Apresentacao sobre HPV de Bases para Diagnóstico Molecular pdf

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H U M A N P A P I L L O M A V I R U S
Ana Karoline Utzig, Carolina Schmokel
Bases para diagnostico molecular 
O papilomavírus humano (HPV) é o principal
agente causador do câncer do colo do útero (CCU),
encontrado em 99,7% dos casos.
Entre os homens é como um vetor silencioso, apenas
1% deles apresenta algum sinal ou sintoma clínico.
É importante saber o tipo de HPV que o paciente está
infectado para prevenir o desenvolvimento do câncer
e sua transmissão.
INTRODUÇÃO
Ana Karoline
No Brasil, o câncer do colo do útero é o terceiro tipo
de câncer mais incidente entre mulheres. (INCA, 2022).
EPIDEMIOLOGIA
Ana Karoline
Estima-se que haja entre 9 e 10 milhões de
pessoas infectadas pelo HPV no Brasil e que
surjam 700 mil novos casos de infecção por ano.
Estudos indicam que cerca de 80% da
população sexualmente ativa deve ser
infectada pelo vírus em algum momento de
sua vida.
Classificação e características:
 Família: Papillomaviridae
 Gêneros: 5 gêneros principais (alfa, beta, gamma, mu e nu).
Morfologia:
Genoma: DNA de fita dupla, circular, com cerca de 8.000 pb
Proteinas: duas proteínas estruturais: L1 (estabilidade) e L2
(transporte do genoma viral)
Envelope: ausente
Replicação: núcleo
PAPILOMAVÍRUS
HUMANO (HPV) D
N
A
 C
IRC
U
LA
R
N
Ã
O
 E
N
VE
LO
PA
D
O
DNA DE DUPLA FITA
CAPSÍDEO ICOSAÉDRICO
Microscopia electrónica 
do vírus do papiloma humano
Ana Karoline
BAIXO RISCO
HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81
e 89
PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV)
Lesões de baixo grau e verrugas genitais Lesões de alto grau Carcinoma invasivo
40 infectam a região anogenital
ALTO RISCO
HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,
58, 59, 68, 73 e 82
> de 200 tipos de HPV
Ana Karoline
E6 E7 pRbp53
MECANISMO DE AÇÃO
A amplificação do genoma do HPV ocorre nas camadas diferenciadas do epitélio, induz a síntese de DNA
em células comprometidas em diferenciação celular.
O HPV 16 e 18 são de alto risco porque produzem as oncoproteínas E6 e E7, que desativam os
mecanismos naturais de supressão tumoral das células humanas, promovendo o desenvolvimento de
câncer. Essa característica os diferencia de tipos de baixo risco, como o HPV 6 e 11, que não possuem
essa capacidade de integração genômica e oncogenicidade significativa.
Defesa do hospedeiro
Ana Karoline
Degradação de pRB libera o fator de transcrição E2F
p53 é essencial para o reparo do DNA e a indução de apoptose , sua ausência permite
a sobrevivência de células com danos no DNA.
mRNA mRNA
Defesa do hospedeiro
Degrada Inativa
mecanismos naturais de supressão tumoral das células humanas
ProteinaProteina
REGIÕES DO GENOMA DO HPV
LCR : “central de controle”. Ajuda a regular como e quando o manual
do vírus será lido.
E6 e E7 : “genes perigosos”. Eles desligam os sistemas de defesa da
célula e ajudam o vírus a crescer, podendo levar ao câncer. Inativam
(p53 e pRb)
E1 e E2 : “ajudantes do vírus”. Eles ajudam a copiar o material genético
do HPV (replicação).
E4 e E5: E4 auxilia na montagem do vírus, enquanto E5 estimula o
crescimento celular, ajudando o vírus a se espalhar.
L1 e L2 : São as “cascas protetoras”. Eles formam a estrutura externa
do vírus, como se fosse sua armadura.
Carol
CICLO DO HPV
Cérvix normal: Células organizadas e saudáveis.
Lesão intraepitelial escamosa (LES):
Baixo grau (Grau 1): Infecção inicial com o DNA viral
fora do genoma hospedeiro (episomal).
Alto grau (Graus 2 e 3): O DNA viral integra-se ao
genoma do hospedeiro, com superexpressão das
proteínas E6 e E7, causando proliferação celular
anormal.
 Câncer invasivo: Alterações invadem tecidos
adjacentes.
Carol
PREVENÇÃO 
IPreservativo (Reduz entre 70 e 80% das transmissões do
HPV)
Vacina:
 Quadrivalente (6, 11, 16 e 18) -
 Nonavalente (Gardasil)
 Bivalente (16,18) - Cervarix
 2017: inclusos meninas de 14 e meninos de 11-14
anos.
Pacientes imunossuprimidos 
 
Tem partículas VLPS - feitas a partir da proteína L1
estrutural
A Colposcopia e a citologia oncótica cérvico/vaginal
(Papanicolau) são complementares.
Carol
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
(PAPANICOLAU)
É realizado a raspagem da junção escamo-colunar (JEC), 
Com esse material um esfregaço em lâmina, a qual é
corada 
Analisada no microscópio 
Verificando há possível vacuolização de células epiteliais
(coilocitose). 
Identificação precoce de anomalias celulares relacionadas a
câncer e a infecções, reduzindo a mortalidade das pacientes.
Carol
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
(PAPANICOLAU)
Reduz até 70% a incidência de câncer de colo do útero.
Limitações:
Taxas de falso-negativos: amostra inadequada
Mas não detecta o vírus em si, somente as lesões
dele decorrentes. 
 Podem não apresentar sinais ou manifestações
subclínicas (visíveis a olho nu) por meses ou anos.
Testes moleculares para detecção do DNA viral são
extremamente úteis e sensíveis para a resolução
desse problema. 
Carol
• Princípio: Detecta DNA viral através de hibridização com
sondas específicas (L1/E6/E7).
Etapas principais:
• DNA é extraído da amostra e hibridizado com sondas
específicas (pequenos pedaços de DNA artificial de HPV).
• Complexo DNA-anti-DNA é detectado por
quimiluminescência.
Aplicação:
• Identifica grupos de HPVs oncogênicos e não oncogênicos.
Limitações:
• Não realiza tipagem viral específica.
CAPTURA HÍBRIDA
 É CAPTURADO POR
ANTICORPOS 
HIBRIDIZAÇÃO: 
SONDAS DE DNA ESPECÍFICAS SE
LIGAM AO DNA VIRAL 
DESNATURAÇÃO DO DNA VIRAL: 
É SEPARADO EM CADEIAS
SIMPLES. 
ANTICORPOS CONJUGADOS A
UMA ENZIMA SE LIGAM ÀS
SONDAS DO COMPLEXO.
A enzima converte o
substrato em um sinal
detectável 
Região L1: mais codifica a principal proteína do capsídeo
Regiões E6 e E7: codificam proteínas oncogênicas
Carol
 Detectar a presença do DNA do HPV em uma
amostra.
 Utiliza primers específicos para regiões conservadas
do genoma do HPV como os genes L1 - primer
GP5+/GP6+ ou gene E6/E7 )
 A reação amplifica o DNA viral se ele estiver presente,
permitindo que sua existência seja confirmada.
Aplicação no diagnóstico do HPV:
 Usado para detecção inicial do HPV em situações
onde apenas a presença ou ausência do vírus é
relevante.
Deve ser solicitado quando houver laudos
inconclusivos, lesões persistentes, pacientes com
recidivas e histórico familiar,
PCR
(REAÇÃO EM
CADEIA DA
POLIMERASE)
Carol
PCR
(REAÇÃO EM
CADEIA DA
POLIMERASE)
Vantagens:
 Alta sensibilidade: Detecta pequenas quantidades de DNA viral.
Desvantagens: 
Qualitativa: O PCR convencional apenas informa se o HPV está
presente ou ausente, sem quantificar a carga viral.
 Requer análise adicional: Após a amplificação, é necessário
realizar uma eletroforese em gel para visualizar o DNA, o que
aumenta o tempo do processo e o risco de contaminação.
Pode ser utilizado no manejo de pacientes com ASCUS (Células
Escamosas Atípicas de Significado Indeterminado);
O screening para HPV de baixo risco não tem nenhuma utilidade
Carol
PCR-RFLP (Restriction
Fragment Length
Polymorphism)
A detecção do HPV foi realizada por PCR,
amplificando a região L1 do genoma viral. Foram
usados os primers externos MY09/MY11 (450 pb) e
internos GP5+/GP6+ (150 pb). Plasmídeos
recombinantes de HPV 6, 16 e 18 serviram como
controles positivos, e água deionizada foi usada como
controle negativo. Os produtos foram analisados em
gel de agarose a 2%, corado com brometo de etídio.
A tipificação viral foi feita por PCR-RFLP, com digestão
do fragmento de 450 pb pelas enzimas RsaI (GT/AC)
e DdeI (C/TNAG), incubadas a 37 °C por 14 horas. Os
fragmentos digeridos foram analisados em gel de
poliacrilamida a 10%. Os padrões de restrição foram
comparados a sequências completas de HPV obtidas
do GeneBank, mapeando os primers e os cortes
enzimáticos na região L1.
Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição
Ana Karoline
Digestão com a enzima Rsa I de amostras CB HPV positivas. Gel de polocrilamida a 12% contendo brometo
de etídio. M: marcador 50 pb, Faixa 1 e 5: HPV 18 (135, 125, 85, 72 e 38 pb) Faixa 2 e 3: HPV 16 6 56 (310, 72 e 70
pb), Faixa 4: HPV 35 (177 , 161,72 e 42 pb), Pista 6: Plasmídeo Branco HPV 18 (135, 125, 85, 72 e
38 pb). Pista 7: pPCR utilizado como controle, sem digestão enzimática (450 pb).
Cada poço contém amostras
diferentes processadas com a
enzima RsaI. A análise compara os
fragmentos gerados para
identificar o tipo específico de HPV
presente.
ELETROFORESE / PCR-RFLP
M (marcador de peso molecular) contém fragmentos de
DNA de tamanhos conhecidos (em pares de bases, ou
“pb”) e serve como referência para identificar o tamanho
dos fragmentos gerados.
Tamanhos destacados.
38
Ana Karoline
Genotipagem do HPV:
 • A enzima de restrição RsaI corta o DNA amplificado de regiões específicas
do genoma do HPV (geralmente L1 ou E6/E7), gerando fragmentos de
tamanhos diferentes dependendo do genótipo.
Fragmentos observados: 310, 72 e
70 pb.
 Os tamanhos são consistentes
com genótipos de alto risco,
como HPV 16 ou HPV 56. A
diferenciação pode exigir testes
complementares.
ELETROFORESE / PCR RFLP
Fragmentos observados: 177, 161, 72 e
42 pb.
Este padrão é específico para o
genótipo HPV 35, também
considerado de alto risco.
Fragmentos observados: 135, 125,
85, 72 e 38 pb.
Este padrão corresponde ao
genótipo HPV 18, associado a alto
risco de câncer do colo do útero.
38
Plasmídeo HPV 18 (controle positivo):
Fragmentos observados: 135, 125, 85, 72 e 38 pb.
Este controle confirma que os primers e o protocolo de digestão estão
funcionando corretamente.
Controle sem digestão enzimática
(pPCR):
 Fragmento único observado: 450 pb.
 Esse fragmento corresponde ao
produto de PCR antes da digestão
com a enzima RsaI, mostrando o DNA
intacto amplificado.
Ana Karoline
Lane 6, 7 e 8: Controles positivos
de diferentes espécies de
Leishmania. Cada um apresenta
bandas específicas que
confirmam a amplificação…
Lane 7 e 8: Controles para L. (V.)
braziliensis.
O marcador de peso molecular
(ladder) é usado como referência.
Ele mostra bandas de tamanhos
conhecidos (50 bp, 150 bp, 300
bp). Serve para medir o tamanho
dos fragmentos nas amostras.
Lane 1 a Lane 5: DNA de amostras dos cães. Apenas o Cão 1 (Lane 1)
apresenta uma banda visível no local esperado (150 bp), indicando um
resultado positivo para Leishmania.
1. O que está sendo analisado?
 • Amostras: Foram coletadas de cinco cães (Cão 1 a Cão 5) e controles com DNA de diferentes espécies de Leishmania (Lanes
6, 7 e 8).
 • Primer: O primer usado foi o “hsp 70f e 70r”, que amplifica um fragmento específico relacionado ao DNA da Leishmania.
 • Peso molecular (PM): Um marcador de tamanho molecular foi usado para medir o comprimento dos fragmentos de DNA,
expressos em pares de bases (bp).
CN (Lane 9): Controle negativo. Não
apresenta nenhuma banda,
confirmando que não houve
contaminação no experimento.
Lane 6: Controle para L. (L.) i
chagasi.
PCR EM TEMPO REAL (q-PCR ou
quantitative PCR)
• Enquanto amplifica o DNA do HPV é detectado e quantificado de forma simultânea .
 • Utiliza sondas fluorescentes específicas que emitem luz à medida que o DNA do HPV é amplificado.
Isso permite monitorar a reação em tempo real.
Primers de L1: Para detectar a maioria dos tipos de HPV.
Primers de E6/E7: Específicos para tipos de HPV de alto risco oncogênico (HPV-16, -18, etc.).
Sondas TaqMan: Utilizadas em qPCR para garantir alta especificidade. Essas sondas têm uma
sequência que é complementar ao DNA alvo e liberam fluorescência quando o DNA é
amplificado.
 
Carol
PCR EM TEMPO REAL (q-PCR ou
quantitative PCR)
Aplicação no diagnóstico do HPV:
 
 • Diagnósticos mais precisos, como a quantificação da carga viral em infecções persistentes.
 • Acompanhamento de pacientes com lesões pré-cancerígenas ou câncer.
 • Estudos epidemiológicos que analisam a prevalência e o comportamento do HPV.
Carol
Padrão ouro 
 • Pode ser usado para:
 • Detectar o DNA viral em amostras clínicas.
 • Quantificar a carga viral,
 • Avaliar a expressão dos genes E6/E7 (usando RT-qPCR), que são marcadores importantes de
infecções com potencial de progressão para câncer.
PCR EM TEMPO
REAL (q-PCR ou
quantitative PCR)
Vantagens:
Quantificação precisa: 
 Alta sensibilidade e especificidade: devido ao uso de
sondas específicas.
 Mais rápido: sem necessidade de eletroforese.
Desvantagens:
Custo elevado: Requer equipamentos sofisticados e
sondas fluorescentes, tornando-o mais caro.
Técnica avançada: Exige maior expertise técnica no design
de sondas e na interpretação dos resultados.
Carol
PCR EM TEMPO
REAL (PCR
MULTIPLEX)
• O PCR multiplex permite detectar múltiplos genótipos de
HPV em uma única reação.
 • Utiliza vários pares de primers, cada um específico para
diferentes tipos de HPV (por exemplo, os de alto risco, como
HPV 16 e 18, e os de baixo risco, como HPV 6 e 11).
 • É uma técnica qualitativa, mas também pode ser
combinada com qPCR para detecção e quantificação
simultâneas.
Aplicação no diagnóstico do HPV:
 • Principalmente em painéis de genotipagem, que
identificam quais tipos de HPV estão presentes.
 • Importante para rastreamento populacional e programas de
saúde pública.
Ana Karoline
PCR EM TEMPO
REAL (PCR
MULTIPLEX)
Vantagens:
Eficiência: Detecta vários tipos de HPV em uma única
reação, economizando tempo e reagentes.
Diagnóstico detalhado: Ajuda na genotipagem, que é
essencial para identificar infecções causadas por tipos de
alto risco (associados ao câncer).
Personalização do tratamento: Saber quais tipos de HPV
estão presentes pode guiar decisões clínicas.
Desvantagens:
Mais complexa: O design dos primers precisa ser otimizado
para evitar interferências (overlap) entre as diferentes
reações.
Menos quantitativa: Na forma convencional, o PCR
multiplex não quantifica a carga viral.
Ana Karoline
• 50 anos
• Relata dor abdominal inferior e
tumor ovariano
• Solicitam: BH, Tempos de
Coagulação, QS, CA-125, HPV28
e Esfregaços PAP
• Tipo de amostra:
Exsudato Cérvico-Vaginal
CASO
CLINICO
Ana Karoline
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
(PCR MULTIPLEX)
Ana Karoline
Técnica Objetivo Vantagens Quando usar Quando usar
PCR
Detectar presença
de DNA viral
Simples,
Barato, alta
sensibilidade
Apenas qualitativa;
análise adicional
necessária
Usado na triagem
em laboratórios.
qPCR
Detectar e
quantificar DNA viral
Quantitativa,
rápida, alta
sensibilidade e
especificidade
Custo elevado,
maior
complexidade 
Carga viral, estudos
de progressão ou
controle clínico
PCR multiplex
Detectar múltiplos
genótipos de HPV 
Diagnóstico
abrangente,
eficiente
Técnica complexa,
otimização
necessária
Identificar vários
tipos de HPV em
uma única reação
Ana Karoline
COMPARAÇÃO DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
IMPORTÂNCIA DOS
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
• PCR e PCR em Tempo Real:
• Diagnóstico mais preciso para HPV de alto risco, essencial na triagem do câncer no colo do útero.
• Identificação precoce reduz mortalidade e melhora prognóstico.
• Captura Híbrida:
• Método complementar útil em triagem inicial.
• Melhor utilizado em combinação com citologia para maior eficácia.
Conclusão:
• A escolha do método depende dos objetivos clínicos: triagem, diagnóstico precoce ou monitoramento.
• PCR em tempo real é o método mais avançado para diagnóstico molecular do HPV, devido à sua
precisão e eficiência.
REFERÊNCIAS 
Microbiologia médica. Murray, Rosenthal, Pfaller. 8 edição.
https://integrada.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788595151741/ cfi/6/2!/4/4/2/2@0.00:63.2
Microbiologia médica básica. Patrick R. Murray. 
https://integrada.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788595151758/ cfi/6/2!/4/2/2/2@,0:0.00
https://www.evolution.com.br/product/9788535290370
International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). Consulta em nov/2019.
Fields, Bernard N; Knipe, David M; Howley, Peter M. Fields virology. Philadelphia : Wolters Kluwer Health.
6th ed. 2013.
https://www.evolution.com.br/product/9788535290370 International Committee on Taxonomy of
Viruses (ICTV). Consulta em nov/2019. Fields, Bernard N; Knipe, David M; Howley, Peter M. Fields virology.
Philadelphia : Wolters Kluwer Health. 6th ed. 2013.
https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_online_report/dsdna-viruses/w/papillomaviridae