Cromatografia embrapa

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Conceitos Iniciais:
Definição das Fases Estacionárias (FE) e Fases Móveis:
Fase reversa representa 90% das análises por cromatografia líquida
Fase Normal:
Fase estacionária – polar
Fase móvel – apolar
Solutos geralmente são neutros
Quanto maior a polaridade do soluto, maior é o tempo de retenção, uma vez que irá interagir melhor com a fase estacionária, ficando mais tempo retido na coluna
Mecanismo de separação – Adsorção
Fase Reversa:
Fase estacionária – apolar
Fase móvel – polar
Solutos geralmente são apolares
Quanto maior a polaridade da molécula, menor será o tempo de retenção 
Mecanismo de retenção – interações apolares
Fase estacionaria (Cromatografia gasosa) – Pode estar em coluna empacotada ou capilar
Cromatografia camada delgada é planar, onde a fase é colocada em suporte, placa de vidro ou alumínio:
 
 
 
Cromatografia em camada delgada:
 
Planar, onde FE, geralmente sílica ou alumina é aplicada em uma fina camada sobre suporte inerte como placa de vidro ou folha de alumínio
FM é liquida e sobe por capilaridade, geralmente se usa mistura de 2 a 3 solventes
Proporção do solvente da fase móvel irá definir a melhor separação cromatográfica, podemos aumentar ou diminuir a polaridade da fase móvel a fim de otimizar a separação cromatográfica
Deve-se evitar agua na mistura de solventes que serve com FM, principalmente quando se usa sílica na FE, deve-se inclusive retirar umidade dos solventes utilizados e da amostra a ser aplicada
Antes de aplicar amostra, secar placa em estufa a 105°C durante 30 a 60 minutos para retirar umidade 
SPOT – mancha onde aplica-se a amostra
Recomenda-se aplicar a amostra em vários ciclos, esperando o solvente evaporar antes de aplicar a próxima porção para manter o diâmetro da mancha o menor possível
Cuba deve estar saturada com vapores da FM para que ocorra boa migração dos componentes da mistura. Papel de filtro encostado na parede interior da cuba diminui o tempo de espera de saturação
Inserção da placa deve ser o mais rápido possível a fim de manter a atmosfera dentro da cuba. As laterais da placa não podem encostar nas paredes da cuba, cuba deve permanecer bem tampada para evitar a saída dos vapores durante a corrida
Solvente sobe por capilaridade arrastando as substancias da mistura que tem afinidade com FM
 Ao fim da corrida, marca-se o limite que o solvente atingiu na placa e espera-se o solvente evaporar
Cada substancia terá retenção característica, dependendo da mistura e da proporção dos solventes utilizados na FM
Se as duas substancias possuem mesmo Rf, trata-se da mesma substancia 
Quando Rf =1,0 = eluição completa – substancia possui muita afinidade pela FM, correndo junto com solvente
Rf= 0 substancia muita afinidade fase estacionaria e nenhuma pela FM, não elui
Rf ideal = 0,5
Cromatografia Líquida:
 
Detector (detecta, identifica e quantifica) utilizado vai depender das características da substancia em análise:
-Onde absorve energia
-Fluorescente ou não
- Presente em grande ou pqna quantidade na amostra
Bolhas são problemas frequentes, diminuindo ou aumentando pressão no sistema
Assim como detectar substancias fantasmas 
 
Neste caso é melhor por gradiente
Colunas preparativas sao utilizadas para se obter substancias puras de difícil obtenção por outros métodos
Com desenvolvimento da CL, FE evoluiu de partículas irregulares até partículas esféricas com diâmetros menores e porosas, aumentando a resolução
Utilização da pré-coluna é para não sujar o início da coluna:
Temperatura do forno geralmente 5 a 10 graus acima da ambiente, serve tb para diminuir viscosidade da FE
Como sofre com variação de temperatura e quantidade dos solventes só pode fazer analise em condições isocráticas
 
Vatnagem é que pode obter um espectro de cada pico do cromatograma, com este dado a mais pode-se confirmar identidade da substancia e grau de pureza do sinal
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