>image6.png</p><p>image7.png</p><p>image8.png</p><p>image1.png</p><p>image2.png</p><p>image3.png</p><p>image4.png</p>