SUMARIO DE RT-PCR

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RT-PCR 
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 RT-PCR 
 
 
 
A transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR – 
reverse transcription polymerase chain reaction) é um método de biologia molecular 
utilizado desde o início da década de 1980. A partir de conhecimentos em virologia 
baseados em enzimas responsáveis pela replicação viral, os cientistas estudaram a 
atividade da enzima transcriptase reversa (RT – reverse transcriptase). 
Essa enzima consegue sintetizar uma fita da molécula de DNA, tendo como 
molde uma fita de RNA. Cabe lembrar que muitos vírus têm o genoma de RNA, como o 
HIV (vírus da imunodeficiência humana), o HCV (vírus da hepatite C), o coronavírus e o 
vírus da dengue, dentre outros (DANTAS JUNIOR, 2004). Utilizando a atividade dessa 
enzima, os vírus conseguem inserir seu material genético no DNA da célula hospedeira. 
Ou seja, para que isso ocorra, é necessária a síntese de um DNA complementar ao RNA 
viral. E é nessa etapa que a transcriptase reversa age. Sua importância é foco de 
investigações na farmacologia, visando ao desenvolvimento de drogas inibitórias da 
RT. Muitas já existem, fazendo parte, por exemplo, dos coquetéis antirretrovirais para 
tratamento da AIDS. 
Atualmente, a RT-PCR é amplamente utilizada nas ciências ômicas, ou seja, em 
uma análise global dos RNAs de uma determinada célula sob um certo estímulo. Essa 
parte da ciência é chamada de Transcriptoma, e nela se quantificam quais RNAs estão 
mais expressos e quais estão inibidos ou com quantidade diminuída. Pode-se analisar a 
expressão gênica em diferentes tecidos e entre organismos diferentes, assim como em 
ensaios com fármacos e outras terapias (NOLAN, 2006). Em um contexto mais atual de 
sua importância, pode-se dizer que, na pandemia de COVID-19, o RT-PCR em tempo 
real é um dos métodos de melhor utilização e confiabilidade para detectar o RNA viral 
no SARSCoV-2. 
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As variações da técnica de PCR incluem a RT-PCR como método valioso para 
inúmeros fins científicos. O ensaio de RT-PCR permite que toda a análise após a 
amplificação tenha como origem uma molécula de RNA. Isso se torna importante para 
a detecção de infecções virais, assim como para a identificação e quantificação de 
RNAs mensageiros de um determinado tecido, fornecendo informações valiosas a 
respeito da expressão de um determinado gene (SANTOS, 2004). 
Sua utilização é ampla para verificar a expressão gênica, uma vez que analisa 
o RNA mensageiro responsável pela síntese de proteínas. A partir de certos estímulos, 
ou mesmo de sinais internos nas células, há a síntese de RNAs celulares, em que 
aproximadamente 5% são do tipo RNA mensageiro. Outros 80% correspondem aos 
RNAs ribossomais, e 15% aos RNAs transportadores. Cabe ressaltar que ainda existem 
outros tipos de RNAs não codificantes, vários deles minúsculos e com diversas funções 
estruturais e metabólicas, como os micro-RNAs, muito estudados na oncologia. 
Como a técnica de RT-PCR visa à identificação principalmente da expressão de 
genes e RNAs virais, utiliza-se um pequeno oligonucleotídeo de fita simples (similar ao 
primer na PCR), constituído de, aproximadamente, 18 a 20 timinas. Isso se baseia no 
princípio de que os RNAs mensageiros são poliadenilados em sua parte terminal, ou 
seja, enzimas específicas adicionam cerca de 200 adeninas no final dos RNAs, 
permitindo a sinalização e estabilidade dessas moléculas. Mas também é possível 
identificar outros tipos de RNA por meio da RT-PCR. Podem-se utilizar iniciadores ou 
random primers (iniciadores aleatórios) para servirem de iniciação para a ação da RT 
para todos os tipos de RNA. Aleatoriamente, eles irão se parear com alguma sequência 
interna na fita dos RNAs, pois a diversidade é muito grande. 
Para a realização da técnica de RT-PCR, inicialmente há a necessidade de extrair 
os RNAs das células e/ou tecidos na amostra biológica. Para isso, inúmeros kits 
comerciais são constantemente desenvolvidos. Alguns são gerais, ou seja, conseguem 
extrair RNAs de diversos tipos de amostras, mas outros são muito específicos, 
conseguindo obter apenas um tipo de RNA, como os RNAs mensageiros ou micro-RNAs 
(PFALLER, 2001). Com uma boa concentração de massa e pureza dos RNAs extraídos, 
inicia-se a reação segundo a tabela a seguir. Os RNAs são muito instáveis e têm uma 
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meia-vida curta intracelularmente. Para evitar qualquer degradação, utilizam-se a 
extração e o armazenamento dos RNAs a temperaturas de –20°C a –80°C. 
 
REAGENTE VOLUME 
Oligo-dT ou random primers 
(10pmols/uL) 
1,0uL 
Transcriptase reversa – RT 
(5U/uL) 
1,0uL 
Tampão da RT 5x 4,0uL 
dNTPs (10mM) 1,0ul 
Inibidor de RNAse 0,5uL 
RNA (1ug) O volume depende da concentração do 
RNA extraído. 
Água Avolumar para chegar a 20uL finais. 
VOLUME FINAL 20uL 
Tabela 1 – Reagentes necessários para a reação de RT-PCR. 
 
Para entender a tabela e o procedimento, deve-se primeiro saber que 
praticamente todos os RNAs apresentam estruturas secundárias e terciárias. Assim 
como nas proteínas, na formação do RNA ocorrem contorções intramoleculares que 
permitem a formação de diversas estruturas terciárias espaciais, moldadas 
principalmente pelas pontes de hidrogênio entre os nucleotídeos, e com auxílio de 
íons, como, por exemplo, o Mg2+. Com isso, faz-se necessário desnaturar a fita simples 
do RNA dessas conformações. Ao aquecer os RNAs a 70°C, todos os RNAs estarão 
lineares, permitindo que os iniciadores constituídos de timinas (oligo-dT) consigam se 
anelar às caudas poli-A dos RNAs mensageiros, ou mesmo quando se utilizam os 
random primers para todos os tipos de RNA. Caso o interesse seja estudar apenas um 
gene e sua expressão, pode-se utilizar um primer específico para aquele RNA-alvo, 
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fazendo com que a RT sintetize apenas um tipo de cDNA. Esse anelamento dos 
iniciadores ocorre a aproximadamente 25°C (MITCHELL, 2003). 
Em seguida, adicionando os outros reagentes, principalmente a enzima 
transcriptase reversa (RT), ocorre a polimerização de uma nova fita de DNA 
complementar (cDNA), formando um híbrido RNA-DNA. Pode-se, também, utilizar a 
enzima RNAse-H, que degrada apenas RNA que esteja pareado com cDNA. Esse cDNA 
servirá de molde inicial para a reação de PCR subsequente. 
Assim, uma reação de PCR é realizada posteriormente à reação de síntese do 
cDNA pela RT. A PCR permite que essa sequência de cDNA seja amplificada com a 
utilização de reagentes, como a Taq DNA polimerase e seu tampão específico, assim 
como o íon magnésio, que funciona como cofator para a enzima, além de nucleotídeos 
livres na reação, que serão incorporados nas fitas a serem polimerizadas (adenina, 
timina, guanina e citosina), e iniciadores (primers) complementares à sequência no 
cDNA-alvo. Após a execução de aproximadamente 35-40 ciclos de temperaturas, o 
cDNA é amplificado bilhões de vezes. Essa ciclagem de temperatura baseia-se em: 
desnaturar o DNA a 95°C, perdendo a interação das pontes de hidrogênio; diminuir a 
temperatura para, aproximadamente, 55°C-60°C, fazendo com que os iniciadores 
complementemas sequências do DNA-alvo; e aumentar a temperatura a 72°C, para a 
ação catalítica da DNA polimerase, que incorporará os nucleotídeos livres da reação, 
formando fitas novas, complementares às fitas desnaturadas (Figura 1). Assim, em 
cada ciclo de três temperaturas, o DNA se duplica em uma progressão geométrica. Ao 
final, haverá uma quantidade suficiente para ser detectada e analisada (LORENZ, 
2012). 
 
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 Figura 1 – Reação de RT-PCR. 
 
Como toda técnica molecular é passível de erros, a RT-PCR não escapa dessa 
desvantagem. Como é um método preciso, necessita que todos os reagentes estejam em 
suas concentrações ideais e que a qualidade do RNA extraído esteja dentro do aceitável para 
não interferir na reação; além disso, é importante que as temperaturas estejam de acordo 
com a especificidade da ação catalítica das enzimas. 
Resumindo, a RT-PCR é uma reação de PCR realizada a partir de uma molécula de 
RNA utilizando duas reações subsequentes, respectivamente, por meio da ação enzimática 
da transcriptase reversa (RT-PCR propriamente dita) e da Taq DNA polimerase (reação PCR 
tradicional). 
A abrangência da RT-PCR no diagnóstico clínico e nas pesquisas básicas evoluiu 
significativamente, fazendo com que seja cada vez mais utilizada como ferramenta específica 
e método considerado ouro para confiabilidade de resultados, como, por exemplo, na 
identificação do RNA do SARSCoV-2 na pandemia de COVID-19. 
 
Prime
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
 
 
DANTAS JUNIOR, J. V.; KIMURA, L. M. S.; FERREIRA, M. S. R.; FIALHO, A. M.; ALMEIDA, 
M. M. S.; GRÉGIO, C. R. V.; ROMIJN, P. C.; LEITE, J. P. G. Reverse transcription-
polymerase chain reaction assay for rabies virus detection. Arquivo Brasileiro de 
Medicina Veterinária e Zootecnia, 56(3), 398-400, 2004. 
 
LORENZ, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and 
optimization strategies. Journal of Visualized Experiments: JoVE, (63), e3998, 2012. 
 
MITCHELL, J. RT-PCR protocols. Methods in molecular biology, v. 193: O’Connell J., ed. 
Humana Press. ISBN 0 89603 875 0. Journal of Clinical Pathology, v. 56, 5:400, 2003. 
 
NOLAN, T.; HANDS, R.; BUSTIN, S. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat 
Protoc 1, 1559-1582, 2006. Disponível em: https://doi.org/10.1038/nprot.2006.236. 
Acesso em: 16 fev. 2021. 
 
PFALLER, M. A. Molecular approaches to diagnosing and managing infectious diseases. 
Practicality and costs. Emerging Infectious Diseases, 7:312-318, 2001. 
 
SANTOS, C. F. et al. Transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase: princípios e 
aplicações em odontologia. J. Appl. Oral Sci. [on-line], v. 12, n. 1, p. 1-11. ISSN 1678-
7765, 2004. 
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https://doi.org/10.1038/nprot.2006.236,