IMUNO CLÍNICA - AULA 11 pdf

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18/10/2015
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ELISA (ensaio imunoenzimático)
Profº Evaldo Moreira
Elisa
• Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay (ensaio
imunoenzimático - ensaio imuno adsorvente ligado à
enzima);
• Baseia-se em reações antígeno-anticorpo detectáveis por
meio de reações enzimáticas;
• A enzima mais comumente usada nesta prova á a peroxidase,
responsável por catalisar a reação de desdobramento da água
oxigenada (H2O2) em H2O mais O2;
• Apresentam elevada sensibilidade e especificidade, rapidez,
baixo custo e fácil intepretação do resultado;
• O teste ELISA é o método imunoenzimático mais
comumente utilizado nos laboratórios. O resultado do
ensaio, é um substrato colorido, monitorado visualmente ou
por meio de espectrofotômetro.
Direto ou Indireto?
ELISA
DIRETO
INDIRETO
Antígenos
Anticorpos
Elisa Direto (sanduíche)
Dentre os diversos tipos de ELISA, destaca-se o
“ELISA SANDUÍCHE”. Nesse método, o anticorpo de
um antígeno particular é, inicialmente, adsorvido no
“well”. Depois, o antígeno (soro, urina ou outra
solução contendo o antígeno) é adicionado e se liga ao
anticorpo. Finalmente, um segundo e diferente
anticorpo conjugado à enzima é adicionado. Nesse
caso, a intensidade da reação é proporcional à
quantidade de antígeno presente. Logo, permite
mensurar até pequenas quantidades de antígeno.
No ELISA direto (sanduíche) um anticorpo conjugado
se liga ao antígeno pesquisado.
Elisa Indireto
• O ELISA indireto é uma técnica utilizada para
detecção de anticorpo, sendo assim, utiliza-se uma
placa contendo, aderida na parte solida, antígenos
para a patologia a ser analisada e seguem-se as
seguintes etapas:
1º Coloca-se o soro do paciente nos poços presentes na
placa. Se existir presença de anticorpos, esses se ligarão
aos antígenos presentes na placa formando um
complexo: antígeno (ligado à placa) – anticorpo;
2º Após esse processo é realizada uma lavagem da placa
(essa lavagem é feita usando um tampão de lavagem),
para retirar os anticorpos não ligados;
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3º Adiciona-se depois um anti-anticorpo conjugado
(anticorpo secundário), assim se formará um complexo:
antígeno (ligado à placa) – anticorpo – anti-anticorpo
conjugado;
4º Realiza-se outra lavagem, para se retirar o excesso
de anti-anticorpo conjugado, que não formou o
complexo citado acima;
5º Adiciona-se um substrato para a enzima (no caso da
enzima ser a peroxidase, utiliza-se como substrato o
peróxido de hidrogênio e cromógenos). O substrato
adicionado, ao se ligar à enzima do complexo, forma
um produto colorido;
6º Por fim adiciona-se uma solução de parada, ou seja,
uma solução que interrompa a ação da enzima para que
assim a solução não fique com uma coloração muito
forte e atrapalhe a leitura do teste.
No ELISA indireto, um anti-anticorpo conjugado se
liga ao anticorpo pesquisado.
O ELISA constitui a base do teste para infecção
por HIV. Nesse teste, proteínas virais (os
antígenos) adsorvem nos “poços” (wells) da placa
de ELISA. Em seguida, é adicionado soro do
paciente contendo anticorpos que se ligam aos
antígenos. Finalmente, anticorpos ligados à
enzima ligam-se aos anticorpos humanos,
propiciando a reação enzimática com mudança de
cor.
Método Competitivo
O método competitivo é mais usado para
identificação de antígenos. Neste método, primeiro
se adsorve o anticorpo no poço da microplaca.
Após a adsorção do anticorpo, uma solução que
possivelmente contém o antígeno (amostra) é
adicionada sobre os anticorpos adsorvidos. O
próximo passo é adicionar o antígeno marcado
com uma enzima. Os poços que não possuem o
antígeno primário (da amostra) aderido ao
anticorpo ficam coloridos, enquanto que os poços
que possuem antígenos aderidos aos anticorpos
não mudam de cor (ou sofrem pequena alteração).
Materiais e Equipamento Utilizados
PLACAS DE ELISA
Pipetas e ponteiras
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Lavador de Placas Leitor de Elisa (espectrofotômetro)
Soluções e Reagentes
• Soluções de 
lavagem;
• Reagente com o Ac 
conjugado a enzima;
• Substrato;
• Solução de parada.
Cuidados
• Data de validade e estocagem dos
REAGENTES;
• Processamento e estocagem das AMOSTRAS;
• Evitar contaminação no PREPARO DE
SOLUÇÕES;
• CALIBRAÇÃO de pipetas e demais aparelhos;
• LIMPEZA.
Imunofluorescência
Profº Evaldo Moreira
Imunofluorescência
Imunofluorescência é definida como uma
técnica que possibilita a visualização de antígenos
ou anticorpos, nos tecidos ou em suspensões
celulares, por meio da utilização de
anticorpos específicos, marcados com
fluorocromo, capazes de absorverem a luz ultra-
violeta (UV), emitindo-a num determinado
comprimento de onda, permitindo sua observação
ao microscópio de fluorescência (com luz UV).
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Direta ou Indireta?
• Existem dois tipos distintos de
imunofluorescência. São elas:
Imunofluorescência Direta (detecção de
antígeno);
Imunofluorescência Indireta (detecção de
anticorpos);
Imunofluorescência Direta
• Utiliza-se esta técnica, também conhecida como técnica
de camada simples, para detecção de antígenos em
amostras clínicas utilizando-se anticorpos marcados com
fluorocromos;
• Etapas:
1- Fixação do esfregaço da lâmina;
2- Tratamento com anticorpo marcado;
3- Incubação;
4- Lavagem para remover excesso de anticorpos
marcados não ligados;
5- Visualização no microscópio fluorescente.
Imunofluorescência Indireta
Utiliza-se este tipo de imunofluorescência, também
conhecida como técnica de dupla camada, na detecção
de anticorpos no soro do paciente por meio de
antígenos fixados em uma lâmina, na qual se aplica
primeiramente a amostra. Por fim, coloca-se um anti-
anticorpo fluorescente com especificidade contra
determinado anticorpo usado para reagir com o
antígeno.
• Esta técnica tem como vantagem possibilitar uma
fluorescência mais evidente, uma vez que os anti-
anticorpos fluorescentes associam-se somente aos
anticorpos primários, além de permite trabalhar
com diversos anticorpos primários específicos para
distintos tipos de antígenos, sendo capaz de
identificar qual a classe a qual o anticorpo pertence.
• Habitualmente, a imunofluorescência indireta é
utilizada na detecção de auto-anticorpos, e também,
na detecção de anticorpos anti-nucleares
encontrados no soro de pacientes com lúpus
eritematoso sistêmico.
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Resultado?
FAN – Fator Antinuclear
O FAN (fator antinuclear) é feito com amostras de
sangue do paciente com suspeita de doença
autoimune (o indivíduo tem anticorpos contra suas
próprias células). No laboratório consegue-se
identificar todos os anticorpos circulantes neste
sangue. Com um corante fluorescente o laboratório
marca cada um destes anticorpos. Depois, mistura-se
este sangue em um recipiente com uma cultura de
células humanas (chamadas de Hep2).
Se houver anticorpos contra
estruturas das células humanas,
estes irão se fixar às mesmas,
tornando-as fluorescentes. Se o
auto-anticorpo for contra o
núcleo das células, a imagem no
microscópio será de vários
núcleos fluorescentes. Se auto-
anticorpo for contra o
citoplasma das células, vários
citoplasmas ficarão brilhando, e
assim por diante. Se não houver
auto-anticorpos, nenhuma parte
das células ficará fluorescente,
caracterizando um FAN não-
reativo.
• Os resultados são repetidos após várias diluições do
sangue, até a fluorescência desaparecer. Resultados
positivos são aqueles que permanecem brilhando
mesmo após 40 diluições (resultado 1/40 ou 1:40).
Portanto, um FAN reagente 1/40 significa que o
auto-anticorpo foi identificado mesmo após
diluirmos o sangue 40 vezes;
• Até 10% da população possui FAN positivo,
geralmente nas diluições menores que 1/80. Isto
significa que só são valorizados valores a partir de
1/160. As diluições são normalmente feitas na
seguinte ordem: (1/40), (1/80), (1/160), (1/320),
(1/640), (1/1280). Valores maiores ouiguais a 1/320
são muito relevantes e indicam doença autoimune
em mais de 97% dos casos.