Aulas Transcritas Imuno - Prof Rita fucs

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Imunobiologia
Fellype de Bulhões Ojeda – MedUFF211
Prof. Rita Fucs
Moléculas de reconhecimento antigênico por linfócitos T: Receptor clonal de células T (TCR) e Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC)
TCR
Não existe na forma solúvel; Só como receptor de membrana.
Não reconhece o antígeno em forma nativa (A APC fagocita a bactéria, sendo internalizada e digerida. As proteínas são clivadas e são apresentadas pela proteína de membrana MHC em suas fendas, sendo então reconhecida pelo TCR, presente no linfócito T).
TCR vs Imunoglobulina
Ambos têm regiões variáveis e constantes, a diferença é que tem apenas duas cadeias em vez de quatro, mas não possuem cadeia leve e pesada, que possuem o mesmo tamanho. As regiões constantes estão inseridas na membrana e as variáveis, mais afastadas da membrana é que vão reconhecer os antígenos. As denominações são pelos tipos de cadeia. O TCR do tipo gama-delta (usado por apenas 5% dos linofonodos) é muito pouco presente no homem, restrito a alguns sítios, como baço, linfonodo e grandes órgãos linfoides, estando presente em maior proporção em regiões de mucosa (placas de peyer, lamina própria).Tendem a sair do timo antes de haver uma seleção com linfócitos reativos e com as APC, funcionando como uma população especial, diferente dos linfócitos T. Eles são muito autoreativas ocasionando problemas. Podem por vezes reconhecer antígenos sem necessidade de apresentação, sendo muito reativo.
Os TCRs possuem carboidratos, diferentemente da imunoglobulinas, os quais são inseridos após as cadeias estarem prontas, pontes de sulfeto ligando as duas cadeias, região de dobradiça e cauda intercitoplasmatica.
Bem como nas imunoglobulinas, há 3 regiões hipervariáveis de aminoácidos (CDR1, CDR2 e CDR3) entre as regiões variáveis. Na forma enrolada, essas regiões hipervariáveis são aproximadas justamente para fazer o sitio de combinação do antígeno. CDR -> região recombinante de complementaridade. As outras regiões, não hipervariáveis, são denominadas de estruturais.
A forma de codificação é também semelhante a das imunoglobulinas. Os gens V são escolhidos aleatoriamente pra se juntar com um dos gen J, formando a região variável em células que já são linfócitos. Em células precursoras esses estão separados. O DNA já rearranjado só ocorre em linfócitos maturos. A cadeia alfa é parecida com os gens da cadeia leve e a beta com os gens da pesada (VDJ) das imunoglobulinas.
No TCR, as regiões constantes são iguais, não possuindo apenas uma função. Não há isotipos diferentes. Apesar de haver gens para regiões constantes diferentes, esses não vão levar a produção de proteínas diferentes.
A RAG1 e a RAG2 são as que também vao fazer rearranjo no linfócito T, se ligando nas regiões sinalizadoras RSS. Ou seja, camundongos sem RAG1 e RAG2 não conseguem produzir nem linfócito T nem B. A outra enzima igual é a TdT, a qual insere nucleotídeos ao acaso em numero e tipo após a ação das exonucleases (RAG), que retiram as alças do DNA. Portanto, mesmo que se tenha a escolha dos mesmos gens, devido a TdT, se formará diferentes tipos de receptores TCR. A TdT se liga as regiões intermediária RSS e insere nucleotídeos.
Na cadeia alfa há uma região onde se pode inserir nucleotídeos, na cadeia beta há duas regiões, como na cadeia pesada de imunoglobulinas, vamos ter portanto duas regiões de enorme diversidade entre V e D ; D e J.
Os primeiros timócitos são CD4- e CD8-. A primeira a se arreanjar é a beta, rearranjando primeiro um segmento D com o J, passando para a etapa em que se já reconhece o CD25 e CD44. A terceira etapa, após a cadeia beta pronta, ela vai pra membrana com uma prévia alfa. Há uma sinalização, um feed back, para parar de rearranjar cadeia beta, pois já existe uma cadeia beta que já ficou pronta e deu certo. Quando deu certo tem-se que parar de rearranjar o outro alelo e começar a rearranjar a cadeia alfa.
As áreas CDR1 e CDR2 da proteína é codificada pelo gen V. A CDR3 é dependente do final da região do gen V, D (cadeia beta) e J, além da inserção aleatória de nucleotídeos. A região CDR3 é a que mais vai ser importante para a maior variabilidade do TCR, devido a inserção de nucleotídeos.
MHC (major histocompability complex)
Complexo de histocompatibilidade principal
Proteinas do MHC (HL-A em humanos; H-2 em camundongo)
Tem-se duas classes principais de proteínas codificadas pelo MHC:
Classe I -> três proteínas em humanos: A, B e C. Em camundongos K,D,L)
São compostas de uma cadeia de peptídica (alfa 1, alfa2 e alfa3) que são mantidas estáveis pela proteína beta2-microglobulina, mas esta não tem nada a ver com MHC. São expressas em todas as células do corpo, com poucas exceções (sanguínea, espermatozoide). Apresentação para Linfócitos T CD8+.
Classe II -> três proteínas em humanos: DP, DQ e DR. Em camungongos IA, IE)
São presentes nas APC (células dendriticas, macrófagos, langerhans, linfócitos B, linfócito T ativado, células epiteliais do timo - timócitos). Apresentação para CD4+.
São compostas por duas cadeias alfa e beta (alfa1, alfa2 e beta1 e beta2), sem nenhuma proteína de estabilização.
Em todos mamíferos tem-se proteínas de MHC, desde o tubarão.
Na MHC I, a proteína alfa3 está inserida na membrana, e os domínios alfa1 e alfa2 é quem forma a fenda, onde se ligará o antígeno. Olhando as proteínas por cima temos um chão de folha beta ladeados por cadeias alfa hélice, sendo que a da classe dois permite o reconhecimento de peptídeos maiores.
No MHC II, tem-se duas partes, em que a beta2 e alfa2 se inserem na membrana e alfa1 e beta1 se liga ao antígeno. Tem-se a mesma estrutura da classe I quando olhada de cima. Uma fenda em que o chão é formada por beta folha ladeada por alfa-hélice. São as alfas-hélices que limitam o tamanho do peptídeo que vão se ligar. A de Classe II permite a ligação de peptídeos maiores.
Os domínios alfa 1 e alfa 2 do MHC classe I, são o de maior variabilidade e estão presentes no chão da fenda. São denominados peptídeos de ancoramento, pois neles é que há a interação que definirá o reconhecimento.
No MHC de classe II, a região beta I é de maior variabilidade.
Nos peptídeos que se ligaram na molécula de MHC, há duas regiões de aminoácidos, que se preservada em diversos peptídeos, garantirão que o peptídeo se ligará na molécula de MHC. Os aminoácidos podem ser trocados caso sejam trocados por aminoácidos muitos parecidos e ainda assim o peptídeo se ligará no MHC.
O MHC pode também apresentar regiões que são reconhecidas pelo TCR. Ou seja, o TCR pode interagir tanto com o MHC como com o peptídeo.
O MHC possui uma vasta possibilidade de gens para cada alelo. Tem-se gen para proteína A, B e C, que compõem a classe I, sendo que cada uma possui um gen (gen para A, gen para b e gen para C). 
As proteínas para DQ, DP e DR, que compõem a classe II, necessitam de dois genes cada, pois são compostas de duas cadeias polipeptídias, alfa e beta. Além desses peptidios de apresentação que ficam na membrana, tem-se no conjunto de genes para classe II, os genes para proteína LMPII e LMPVII que fazem parte de um complexo enzimático que cliva as proteínas(antígenos, peptídeos). Esse complexo é denominado de proteossoma possui 20 proteinas diferentes em que as outras se localizam em outros cromossomos. Tem-se também nessa região os genes para TAPI e TAPII, que codificam proteínas que fazem o transporte dos peptídeos clivados pelo proteossoma. Essas proteínas TAP é que transportam os peptídeos clivados para o MHC de classe I. As que se ligam no MHC classe II são clivados no lisossoma, que são geralmente proteínas de peptídeos de microrganismos endocitados. Esses peptídeos para classe II são transportados pela proteína DM, composta por alfa e beta.
Na área de classe III, não se é conhecido muito bem o porque, mas nessa região se localiza genes para citocinas. TNF, inibidores,proteínas do sistema complemento, proteínas de choque térmico, proteínas do sistema inato, que não tem nada a ver com apresentação de antígeno.
A característica mais importante dessas proteínas de MHC é o polimorfismo.Ou seja, pra cada um desses locus, se formos analisar os genes de A, B, C... nos indivíduos, raramente encontrar-se-á indivíduos que apresentem os mesmos genes. A única região com essa característica genética é o MHC.
Isso que é responsável pelas diferentes respostas as bactérias, vírus, proteínas... e também a rejeição muito comum a transplantes, a histocompatibilidade. A coleção de peptídeos de que uma proteína A, por exemplo, se encaixa, é diferente da coleção de peptídeos que a proteína A de outro indivíduo encaixa. Após uma resposta a uma bactéria, por exemplo, os indivíduos estarão apresentando diferentes peptídeos da mesma bactéria.
Tem-se os genes Classe Ia (Classe A, B, C)-> clássicos e Classe Ib (D, E, F, G)-> não clássicos. Os Classe Ia é que são polimórficos, responsáveis realmente pelo reconhecimento.
Os nossos genes possuem os mesmos MHC. Não existem macrófagos e células dendriticas com MHC diferentes. Todas nossas células apresentam o mesmo MHC.
MHC I é expressa em todas as células, com exceção das não nucleadas. O que se tem é a expressão em graus diferentes. As de classe II estão presentes em APC. Linfócitos T não ativados não apresentam MHC classe II. O grau de expressão também é diferente, podendo aumentar após uma resposta.
Transporte de peptídeos (antígenos) até a membrana
O MHC de classe I, assim que é sintetizada, é estabilizada pela calnexina, que depois é trocada pela calreticulina e tapasina, recebendo juntamente a beta2microglobulina. A proteína (antígeno) é degradada nos proteossomos, um complexo enzimático, e levadas até o MHC I pela proteína TAP presente na membrana do RER ao lado dos componentes que estabilizam o MHC. O MHC só é estável após a ligação com a beta2microglobulina e após a ligação com o antígeno. Após o MHC se ligar com o peptídeo, ele é transportado via vesícula para a membrana.
Numa situação de infecção, esses peptídeos são de fabricados dentro da própria célula. Em infecções virais, tem-se alguns vírus que inserem o seu DNA na célula e dirigem a síntese de peptídeos virais. Outros parasitas intracelulares também conseguem levar a produção de proteínas dentro da célula. Os MHC de classe I, portanto, apresentam proteínas que são produzidas pela própria célula, não são provenientes de microrganismos que são fagocitados.
Na ausência de infecção, é levada até a MHC I peptideos próprios, que são produzidos o tempo inteiro e degradadas em proteossomos.
A MHC de classe II é inicialmente estabilizada pela proteína denominada de cadeia invariante, que possui a região denominada Clip (em vermelho), na região da fenda. A proteína vai ser clivada permanecendo somente a região clip no MHC, que só deixa a fenda após a entrada de um outro peptídeo, que a mantém estável. Mas o CLIP também impede a ligação de peptídeos não provenientes de antígenos. A proteína de transporte que leva o peptidio até o MHCII é a HLA-DM. A DM faz com que o CLIP se solte do MHC II.
Geralmente apresentam peptideios de bactérias, principalmente de infecções agudas, como de estreptococos, que são muito fagocitadas, que são degradadas em lisossomos. 
Nunca se verá proteína de MHC sem estar ligada a um peptídeo e exposta na membrana.
Dependentemente do tipo de patógeno, ele será apresentado por classe I ou II:
Os microorganismos, como vírus, presentes no citosol, são apresentados pelo MHCI e morrem por ação citotóxica, intermediada pelo linfócito CD8.
Patógenos dentro de vesículas, como fagossomos, que depois vira fagolissosomos, são digeridos em vesículas de pH baixo. Esses peptídeos apresentados pelo MHCII são reconhecidos por CD4. Essa célula CD4 ativa o macrófago a digerir melhor, ajudam na ativação para matar as bactérias intravesiculares.
Outra situação são os peptídeos apresentados por linfócitos B. Eles captam os peptídeos por meio da imunoglobulina. Eles digerem via vesícula endocitica com a ajuda de células T CD4. Os linfócitos CD4 ativam o linfócito B para que ele produza imunoglobulinas que ajudem na eliminação de antígenos.
Patógenos extracelulares também são endocitados e recebem a mesma ação dos patógenos endocitados.
Além desses genes de MHC sofrerem rearranjo, eles possuem uma herança co-dominante. Todos são expressos.
Os dois alelos, maternos e paternos, são expressos. Portanto há dois alelos A1,A2, B1, B2 e C1, C2. Raramente esses alelos são iguais.
Individuos heterozigotos possuem, portanto, 4DP, 4 DQ, 4DR, 2ª, 2B e 2C, apresentando no final 18 tipos de proteínas de apresentação. Esse complexo de proteína é mais variado ainda, pois são compostos por duas proteínas cada, podendo haver combinação duas a duas.
Do lados das APC, apresentamos antígenos próprios o tempo inteiro, a regulação para doenças auto-imunes ocorre no lado dos linfócitos T.
Aula Prática
Citometria de Fluxo
É empregada para identificar populações de células muito semelhantes ao microscópio, como linfócitos T e B.
Para a citometria de fluxo são necessários:
Células em suspensão
Sondas (anticorpos marcados, por serem mais específicos; radisótopos; fluorocromos)
Citômetro
Objetivos
Entender como funciona um citometro de fluxo e sua aplicabilidade médica
Analisar os gráficos gerados e interpretar as informações obtidas
Etapas do processo
Marcação das células com Sondas
Anticorpos são marcados com fluorocomos (mais utilizados) são adicionados à suspensão celular
Anticorpos são específicos para os antígenos que se deseja marcar (Ex: CD4 e CD8)
Passagem das células em fluxo
Um fluxo contínuo permite a passagem de uma célula por vez
Identificação celular
Através de um feixe de laser incide sobre as células podemos obter as seguintes informações. Nesse lase há diversos tipos de sensores.
Forward scatter (sensor frontal): identifica o tamanho das células. A identificação ocorre pelo grau de desvio da luz. Pequenas células causam pouco desvio, grandes células causa grande desvio.
Side scatter (sensor lateral): identifica a complexidade das células. O desvio de luz medido é quanto a estrutura celular, quanto maior a estrutura da célula internamente, maior o desvio?
Tubos fotomultiplicadores: Identificam a cor emitida pelo fluorocromo. Temos em uma mesma população diversidade de cores. Temos células expressando muito MHC, apresentam cores intensas. Com pouco MHC, expressando com pouca intensidade.
Análise: janelas para restringir a população a ser analisada; ctr negativo e positivo; obtenção dos valores quantitativos.
Separação das células
Pode ou não ser feita.
Após a identificação das informações pelo laser as células passam pelo separador (Cell sorter)
Os sinais enviados ao computador são usados para gerar carga elétrica à gotícula
Gotículas com carga elétrica são passadas por placas de cargas opostas, de modo a serem atraídas pela de carga oposta. 
Obtemos as informações da gotícula, a partir dai carregamos ou não.
Análise de gráficos
Histogramas: apresentam um numero de células positivas e negativas para o parâmetro analisado.
Dot Plot: Analisa mais de um parâmetro simultaneamente e a concentração celular é expressa em pontos.
No Dot Plot verificamos 4 quadrantes. O traço horizontal delimita a janela, e é definido por nós. Abaixo dele é negativo e acima é positiva.
Eixo Y: complexidade Eixo X: tamanho
D: hemácia C: linfócito B:monócito A: neutrofilo 
9/05/2012
Linfopoiese T, Geração de diversidade, seleção intra-tímica, geração de células T regulatórias
Os dois principais processos para o amadurecimento do linfócito são: recombinação (rearranjo genético){VDJ -> cadeia beta e VJ-> cadeia alfa; por meio da RAG 1 e 2 e TdT}. O segundo processo, que impede a auto-reação a antígenos do corpo e fazem com que ele só reconheça células ligadas ao MHC, é a seleção positiva (em que ocorre a escolha de receptor de CD4 e CD8) e a seleção negativa (determina restrição ao MHC e elimina linfócitos auto-reativos). 
Timo é constituído por grandes lóbos, envolvidos por uma capsula, que o divide em lóbulos. No timo temos duas regiões. A região cortical possui células epiteliais corticais e timócitos (que irão originar o linfócito).Também há células precursoras hematopoiéticas, que são recebidas via sanguínea. São recebidas células que originarão linfócitos, mas também células dendritícas, células NK, macrófagos e um pouco de linfócitos B. Na região medular tem-se as células epiteliais medulares, células dendriticas e macrófagos. A diferenciação ocorre do córtex pra medula. Na região da medula, portanto, é onde se encontra os linfócitos mais maduros.
Inicialmente tem-se linfócitos triplo negativos, pois não expressão nem CD3, nem CD4 nem CD8. Todas elas sinalizam que o linfócito está ativado quando fora do timo. CD3 é que auxilia diretamente no TCR, bem como as outras. São denominados duplo negativos pois só se valoriza mais o CD4 e CD8. Nessa fase é que vai ocorrer rearranjo da cadeia alfa e da cadeia beta. Quando os linfócitos já tem algum receptor, eles começam a interagir com as células epiteliais do córtex, podendo interagir com os MHC das células epiteliais.
As células epiteliais apresentam MHC class I e II, que irão ajudar na maturação dos timócitos, que passam a ser denominadas de duplo-positivas, expressando os CD3, 4 e 8.Antes de passar pra região da medula, ele já expressa ou CD4 ou CD8. Na medula ele interage com células de origem hematopoiética (macrófago, células dendriticas), podendo haver alguma interação com as células epiteliais. Nessa fase acontece a seleção negativa, eliminando os auto-reativos. Posteriormente saem pela região da vênula.
Os dois tipos de estroma são importantes para desencadear a maturação dos linfócitos T. Tanto o estroma tímico (a parte epitelial) quanto as células hematopoéticas que entram via sangue. 
Camundongos nude apresentam defeitos no epitélio em que o timo não consegue se desenvolver, tornando-se atrofiado ou ausente, e também não apresentam pelos. Os camundongos SCID apresentam defeito na recombinação VDJ com timo normal, pois possuem defeitos nos genes de RAG1 e RAG2. Ambos os camundongos não apresentam células T, apesar de terem células não T. Se transfere células da medula marrom, hematopoiéticas do nude para o scid, este passa a produzir linfócitos T. Se faz-se o transplante de timo de scid para nude, o nude passa a produzir linfócito T. Isso prova que são estrtuturas essenciais.
Etapas do desenvolvimento dos linfócitos T
Além da fase duplo negativo, há subfases denominada de duplo negativo 1, 2, 3 e 4. Estas fases são diferenciadas por proteínas de superfície como: CD44, CD25 e CD117. As células progenitoras hematopoiéticas entram no timo através da junção cortiço-medular. 
O progenitor hematopoiético, expressando apenas CD117, entra no timo e passa a expressar grande quantidade de CD44. Com a expressão do CD44, a célula entra em fase de duplo negativo I (CD44hi) e há a migração para a região subcapsular e começam a proliferar com intensidade. Na fase de DN 2, a célula passa a apresentar as três proteínas na sua superfície. E é também nessa fase que inicia-se o rearranjo das cadeias. Inicialmente tem-se o rearranjo dos genes de beta, gama e delta.
Na fase DN3, a célula já expressa pouco CD44 e CD117 negativo e já se completou o rearranjo de cadeia beta, gama e delta. Passa-se a apresentar na membrana da célula um receptor pré-TCR formado pela cadeia beta que já fez o rearranjo juntamente com uma cadeia alfa provisória ou então um TCR gama-delta que se rearranjão precocemente.
Um mesmo precursor formará a célula com pré-TCR ou com TCR gama-delta. Se a célula com TCR gama-delta interagir com peptídeos com o qual tem afinidade, vai-se gerar sinais para que a célula continue na linhagem gama-delta. E se tiver sinais que interajam com o pré-TCR, mesmo que o rearranjo já tenha acontecido, haverá a sinais para que a célula continue nessa linhagem tornando-se um linfócito alfa-beta.
Após o rearranjo tem-se a fase duplo positiva, e a célula passa expressar tanto CD4, como CD8. Nessa fase, por meio do pré-TCR, vai haver sinalização para que o outro alelo de beta pare de tentar o rearranjo, para que não fique dois tipos de receptores alfa-beta na membrana da célula. E vai haver a ativação do rearranjo para a cadeia alfa.
Após essa fase, com a presença de TCR, já ocorre a interação com as célula epiteliais do córtex, havendo a seleção positiva, em que a célula escolhe se ela se tornará CD4 ou CD8. Isso vai depender novamente com qual peptídeo a célula terá maior afinidade.
Nas células epiteliais podem haver MHC de classe I ou de classe II. As células T apresentam tanto CD4 ou CD8. Se o linfócito T apresentar um TCR que tem afinidade por um peptídeo apresentado por um MHC de classe I, a proteína CD8 terá a afinidade por uma região constante do MHC I. A interação fará com que a proteína CD8 de sinal para que o linfócito (timócito) não seja morto e que continua a sua diferenciação. Os timócitos que não interagirem com nada morrerão.
Os timocitos tem que interagir constantemente com as células, o que se denomina seleção positiva, que “salva” o timócito da apoptose. Os que são responsivos a MHC class I, mantem apenas proteína CD8, os que respondem a MHC class II, mantem apenas proteína CD4. A interação ocorre na região constante do receptor. Após todo o processo, as células tornam-se simples positivas.
CD3 só vai pra membrana junto com TCR.
A seleção dos linfócitos é dependente de interação entre TCR e complexos MHC-peptídeo.
As células epiteliais do córtex expressam peptídeos MHC para os timócitos duplo-positivos. Se isto ocorre é porque há afinidade e haverá, portanto, seleção positiva e essa célula seguira na diferenciação. 
Se não haver nenhum reconhecimento por peptídeo, haverá morte por negligenciamento. Seleção negativa é quando ocorre interação muito forte com o peptídeo e seleção positiva quando interage fracamente.`
Numa situação hipotética, se tivéssemos timócitos que sofreram seleção positiva e interagissem na medula com os mesmos peptídeos que já haviam interagido, morreriam os quatro. Para isso tem que haver um mecanismo para que dos que foram selecionado positivamente, só morram alguns.
Existem várias hipóteses para isso, a mais aceita é a da diferença do grau de afinidade. O que vai determinar se um linfócito morre por apoptose por não interagir, se é selecionado e sai do timo ou morre por excesso de interação é justamente o grau de afinidade.
Os que não interagem com nada morrem. Os que possuem afinidade intermediária é o que são selecionados e saem do timo. E existe uma grande parte que interagem demasiadamente e morre. O sinal que inibe a cascata de apoptose, portanto, é bem pequeno. Existe também um grau de afinidade um pouco mais baixo do que leva a seleção negativa que é o que gera células T com papel regulador. Estas células possuem grande grau de afinidade por peptídeos próprios, mas que não levem a morrer por apoptose. Em vez disso elas sai do timo com um fenótipo que as torna capaz de suprimir outros linfócitos.
Existem outras hipóteses. Uma diz que as células que os timócitos interagem em cada etapa é diferente. Na seleção positiva ele está no córtex, onde interagem com células epitelias em que estas células liberem proteínas que emitem sinais o suficiente para inibir a apoptose mas que não as levem a morte das células. Quando chega na medula, interagirão mais com macrófagos, células dendríticas e outras células de origem hematopoética. Essas células liberam fatores que ao invés de inbir a apoptose, ativam a apoptose.
Ainda tem outros autores que dizem que esse processo depende do grau de maturidade de cada timócito. Do mesmo modo em que as células apresentam um tipo de proteína na membrana em cada grau de maturação (por exemplo, nas fases de duplo negativo), pode haver graus de maturação interna, de diferença de metabolismo, de proteínas internas, em que leve a um mesmo sinal, em diferentes fases de maturação, resulte em resposta diferente. Mas o mais aceito é a teoria da afinidade.
Tem-se um grande numero de timócitos que morrem por não interagirem com ninguém, pois o numero é restrito. É muito mais provável que se faça TCR que não interaja com peptídeoalgum. E existe uma quantidade muito menor de TCRs que interagem com peptídeos próprios e que sofrem o processo de deleção clonal (morrem por apoptose), edição de receptor (alteração na cadeia alfa) e alguns tem anergia, como acontece nas células T regulatórias, que possuem grande afinidade pelo próprio, mas ao invés de morrer, saem do timo e regulam os linfócitos. Além das Treg tem –se as NKT e as células epiteliais (CD8 positivas). Células que vao regular o sistema imune.
O outro grupo maior, que vai fazer o repertório contra antígeno estranho, vai reagir com o peptídeo estranho por reatividade cruzada. Foi selecionado pelo timo através de interação fraca com os antígenos próprios. Quando estiver fora do timo, interagindo com MHC de macrófagos e células dendríticas, apresentando peptídeo bacteriano, ai pode ser a afinidade do TCR seja muito maior, pois trocou-se o peptídeo.
No final, apenas 5% da nossa coleção inicial de linfócitos T é que sairão do timo.
A afinidade da interação TCR-MHC é, portanto, o que define a escolha dos linfócitos. Algumas células com afinidade alta, mas nem tão alta, geram células regulatórias. A maior parte dos linfócitos T morrem por negligencia, a segunda maior parte ocorre a seleção positiva. E a terceira e menor são selecionadas negativamente, mas ocorrem deleção clonal, edição de receptor e anergia.
Restrição ao MHC
Através desse processo de seleção positiva é o que seleciona para que o linfócito T não interaja com o antígeno puro, sem MHC. Isso foi descoberto pelo seguinte experimento: pegaram um animal que tinha um determinado tipo de MHC, por exemplo, MHCa e der uma dose de radiação que elimina todos os timócitos, todos linfócitos e todos precursores de origem hematopoiética, ou seja, só fica o epitélio do timo. Transferiu-se então a medula óssea de um camundongo que é F1 (tem MHCa e MHCb, ou seja, é heterozigoto). Essa transferência é feita por via endovenosa e entram no timo e se diferenciam dentro do timo em linfócitos. Espera-se então alguns meses e testam in-vitro com dois tipos de células apresentadoras, uma de MHCa e outra de MHCb. Nesse teste verificam que só reage com as APC que tem MHCa.
Quando as células de medula óssea entram no timo do animal de MHCa, que só tem células epiteliais que tem MHCa, apesar das células precursoras da medula injetada possuir tanto MHC tipo a ou tipo b, os linfócitos só interagirão com o MHC a, pois os linfócitos já foram selecionados positivamente pelas células epiteliais do córtex que possuem MHCa, devido a reatividade de seus receptores TCR com o MHCa, embora os linfócitos tenham em sua membrana MHCa ou MHCb.
A seleção negativa elimina todos linfócitos com alta reatividades. Se um camundongo que tem células epiteliais de MHCa, receber transplante de células de medula que contenham células que tem MHCa e MHCb, ele não produzirá linfócitos que reajam com alta afinidade nem com MHCa nem com MHCb, pois isso resultaria em apoptose já dentro do timo, impedindo que o linfócito saia do timo para atuar no corpo. Desse modo, se realizarmos um transplante de pele, em que a pele é proveniente de um outro camundongo que tem células com MHCb, o camundongo que tem MHCa não rejeitará esse enxerto, pois ocorreu uma seleção negativa de células no timo, em que todos linfócitos reagiriam com alta afinidade com MHCb também foi eliminado, devido as células provenientes do transplante de medula que tem MHCa e MHCb.
Se pegarmos um receptor contra determinado antígeno apresentado por proteína de classe I e isolarmos esse gene rearranjado, pois esse receptor apresenta genes já prontos para cadeia alfa e cadeia beta que deram origem a essa especificidade, e transferirmos esses genes por técnicas de biologia molecular para células precursora bem precoce, embriões de fase bem precoce, de quatro células, produzir-se-á camundongos transgênicos, pois há o fenômeno de exclusão alélica, em que já há gene rearranjado, tanto pra cadeia alfa e beta, inibe-se o rearranjo dos outros alelos, ou seja, não haverá o rearranjo que ocorre normalmente. Por isso produz camundongos que só produzem reação a, por exemplo, albumina de ovo.
Da coleção toda feita do rearranjo dos genes VJ e VDJ, geramos uma coleção enorme (100%). Os linfócitos passarão por uma seleção positiva, em contato com as células epiteliais, e por uma seleção negativa, em que se tem interação principalmente com dendriticas e macrófagos. Após isso, os que sobrarem dessas seleção, os que vão para a periferia são algo em torno de 5%. O nosso repertorio periférico não depende do rearranjo que aconteceu, nem dos genes VDJ, pois as pessoas recebem uma coleção parecida e os rearranjos como soa feitos ao acaso, poderíamos ter repertórios parecidos. Mas como temos apenas 5% do repertorio possível, a diferença de repertório é dependente dos diferentes peptídeos (MHC). Portanto, é o MHC que define o repertorio de linfócitos de cada individuo. Dentre esses 5%, 90% são linfócitos contra (possuem reação forte, gerada por reatividade cruzada) MHC próprio + peptídeo estranho. O linfócito que não interage com nada na periferia, morre em, aproximadamente, três semanas (teste em camundongos).
Os 10% restantes vão ter uma afinidade alta por MHC próprio + peptídeo próprio, provenientes do escape de linfócitos alto reativos. Para minimizar isso, descobriram a existência de uma proteína AIRE, um fator de transcrição, que pode transcrever proteínas que estão no resto do corpo no timo (transcrição promiscua). Encontra-se por exemplo insulina no timo, proteínas que não tem nada a ver com o timo, mas que são produzidas no timo para gerar seleção negativa. Pessoas que não tem AIRE possuem auto-imunidade. Mesmo assim existe um staff de células auto-reativas, em que 5% dos 10% realmente vão causar problemas e os outros 5% são de células reguladoras.
16/05/12
Mecanismos de imunidade celular e Ativação de linfócitos T
As duas grandes subpopulações das células vão ter função diferentes: CD8 (células T citotóxicas)-> lisam (levam a apoptose) células que apresentam peptídeos estranhos (apresentados por MHC I) que o linfócito reconhece. As células CD4 (linfócitos T Helper) se dividem, principalmente, em TH1 e TH2. A TH1 ativa macrófago, que esteja expressando peptídeos por meio do MHC II, fazendo-o digerir melhor tudo que tinha fagocitado. Macrófago em repouso não consegue destruir os microrganismos invasores. Com auxilio da T helper 1, os macrófagos aumentam a quantidade de enzimas e substancias tóxicas aos organismos invasores, facilitando a sua eliminação. O TH2 estimulam os linfócitos B, que expressam peptídeos estranhos por meio do MHC II, que foram reconhecidos pelo seu receptor BCR inicialmente, após fagocitar e apresentar antígenos. A TH2 ativa a célula B, levando-a a se multiplicar e se diferenciar em plasmócito e liberar anticorpos.
Além dessas interações mais importantes do TCR e do BCR com o antígeno, que realmente vão ativar os linfócitos, existem interações mais fracas, ou para dirigir a migração dos linfócitos (estão sempre recirculando, saindo de um órgão linfoide e entrando em outro, saindo do sangue e indo pro tecido onde está acontecendo a resposta). Toda essa migração vai depender de interação entre moléculas. Na própria ativação dos linfócitos por uma célula apresentadora, existe a interação mais forte, a própria apresentação do antígeno, e mais fracas para segurar as duas células juntas, para dar tempo para o TCR reconhecer.
No slide tem-se o linfócito T em repouso, virgem (naive – que não foi ativado), e que vai interagir com as vênulas de endotélio alto para entrar dentro do linfonodo. O linfonodo vai interagir, por meio da L-selectina presente em sua membrana, com açucares (ex. GlyCAM1, CD34), que por vezes estão acoplados a proteínas, presentes na vênula do endotélio alto.
Do mesmo modo, no endotélio da mucosa, tem-se proteínas que possuem açucares acoplados que são reconhecidos pela L-selectina dos linfócitos.
Essas proteínas que fazem esse reconhecimento mais fraco são denominadas de moléculas de adesãoou de endereçamento.
Entre as APC e os linfócitos T também há essas interações mais fracas. Tem-se inúmeras proteínas que podem fazer esse papel, presentes nos linfócitos T: ICAM-3, CD-2, LFA-1. Cada uma delas reconhecem ligantes diferentes. Não importa saber o nome de cada proteína, o importante é saber que cada além da interação principal, há as interações mais fracas.
Essas proteínas pertencem a superfamília das imunoglobulinas. Essa superfamília foi classificada por razão estrutural. Descobriram que vários domínios de outras proteínas do sistema imunológico possuem sequencia de aminoácidos muito semelhantes a das imunoglobulinas. Englobam além da imunoglobulina, o CDR, CD4, CD8, CD2...
Outras proteínas que fazem esse papel, pertencem a família das integrinas, que possuem duas cadeias, alfa e beta.
As células T vão se ligar a uma APC, inicialmente, por interações fracas. Por exemplo quando a LFA-1 do linfócito T se liga a ICAM-1 da APC. Posteriormente o TCR reconhece o peptídeo ligado ao MHC e tem o auxilio da CD4 se for um linfócito T helper, que reconhece uma região constante do MHC de classe II para ajudar na ativação do linfócito.
Esse sinal de reconhecimento do peptídeo pelo TCR é denominado de específico. Existe outro que é denominado de co-estimulador. Do mesmo modo que o linfócito B precisa reconhecer um antígeno através da imunoglobulina de superfície e precisa de um segundo sinal de um linfócito T, o linfócito T reconhece o peptídeo por meio do TCR (e que causa uma alteração via complexo CD3 no interior da célula), e tem o CD4 que ajuda nessa interação, precisa também do sinal 2, que é fornecido pela APC. Esse sinal 2 é realizado pelas proteínas B7.1 (CD80) e B7.2 (CD86), presente na superfície da APC, que interage com a CD28 do linfócito T. Essa segunda interação é essencial para ativação do linfócito T.
Principais funções de proteínas nas membrana:
TCR-> reconhecimento específico do antígeno
CD3, eta, CD4/CD8, CD28-> transdução do sinal
Integrinas e algumas proteínas da superfamília das imunoglobulinas-> adesão
Processo de ativação do Linfócito T
O TCR (que pode ser alfa/beta ou gama/delta) está junto na membrana com as proteínas CD3, pois a cauda interplasmática é muito curta, e a primeira etapa ocorre com a fosforilação da cadeia interplasmática de CD3 (composta por gama, épsilon e delta) e de eta. Essas proteínas possuem sequencias ricas em tirosina que vão ser fosforiladas para começar a ativação, que são denominadas de ITAM (Motivos de ativação ricos em tirosina). Elas vão ser fosforiladas no momento em que o TCR reconhecer algum peptídeo, devido a exposição das regiões ITAMs devido a mudança de conformação.
 Experimentalmente, utilizando anticorpo anti-CD3, pode-se ativar o CD3 sem que o TCR reconheça peptídeo.
Sinalização
Uma das primeiras coisas que precisa acontecer é a migração dos receptores para um polo da membrana (as proteínas transmembranas são todas móveis). E se tem algum peptídeo sendo representado, os TCRs migram para a região da membrana onde isso está ocorrendo para reconhecer esse peptídeo, o que facilita a ação da primeira kinase que vai fosforilar esses receptores, pois ao invés de fosforilar apenas uma cauda, é mais fácil fosforilar várias caudas para reforçar o sinal.
Outra coisa comum é a existência de proteínas adaptadoras. Se tem-se uma proteína kinase que vai fosforilar outra proteína que vai ser ativada, geralmente usa-se uma proteínas adaptadoras que vão se ligar a substratos a ser fosforilados para que proteína kinase consiga agir.
Etapa comum nas ativações é a clivagem de PIP2, pela PLC, dando IP3 e DAG. IP3 vai ocasionar o aumento de cálcio intracelular que é importante para a própria ativação da PKC junto com o DAG.
Há também as proteínas ligadoras de guanina. Proteinas vão perder ou ganhar fosfatos para ficar como intermediarias nessas fosforilações. 
Há ainda as MAP kinases. É uma cascata de proteínas que vão ativando umas as outras. Foram descobertas numa ativação de linfócitos por mitógenos. No inicio achava-se que atuavam apenas na mitose, mas posteriormente descobriu-se que atuam em qualquer ativação de linfócitos. No final da cascata, vai ser ativado algum fator de transcrição que vai do citoplasma para o núcleo que vai interagir com genes que transcrevem proteínas importantes para a função do linfócito: divisão celular, proliferação e secreção de citocinas.
O importante da sinalização é que após tudo são ativados fatores que vao para o núcleo, ativando a transcrição de gens.
Inicio da ativação da cascata pelo TCR -> a partir de uma célula apresentadora, tem-se o TCR reconhecendo o peptídeo e o CD4 ajudando na ativação, pois CD4 vai reconhecer uma parte constante no MHC II e além disso está acoplada a uma proteína kinase a LCK.
Há além disso duas outras proteínas que funcionam logo no incio da ativação: Fyn e a ZAP-70 que é ativada posteriormente. 
Lck e Fyn fosforilam os resíduos de tirosinas nas proteínas de CD3 e as proteínas etas, permitindo a ligação da ZAP-70. Existe outra proteína, a CD45, que é uma fosfatase que retira fosfato de um inibidor que está inibindo a fosforilação pelas Lck e Fyn. A Lck vai ativar a ZAP-70, que por sua vez fosforila outras duas proteínas: LAT e SLP-76. Estas se ligam e ativam a fosfolipaseC (PLC) (proteína de membrana), que vai fazer a clivagem do PIP2 em DAG e IP3. Além disso a Lck ativa as GEF (proteína ligadora de guanina)e outro grupo de kinase, as Tec Kinases. DAG e Ca2+ (resultante da ação do IP3 no RER), ativam a PKC (proteína kinase C), que ativa o primeiro fator de transcrição, o NFkapaB, um fator também presente em linfócito B. O aumento de cálcio também ativa a calcineurina, que por sua vez ativa ativa o NFAT, outro fator de transcrição. As GEF ativa a RAS, a primeira da cascata de MAPkinases, que no final vai ativar a proteína FOS que se junta com outra subunidade, um componente da proteína AP-1, outro fator de transcrição. No final dessas cascatas tem-se três fatores de transcrição: NFkapaB, NFAT e AP-1, que vão para o núcleo e vão ativar a transcrição de diferentes genes importantes para o linfócito T ativado funcionar.
O sinal de CD28, ativado por B7, o segundo sinal de ativação de linfócitos, acontece quando a célula começa a ser ativada. Quando o linfócito já está ativado, ele começa a expressar CTLA-4 (CD152), que se liga nas mesmas proteínas que o CD28, a B7.1 e B7.2, competindo com o CD28. A diferença é que ela envia um sinal de inibição dos linfócitos, funcionando como uma espécie de freio pra ativação de linfócitos. Esse freio é importante pois após a ascenção do numero de linfócitos ativados, é necessário que se pare de aumentar o numero de linfócitos ativos, que quando em grande número tem ação citotóxica, ou também ativam macrófago ou célula B, que poderia resultar em uma inflamação exagerada, resultando em uma patologia (lesão de tecido são, de células não infectadas). Outra coisa que funciona como freio são as proteínas que induzem a apoptose: o conjunto FAS e FAS-ligante começam a ser expressos pelos linfócitos T ativados resultando em uma morte, denominada de fraticida, em que um linfócito mata o outro, pra diminuir os clones que aumentaram muito e que depois precisam voltar ao volume inicial.
As proteínas CTLA-4, ao invés de possuir ITAMs, possui ITIMs, motivos também ricos em tirosina, mas que atuam na inibição da ativação.
Interação de FAS com FAS-ligante: a célula que apresenta FAS e interage com FAS-L, resulta em uma cascata de ativção proteicas dentro da células que possui domínios de morte, que ativa sequencias de Caspases que vão gerar desintegração do núcleo e levando a apoptose da célula.
Se tivermos o sinal co-estimulatório sozinho, não gera nenhum efeito. O linfócito T expressando CD28 e a APC com que se liga por interações fracas por meio de B7, e com o TCR não reconhecendo nada na APC, há o desligamento da célula e não há ativação do linfócito. Mas se tivermos o TCR do linfócito T ligado ao peptídeo apresentado pelo MHC da célula de tecido, que não expressa sinalco-estimulatório (B7.1 ou B7.2), ocorre uma inativação do linfócito T, ou seja, ele fica defeituoso, fica anérgico, mesmo que posteriormente interaja com um APC.
Diferenças entre as APC
Células dentriticas podem fazer fagocitose, pinocitose, podem também apresentar peptídeos virais. Possui baixa expressão de MHC, mas é mais alta quando presentes nos tecidos linfoides, pois uma das consequências de linfócitos T ativados é ativas células dendriticas, que passam a expressar mais MHC. Constitutivamente apresentam pouco sinal co-estimularório, apresenta pouco B7, mas as células dendriticas profissionais apresentam bastantes, sendo capaz de ativar linfócito T. São localizadas no corpo inteiro.
Os macrófagos fazem fagocitose. O MHC pode estar ausente, ou pode ser induzido por citocinas ou por bactérias, ou seja, aumenta muito durante uma infecção, principalmente por ação das proteínas da resposta inata, ou pelo próprio reconhecimento de microorganismos. O sinal co-estimulatorio também é induzido. Localiza-se em tecido linfoide, em tecido conjuntivo e cavidades do corpo.
Os linfócitos B reconhecem proteínas pela imunoglobulina de superfície, possui MHC constitutivo que aumenta com a estimulação. O sinal co-estimulatório também aumentam com linfócito ativado. Localizam-se no sangue ou no tecido linfoide.
Proteinas presentes na superfície de células dendriticas: MHCI e II, ICAM-1, LFA-1 -> matura. Ativada-> aumenta MHC, passa expressar B7 e aumenta a quantidade de moléculas de adesão.
Para a ativação de linfócito CD8, é necessário a atuação anterior do linfócito T CD4 (helper). O linfócito CD4, quando interagem com a APC, através do TCR reconhecendo MHC, essa célula já tem um pouco de B7, molécula co-estimulatoria, que consegue dar um sinal para CD4, a qual por sua vez ativa a célula apresentadora, que começa a expressar outras coisas além das quais já expressavam. Passa a expressar CD40 que interage com o CD40L do linfócito CD8, vai aumentar a expressão de B7, vai expressar 4-IBBL. Ou seja, antes da interação com o CD4, o APC não possuía proteínas o suficiente para dar o segundo sinal para CD8.
Quando uma célula dendritica é infectada por vírus, o próprio reconhecimento da partícula viral, os PAMPs, ativam a APC e levam a aumentar o sinal co-estimulatório (B7). Com isso, o linfócito CD8 tem os dois sinais. Após ser ativado, o linfócito CD8 expõe na membrana proteína para IL-2, além de secretar IL-2. A IL-2 ativa a mitose e a diferenciação.
Na função citotóxica do CD8, há três fases. Reconhecimento (sinal 1 (TCR-peptideo) e sinal 2 (CD21-B7)), Proliferação/Diferenciação para função citotóxica (após ação de IL-2). Depois de diferenciado denomina-se Linfócito T citotóxico em que interage com qualquer célula de tecido, sem necessitar de sinal 1 ou 2. Só precisa reconhecer o mesmo peptídeo que o ativou no inicio.
Linfócito T virgem, estimulado por uma dendritica (recebe 2 sinais), prolifera e diferencia e ganha função citotóxica e pode interagir seguidamente com várias células, matando-as. Se ele interagiu primeiramente com uma célula do tecido, e não recebeu o segundo sinal de B7, mesmo que ele interaja posteriormente com uma dendritica, ele se torna anérgico.
As proteínas de adesão (ICAM-1, LFA-1...) são também importantes no momento da lise, pois são elas que vão segurar o linfócito na célula alvo. Após o linfócito se ligar com a célula por meio das moléculas de adesão, só vai ocorrer a lise se houver reconhecimento de sinal especifico. Caso não ocorra, ele se desliga.
Essa especificidade é conferida pois a morte ocorre no polo de interação entre as células. O que o linfócito T faz é extravasar grânulos citotóxicos na região de interação, na região que o linfócito T está reconhecendo. Por isso as células vizinhas são salvas.
Os três grupos pricipais de proteínas envolvidas na lise: Perforina -> forma uma proteína grande, que polimerizada, muito parecida com a ultima proteína do complemento (MAC), que faz poro na membrana. Granzimas-> possuem a atividade de protease e além disso ativa a apoptose; Granulolisinas -> também ativam a apoptose da célula alvo.
Ativação de CD4
As proteínas mudam de expressão quando o linfócito está em repouso e quando está ativado. Algumas proteínas não mudam, como CD4 e TCR. Mas L-selectina, uma das moléculas de adesão, importante para a migração de linfócito, muda. O linfócito virgem precisa que fique migrando o tempo todo para reconhecer peptídeos pelo corpo inteiro, para localizar um sítio de infecção. Quando ativado o ideal é que ele fique no sítio da infecção, portanto ele perde L-selectina, que é o que faria ele migrar o tempo todo.
VLA-4, por exemplo, aumenta a quantidade, pois aumenta a interação com as APCs.CD44 é tipicamente uma proteína de memória.
Um linfócito CD4 virgem, não comprometido, ele de inicio só prolifera. Ele possui uma proliferação basal antes de reconhecer o antígeno, e se multiplica por meio de sinais fracos de reconhecimento de peptídeos próprios. Existe também uma fase logo após o reconhecimento do antígeno, denominada de TH0, em que ele não definiu o perfil que vai seguir: Th1 ou Th2. Depois da fase de ativação, em que há interação com o antígeno, é que o linfócito definirá se é Th1 ou Th2. Th1 ativa macrófago, é capaz de induzir algumas subclasses de imunoglobulinas no linfócito B. Th2 é o principal ativador dos linfócitos B e tem alguns efeitos em macrófagos.
Como o linfócito vai escolher se vai ser Th1 ou Th2: Na primeira interação do linfócito T naive com uma dentritica, em que a APC possui receptores PRR, Toll, TLR, etc para PAMPs e patógenos, que ao interagir com o patógeno leva a um aumento de MHC e leva a apresentar o peptídeo e o sinal co-estimulatório (CD80/CD86 também denominado B7.1/B7.2). Outro efeito do reconhecimento do patógeno é a secreção de citocinas, como a IL-2. A IL-2 faz com que a célula naive, TH0, se torne TH1. Se secretar IL-4, vai levar o linfócito Th0 se tornar Th2. O que leva a secretar mais IL-2 ou mais IL-4 vai depender de qual patógeno foi reconhecido, pois cada patógeno é reconhecido por um tipo de TLR. Cada vai de TLR tem como consequência a expressão de uns genes para uma citocina.
O receptor TLR gera também uma cascata de sinais interna, que geram fatores de transcrição que vão para o núcleo.
O linfócito Th1 vai interagir com o macrófago e ativa-lo. Há interação de CD40 com CD40-L (este presente no linfócito), bem como em CD8, e secreção de IFN-gama que é a principal citocina que vai ativar macrófago. O macrófago, portanto, vai expressar receptor para INF-gama e para TNF, uma outra citocina que o linfócito T vai secretar.
Papéis do Th1 ativado: Secreta IFN-gama e expressa CD40-Ligante para ativar macrófago, para que ele consiga destruir microorganismos fagocitados; Expressa FAS ligante ou secreta TNF-beta, se a célula apresentar receptor FAS, há uma morte por ação citotóxica. O CD4 possui, portanto, também um papel citotóxico, igual ao CD8, pois também pode expressar FAS-ligante; Secreta IL-2 que além de ser importante para a divisão celular de CD8, é importante também para a divisão celular de Th1; Secreta IL-3 e GM-CSF que são fatores que vão agir a distancia, além de agir no próprio local. Fazem com que haja maior diferenciação de leucócitos na medula óssea. IL-3 também é também denominada Multi-CSF. GM= G-> granulócitos, M-> monócitos. CSF: fator estimulador de colônia; TNF-alfa e TNF-beta vão ser importantes para a diapedese, pois atuam aumentando a permeabilidade do endotélio, facilitando a passagem de leucócitos; CCL2 tem efeito quimiotático, atrai leucócitos para o local da infecção.
O macrófago ativado expressa além de MHC, B7, dos receptores de citocinas, há o aumento de NO e compostos ricos em oxigênio que tem efeitos tóxicos para microorganismos fagocitados.
A M. tuberculosis é um exemplo de microorganismo que o macrófago não consegue se livrar sem ser ativado pelo linfócito CD4 Th1. Se o macrófago não está ativado, ela continua se multiplicando dentro do macrófago, virando uma fonte de bactérias. Comessa ativação, por meio do efeito quimiotático e aumento da permeabilidade do endotélio, há o acumulo de macrófagos na região da infecção, resultando em um granuloma. Alguns macrófagos se unem e forma a célula gigante de corpo estranho, alguns se alongam e se tornam as células denominadas epiteliódes, e em volta desses macrófagos se acumulam linfócitos T, que vão aumentando de numero por conta da IL-2 que é secretada. O acumulo de células forma um “paredão”, diminuindo o afluxo de nutrientes e oxigênios, dificultando a sobrevivência das bactérias. Além disso conseguem digerir de forma eficaz as bactérias. Esse granuloma, no entanto, caso torne-se crônico, é danoso. Os fatores TNF (ação toxica e indução de FAS ligante), IFN, todos esses fatores, mesmo os que os macrófagos produzem, podem extravasar e lesionar células não infectadas. Um individuo tuberculoso começa a ter buracos no pulmão, não por conta da bactéria, mas por resposta excessiva de Th1, quando não tratado com antibióticos. Aqui cabe também ressaltar a importância do freio devido as respostas inibitórias. A resposta exagerada devido a falta de um efeito inibitório, ou então devido a falha na eliminação da infecção, resulta em hipersensibilidade. No caso do excesso de ativação de Th1, ela é chamada de hipersensibilidade retardada, pois só ocorre depois de três dias (72hras),e é exatamente o granuloma. Lepra, leishmaniose e toxoplasmose são outras doenças que também resultam normalmente em granuloma e, portanto, necessitam de Th1, pois são infecções crônicas em que os microorganismos multiplicam dentro da célula.
Resumo: Antigeno é processado pelo macrófago e estimulam Th1 a secretar três grupos de proteínas: quimiocinas, que vão atrair mais leucócitos, citocinas (IL-2, IFN-gama, TNF) que vão ativar o macrófago, e citotoxinas como TNF que tem efeito tóxico, as vezes direto, nas células infectadas, além das que agem na medula para proliferar leucócitos.
Linfócito CD4 TH2
Como ocorre a ativação por Th2:
Existem antígenos timo-dependentes e timo-independentes. Os timo-independentes não precisam de uma célula T Helper, pois são geralmente açucares que conseguem ativar todos os receptores.
Quando ativados por antígenos T dependentes, as células B precisam do auxilio da T Helper. O primeiro sinal é interação com o antígeno e o segundo é proveniente das citocinas liberadas de Thelper. Para libera-las o Th2 precisa interagir com o antígeno apresentado pela célula B, e também da interação com CD40, por meio da CD40-L.
Essa ativação ocorre em três etapas: Na etapa do reconhecimento TH2 reconhece antígeno e precisa de sinais co-estimulatórios pela CD-40, CD-40L (CD154). Com isso Th2 começa a secretar uma série de citocinas. A IL-4 é importante para a própria proliferação da Th2. E posteriormente a esse processo, há proliferação das células B, resultante da IL-4, IL-5 e IL-6. Então as células B vão diferenciar em plasmócito e secretar imunoglobulinas e outras diferenciam em célula de memória, que vão ficar pronta para a resposta secundária.
O que o linfócito B reconhece não precisa ser exatamente o que o Linfócito T reconhece. Quando o linfócito B pode reconhecer um antígeno do jeito que ele está, completo, por exemplo, em um vírus o linfócito B reconhece o capsídeo externo do vírus. Quando o vírus juntamente com o BCR for internalizado no lisossomo, tudo vai ser fragmentado e vai para a membrana com MHC II, pode ser que vá uma parte do capsídeo externo ou então uma parte interna do vírus. Não importa se for uma proteína interna ou externa que vai ser reconhecido pelo linfócito T, ele secretará citocinas que vão ativar o linfócito B a produzir imunoglobulinas contra a especificidade da célula B, que é contra o capsídeo externo.
Quando se reconhece uma bactéria que tem açúcar, o que será exposto para o linfócito T será proteína, pois o Linfócito B não reconhece açúcar. 
Cada citocina vai induzir uma classe de imunoglobulina secretada. IFN-gama é produzida por Th1 que está presente ao redor do linfócito B.
Resumo das principais ações do anticorpo:
Neutralização, opsonização e ativação de complemento, dependendo da classe de imunoglobulina que foi mais secretada.
Do mesmo modo que a CD4 só vai lisar a célula em que houve reconhecimento, a interação de T com B também é específico. Vai haver um pólo de interação, onde as moléculas (TCR com peptídeo, CD40 com CD40-L) todas estão agindo. As citocinas secretadas pelo linfócito Th2 só vão agir no linfócito B especifico.
Resumão:
CD8 vai gerar Linfócito T citotóxico, que vai ser capaz de eliminar células infectadas por vírus ou outros microorganismos, lisar células tumorais e células de transplantes. CD4 Th1 vai ativar macrófago e Th2 ativa B.
Citocinas ativam receptores Janus kinases (JAKs), da via Jak-stat, que no final da cascata ativa a transcrição de certos genes.
Aula prática – Medida de ativação de Linfócito T
Citocinas 
Sangue -> centrifuga (Formar-se-á plasma e um preciptado de células)
Coloca-se as células em cultura -> meio com pH ideal (tampão), 37 graus celsius, estéril. (Coloca-se APC, antígenos em contato com o linfócito T) -> após algum tempo centrifuga-se novamente -> formar-se-á um preciptado de células e um meio sobrenadante
26/09/12
Revisão
Reconhecimento de antígenos por linfócitos T
A proteína de reconhecimento é de membrana. O TCR não reconhece diretamente o peptídeo precisando ser apresentado pelo MHC. Esse MHC possui algumas fendas que reconhecem o peptídeo após ser clivado dentro da célula.
O TCR alfa beta é o mais comum. A variação do TCR não é homogenia. Há três picos de grande variabilidade. Essa cadeia qunado enrolada tem as três regiões de hipervariabilidade aproximadas.
DM-> gene da Proteina de transporte que primeiro interage com o peptídeo para depois levar para o DP, DQ e DR.
LMP/TAP: Genes de proteínas que clivam as proteínas (complexo de lisossomo) em peptídeos.
Class III: enzimas de complemento, etc. Nada a ver com a apresentação.Class I: peptídeos de parasitas intracelulares Class II: peptídeos digeridos em vesículas lisossomos.
Para a seleção positiva há interação com as células epiteliais do córtex. Para a negativa há a interação com células de origem hematopoiética.
A cadeia alfa tem capacidade de reedição.
Todas as células apresentam todo o conjunto de MHC: A,B,C -> (MHCI). E as APCs apresentam também DP, DQ, DR.
Gama/delta-> intestino, fígado. Não sofreram seleção. Pode ocorrer mais facilmente autoreação.
03/10/12
Tolerância central e periférica
Memória imunológica
Regulação do Sistema Imunológico- Como se regula a resposta primária e secundária
Existe uma regulação muito rigorosa quanto ao número de células no compartimento linfopoiético. Depois que os linfócitos saíram do timo, existe um número ideal que é representado pela caneca cheia: o número ideal de linfócitos na periferia. Esse número é mantido por uma competição: tem linfócitos vindo o tempo inteiro do timo e tem linfócitos que estão se dividindo. Geralmente se aceita que essa competição é dada principalmente pelas interações fracas do MHC-peptídeo apresentadas nos tecídos periféricos. Os linfócitos que interagirem bem os tecidos próprios mas não bem a ponto de desencadear uma resposta imunológica, uma resposta efetora, mas o suficiente para inibir a apoptose. Linfócitos vão morrendo e são respostos pelos que vão chegando ou são resultantes da divisão celular.
Em determinadas situações teremos a caneca transbordando, como em situações em há resposta imunológicas, a patógenos, por exemplo, em que se tem a ativação excessiva de alguns clones de alguns linfócitos daquele que atuam contra aquele patógeno e por conta disso tem que se ter um número maior de morte celular para se voltar a o número normal. Se por alguma razão, como em uma infecção que se dá uma linfopenia, ou em situações clinicias devido a radiação, vai haver um aumento do número de divisão celular para recuperar o número normal. Ou seja, todo o processo é muito bem regulado, e esse processo é chamado de Correção Homeostática. A proliferaçãona periferia é denominada de proliferação homeostática.
Quando temos uma infecção e temos um número de células específicas para o patógeno, esse número vai aumentar nos primeiros dias através da expansão clonal e vai chegar a um patamar em que vai ocorrer uma resposta efetora. Esse número tende a diminuir novamente, pois se não correria o risco de gerar uma patologia: hipersensibilidade, destruição do tecido do hospedeiro, etc.
Após essa retração, ainda sobra-se um número específico de células em resposta a aquele patígeno que é maior que o inicial, de quando ainda a célula era um clone virgem ainda. Essas células que sobram são denominadas células de memória, que estarão prontas para o segundo estímulo. Após a retração, as células que sobraram normalmente migram para a medula óssea. Tratando-se da célula B, continua a se produzir anticorpos.
Num segundo contato com o estímulo, ocorrerá uma nova expansão dos linfócitos B e a formação de novos plasmócitos que secretam ainticorpos. A diferença é que ocorrerá em menor tempo, pois já se parte de um número maior de linfócitos, denominados de linfócitos de memória.
A segunda resposta é mais rápida, vai secretar um numero de anticorpo maior e ela vai compreender outras classes de imunoglobulinas, além de IgM. A afinidade do anticorpo é maior, devido ao fenomeno de hipermutação (proliferação e escolha dos receptores de maior afinidade). A dose de estímulo para gerar a segunda resposta é menor do que na primeira resposta. Mas novamente vai ocorrer a retração e sobrará ainda mais células de memória do que no final da primeira resposta.
A mesma resposta acontece para os linfócitos T: há uma fase de expansão e há a fase de retração em que há a apoptose de células que foram ativadas. A maioria delas vão morrer e vai sobreviver um grupinho que é chamado de células T de memória.
A medida de memória por T é dificil, pois a memória por B, como há a secreção de anticorpo dá pra se ter um melhor medida apenas com a contagem e a identificação dos anticorpos secretados, podendo-se definir ainda se é resposta primária ou secundária. Necessita-se portanto de certos marcadores específicos: proteínas expostas na membrana que caracterizam linfócitos que já foram ativados.
O transplante de pele foi a primeira ocasião em que se detectaram a memória por linfócito T. Se pegarmos um camundongo e enxertamos nele a pele de outro camundongo, genéticamente diferente, ele vai rejeitar essa pele, por mais que demore muito.
Se pegarmos esse camundongo que já rejeitou a pele uma vez e aplicamos o enxerto do mesmo doador, essa segunda rejeição ocorrerá muito mais rápido. Se em vez de dermos dois enxertos e dermos um enxerto, mas antes disso esse camundongo receptor recebeu celulas do camundongo que já havia rejeitado, essa rejeição ocorrerá em menos dias. Ou seja, essa memória é transferivel.
Além de ocorrer numa segunda resposta uma diferença quantitativa da segunda, vai ocorrer uma diferença qualitativa. Pesquisadores começaram a medir as proteínas que são expressas nas células virgens, nas de memórias e as citocinas que são secretadas. No slide há o exemplo da medida de IL-2 e a CD62L (L-selectina, proteina importante para a migração). Vemos que há uma resposta inicial de memória, mas que há uma diferença entre a memória precoce e a memoria tardia: de inicio essa memória precoce, logo que aconteceu o segundo estimulo, a tendendencia é, por exemplo, para de expressar L-selectina, pois é uma proteina utilizada na migração e não interessa muito isso no momento, pois se quer deter o linfócito no sitio onde se deve ter a resposta efetora. Numa memória tardia, ele irá recuperar a expressão dessa L-selectina.
As células de memória são denominadas L-selectina low, pois tem pouca e as virgens de L-selectina high, porque tem muita. Por outro lado as de memória passam a expressar mais CD44, CD25 (pelo menos no inicio da resposta, que é o recpetor de IL-2). enfim, tem-se varias proteinas que vão diminuir mas tem varias que vao aumentar a expressão. Detectaremos o numero de celulas de memoria e virgens por essas células de superfície.
Depois que acabou a infecção pelo patógeno, se quer que a célula volte a circular, por isso as celulas de memoria passar a expressar novamente L-selectina.
Não se tem apenas um tipo de célula de memória. O pesquisador que detectou isso passou a chama-las de memória central e memória efetora (periférica).
Ele caracterizou o seguinte: depois que se teve uma resposta de memória, no linfonodo, se fosse medir as proteinas que estavam sendo medidas, tinha-se muito IL-2 produzida e pouco interferon e pouco TNF. Enquanto que no tecido terciário (porta de entrada da infecção), ele viu que tinham linfócitos de memória que ficavam retidos na porta de entrada e que o padrão de secreção era diferente: faziam pouco IL-2, pouco INFgama e muito TNF. Caracteriza-se portanto uma celula efetora muito mais eficiente pois IFN e TNF são as proteinas que vão ativar macrófagos, pra recrutar outras células. É uma das citocina que vão fazer aquele linfocito causar uma resposta, para acabar com o patógeno. É importante que os mais armados para causar a resposta fiquem no sitio de entrada da infecção, pois em uma situação que ocorre novamente a contaminação, provavelmente ocorrerá no mesmo lugar. Enquanto os que vao ficar longe, apenas no linfonodo drenante, atuam como uma reserva e migram para o sitio de infecção. Então aqui é importante que o linfócito produza muito IL-2 para proliferar muito e fazer muitos clones de reserva. Não se conhece bem o mecanismo de diferenciação entre as celulas efetoras e centrais.
Depois dessa detecção das diferenças qualitativas, pesquisadores começaram a estudar essas secreções de citocinas não mais a nível de população. Antes pegavam celulas do linfonodos e da porta de entrada e mediam as secreções. A partir da evolução da biologia celular e molecular, passaram a medir as secreções de cada tipo de celula. Passaram, portanto, a ver que existiam diferentes tipos de linfócitos com quantidades e tipos de secreções diferentes, passando a denomina-los de triplo produtores (IL-2, IFN gama e TNF), duplo produtores e simples produtores. Para diferentes tipos de infecções há uma distribuição especifica de simples, duplo e triplo produtores.
Isso é importante em termos de eficiencia: Em uma ação citotóxica em que o linfócito T só secreta perforina e não secretar IL-2 e granzimas ele não consegue levar a lise das celulas. Quando se caracteriza isso a nivel de população pode-se achar um titulo alto de todas as citocinas, mas na verdade, naquela resposta, tem-se pouca celulas realmente citotóxica. Pois aquelas triplo produtores, aquelas que realmente desencadiariam a lise, são uma minoria na população.
A produção varia ao longo da infecção conforme tem-se a carga anti-genica e a duração da carga anti-genica. Infecções agudas em que as cargas anti-genicas são baixas, em que nao cronificam, a duração é baixa, a tendencia é ter muitos linfocitos fazendo quatro e cinco coisas e poucos que são simples produtores. Em doenças como CMV e HIV que duram muito tempo, em que a carga antigenica fica muito tempo no individuo, ocorre uma resposta especializada para produzir uma resposta mais adequada a aquele patógeno.
Tolerancia
Começaram a estudar muito tempo atrás que o linfócito dura muito tempo. A primeira descrição de memória foi uma epidemia de influenza e que teve uma nova epidemia 65 anos depois. Essa epidemia ocorreu em uma população isolada em que não se tinha muita imigração de população. Os individuos idosos com mais de 65 anos se salvaram dessa segunda epidemia.
A partir de estudos de biologia celular viram, no entanto, que não há linfócitos que duram tanto tempo. Começaram a pensar então nos clones dos linfócitos, que mativeram-se proliferando-se a partir do estimulo.
Mas o que é que mantém a proliferação para durar tanto tempo?
Começaram a fazer tranferencias: pegavam celulas de um animal que imunizaram para determinado antígeno, pegavam os linfócitos e colocavam emoutro camundongo e deixavam varios anos. Injetavam o mesmo antigeno e viam que resultava em uma resposta secundaria. Ou seja, se esses linfocitos ficassem nesse outro camundongo sem contato com o antigeno ia mostrar que o antigeno é desnecessario, que iam manter mesmo sem o antigeno. Devido a incapacidade de se provar que no transplante de linfocitos nao se foi antigeno junto.
Passaram a utilizar camundongos MHC knockout, ou seja, sem gene de MHC que já existe em camundongo adulto, pra ver se mesmo assim se mantinha resposta. O que aconteceu é que a resposta secundária por CD8 ela se mantinha normalmente, ou seja, nao precisava do antigeno. Para CD4, isso aconteceu mais ou menos, pois a resposta acontecia com caracteristicas de secundaria mas a qualidade da resposta nao era tao boa como quando se utilizava resposta de hospedeiro selvagem. Ou seja, o antigeno presente ajuda a ter uma qualidade de resposta melhor.Essa informação é muito antiga.
A partir de entaão começaram a pesquisar para ver o que mantinha essa resposta tanto tempo. Começaram a estudar citocinas. No caso de células virgens, a IL-7 mantém a homeostase populacional. Para as celulas de memómia, descobriram que tem outra citocina, a IL-15. No caso de CD4, as duas são importantes. Isso resolve de certo modo o problema: teve-se a primeira proliferação e as celulas passam a expor receptores para IL-15 e existem outras celulas do corpo produzindo IL-15, como macrófagos e celulas dendrítricas, que mantém o a proliferação das celulas que expos receptor para IL-15.
Não se resolveu ainda o lado qualitativo: memória para tétano dura 10 anos, memória para outras infecções dura 1 ou 2, para influenza durou 65 anos. Então se a questão se baseia na IL-15, por que que para um dura mais e para outro menos? Começaram a fazer varias imunizações para camundongos com antigenos 1,2,3,4... para ver quanto cada imunização atrapalha a memória anterior, no sentido de que tem que haver uma competição, pois tem que se pensar que para se produzir memoria para algumas novas doenças tem -se que esquecer de outras. Viram portanto, que a medida que se vai produzindo memória para certas doenças, vai se atrapalhando a memória de outras.
Quando se pensa no idoso, isso fica mais complexo ainda. Pois ele já teve uma quantidade enorme de estímulos, tem menos saida de linfócitos do timo, pois este involue antes da puberdade. O idoso vai ficar com repertorio cheio de clones contra estimulos que foi tendo ao longo da vida, e vai ficar com menor diversidade, pois sai menos celula do timo. Além disso o timo já tem muito clone grande que foi ativado frequentemente ao longo da vida. O idoso mantém a "caneca cheia" a partir da proliferação dos lifócitos que já estão no corpo e não com os que são fabricados e saem do timo por rearranjo vj, vdj...
Porque respondemos a estímulos externos e não a próprios?
Começaram a injetar celulas geneticamente diferentes em neonatos para simular a tolerancia ao próprio. Viram que em camundongos, se se transfere proteinas alogenicas (geneticamente diferentes) o ca mundongo nao rejeita essas celulas. Esse camundongo até o fim na vida não rejeitara essas celulas (camundongo quimera, mistura de celulas geneticamente direfentes). Se fizermos o enxerto de pele do mesmo doador dois anos depois, o receptor estará tolerante a esse enxerto. Isso só ocorre apenas nesse primeiro dia, enquanto se tem a janela de tolerancia. Nos humanos isso tem que ser feito no periodo embrionario ainda, pois a formação do sistema é mais precoce.
O que todo mundo aceitou inicialmente, como explicação de tolerancia, foi a tolerancia central. Isso foi visto na aula de hematopoiese, em que quando há muita afinidade por peptidieos proprios, há seleção negativa dos linfócitos no timo.
Essa deleção clonal, deleção intratímica, depois foi reportada quando descobriram o fator de transcrição denominado AIRE (Regulador Auto-imune). Proteínas do pancreas, do figado, sao transcritas por celulas epiteliais do timo e isso ajuda a diminuir o escape da seleção negativa. Nem todos os linfocitos T serao eliminados, pois nem todas as proteinas de outros locais estão no timo. O AIRE diminui a ação desses linfócitos que não são eliminados contra antigenos próprios.
Mas mesmo assim, o AIRE não consegue dar conta de tudo. Evidencias para esse escape foram captadas quando começaram a imunizar contra antigenos proprios juntos com adjuvantes. Pegavam camundongos que já tem as proteinas proprias e pega uma proteina da mielina e injeta junto com adjuvantes (substancia que melhora a imunização), o camundongo vai desenvolver uma encefalomielite, por conta da reação a essa proteina da mielina.
Isso também ocorre se houver um tratamento de células para que elas passem a expressam normalmente CD80/CD86 (B7.1/B7.2), resultando em autoimunidade.
MECANISMO PERIFÉRICO
O Primeiro proposto foi o da anergia: Ausencia de B7.1/B7.2
O que vai fazer a celula ter os dois sinais podem ser duas coisas: ou infecção (janeway) -> o nosso organismo não reconhece o que é próprio e o que não é próprio. Reconhece a infecção. Tudo que tiver PAMP vai ser reconhecido por receptores da inata e vão fazer uma ativação das células dendríticas que no tecido periferio não tem B7s, no tecido linfoide , após ativadas, passam a expressa-las. Foi criticada pois não respondemos apenas a infecção, conseguimos responder por exemplo a enxerto de pele, tranfusão sanguínea. ou Inflamação (Danger - Teoria do perigo)-> não precisa de ser patógeno. Aqueles mesmos TLRs que reconhecem coisas do patógenos, reconhecem também sinais de inflamação. Em um corte cirurgico, por exemplo, ocasiona-se ainflamação sem infecção. Celulas dendriticas que entram em contato com celulas de apoptose, não ativam linfocitos T, e as que entram em contato com celulas necrosada, ativam linfocito T.
A segunda proposta é a da Ignorancia: Sitios privilegiados imunologicamente (cerebro, camara do olho, testículo, utero) não tem acesso do sistema imunológico e estão protegidos e tolerantes por conta disso.
O mecanismo mais aceito atualmente são as células T reguladoras (Tregs): TregCD8, Breg, TR1 (TH3 - secreta IL-10). Existem varios trabalhos saindo, mostrando outro fenotipos de Treg. A grande maioria é a Treg clássica.
Foi descoberta pela timectomia de 3 dias: No terceiro dia extrai-se o timo e o camundongo desenvolve doença autoimune quando adulto. Se tirar antes de tres dias, o camundongo torna-se imunodeficiente, pois nao responde a nada. No quarto dia não desenvolve autoimunidade. A janela para a autoimunidade seria, portanto, no terceiro dia. Concluiu-se: devem haver celulas saindo a partir do terceiro dia que impede a autoimunidade.
Para comprovar isso Sakaguchi começo a fazer transplantes de linfócitos para camundongos vazios, imunodeficientes, que não possuem timo, por exemplo. Se fazer transplante de toda a população ele vai ficar saudavel para o resto da vida. Mas se em vez disso , se transferir só uma parte das celulas, haverá desencadeamento de autoimunidade. Viram desse modo, que tinha uma população capaz de proteger o organismo da autoimunidade. Passsaram a caracterizar as Treg por meio de marcadores como: CD25, CDLA-4, GITR, CD5, Foxp3. CD25 é parte de uma cadeia de receptor de IL-2 expresso por celulas ativadas, CDLA-4 é expressa no final da ativação de linfócitos T. Em um individuo que não possui qualquer infecção, detecta-se as Treg por esses marcadores, pois caso contrario, todas as ativadas seriam encontradas. O Foxp3 é uma fator de transcrição interno, que melhorou a detecção dessas celulas. Tem um papel importante na propria função da Treg, pois é ele que será utilizado para transcrever os genes da Treg.
Existem Treg naturais e induzidas. As Treg naturais já saem do timo com perfil de Treg, expressando todos os marcadores e secretando citocinas importantes para as funções delas. As Treg induzidas: se colocar linfocitos em cultura, com antigenos apresentados, e fornecer determinadas citocinas como TGFbeta, IL-4, conseguia-se gerar Treg a partir de umapopulação sem Treg. Dependendo da forma que o linfocito entrar em contato com o antigeno, ele vai virar um Treg.
Na formação das celulas no timo, o grau de afinidade intermediario entre a formação de celulas T normais e deleção gera as Treg naturais, que saem expressando Foxp3 e secretando TGF-beta. Das T convencionais, dependendo das condições pode-se gerar Treg, como na presença de Acido retinoico e TGFbeta. Mas caso haja IL-6 ao inves de Acido retinoico, gera-se uma celula altamente inflamatória como a TH17 que expressam outro fator de transcrição RORgamaT.
A geração dentro do timo de Treg, necessita de uma afinidade alta pelo peptideo que está sendo mostrado do timo, além disso precisa-se um segundo sinal CD80 interagir com CD26, precisa de IL2 que é reconhecido pela cadeia alfa do receptor de IL-2 (CD25), que é somente expresso em celulas ativadas, sendo que a beta e gama é constitutiva de todas as celulas. A Treg necessita de IL-2 para continuar sobrevivendo e tendo seu papel de regulação. 
A IL2 é produzida por CD4 e CD8 e por outro lado ela vai estar inibindo-as. Tecidos associados a mucosa são profissionais a gerar Treg, pois contém, por exemplo, uma dendritica profissional que secreta TGFbeta e é capaz de produzir ácido retinoico, tendo condições especiais de gerar Treg.
Treg natural x T reg induzida
Gerada no timo Tecido ligados a mucosa, baço, linfonodo...
Estimulo de: CD28 CTLA4
Citocinas necessarias: TGF-beta, IL2 ou IL5 TGF-beta e IL2
Especificidade: Próprio Igual a das convencionais: alergeno, bacterias da mucosa, antigenos de tumor, patogeno
Inicialmente achava-se que a Treg atuava apenas para evitar a autoimunidade, mas descobriu-se posteriormente que elas atuam como um freio para qualquer resposta. Isso foi descoberto pelo proprio grupo do Sakaguchi pois ele tentou melhorar a resposta a um tumor eliminando as celulas Treg. Ele pegou um camungongo e tratou com anticorpo CD25 durante duas semanas. Como o camundongo era saudavel, não há outras celulas expressando CD25. Eliminou, portanto as celulas expressando CD25 e injetou no tumor que normalmente matava essa linhagem de camundongo. O camundongo se salvou pois desenvolveu uma resposta tumoral.
Há muitas resposta a tumor que não fazemos resposta por excesso de Treg. Se retiramos as Tregs, melhoraremos a resposta a tumor.
Com essa descoberta, começou-se a estudar Tregs para todas as infecções.
Mecanismos de supressão
Citocinas com efeito supressor: Foxp3+ secreta IL10, TGFbeta, IL35 que vao atuar na celula, parando o ciclo celular, impedindo que ela prolifere.
Consumo de IL2: Como a Treg tem uma cadeia alfa já expressas, ela já é uma celula altamente eficiente em captar IL2 presente no meio. Ela vai consumir grande quantidade de IL-2 não sobrando pra outras células, acabando por gerar apoptose.
Efeito Citotóxico da própria Treg: Ela libera granzimas que pode levar a lise de celulas efetoras.
Outras proteinas capazes de parar o ciclo celular: galectina 1 secretada ou na superficie da Treg que pode interagir com outras proteinas efetoras e leva a supressão.
Tem que se haver um balanço entre a quantidade de Treg e de células convencionais. Se houver um excesso de Treg, não há resposta nenhuma. Não há autoimunidade, mas não se consegue ativar nenhum linfócito. Se houver uma falta de Treg, vai haver doença autoimune. Existe um equilibrio que também é homeostático, que é devido ao fato da Treg necessitar de IL2 secretadas pelas efetoras. Se aumanta muito a quantidade de efetoras numa resposta, elas secretam muito IL2. Com muito IL-2 vai se aumentar a população de Treg. Aumentando a população de Treg, suprimisse as efetoras, ai elas voltam ao tamanho normal. Esse mecanismo é chamado de indexação: a Treg é indexada a efetoras por causa do consumo da IL2. Se houver pouca IL2, diminui-se também o numero de Treg. Se há pouca Treg, as efetoras ficam soltas e produzem mais IL2, recuperando a população de Treg.
Quando tudo isso falha, tem-se as doenças autoimunes. Elas são classificadas em dois tipos: orgão-específicas (Diabetes, Hashimoto, tiroidiase, etc vão acometer algum tecido ou orgão) ou sistemicas.
Algumas são mediadas por autoanticorpos contra receptores da superfície (receptor para hormonio, para acetilcolina...). As consequencias é que vai se impedir a ação do hormonio porque o anticorpo vai estar ocupando o espaço no receptor.
 Tem-se o exemplo da Miastenia graves em que se tem o receptor de acetilcolina no musculo, que normalmente precisa do contato entre acetilcolina e o receptor para ter-se a ação muscular. Quando se tem os anticorpos para receptores de acetilcolina vai-se impedir a interação e não ocorrerá a contração msucular. Ocorre fraqueza muscular até chegar no diafragma e ocorrer a morte.
Estratérgia de tratamento das Doenças auto-imunes
Dependendo do tipo de patogenia das doenças auto-imunes, existem varias estrategias sugeridas. No entanto, nem todas são usadas na clinica, pois há varios problemas. 
Por exemplo: Se o problema é o excesso de moleculas co-estimulatorias, e há um execesso de ativação de clones autoreativos, pode-se tentar bloquear a molecula B7, por exemplo, atraves de uma imunoglobulina aclopada a CTLA4, que também liga a a B7 como CD28. Mas se estará competindo com CD28 impedindo a ativação, impedindo a interação com CD40L.
Com a Treg, se houver um problema com a baixa quantidade dela, pode-se tentar induzir Treg contra uma determinada doença autoimune.
Clearance de antigeno: se tem-se algum antigeno que está gerando auto-imunidade, pode-se tentar remover complexos de antigenos com o anticorpo, como no caso de lupus, em que o antigeno é proprio (DNA), pode-se tentar remover o complexo. Pode-se por exemplo utilizar DNAase para quebrar o DNA que esta causando o LUPUS eritromatoso sistemico.
 Apresentação de antigeno com secreção de autoanticorpo: pode-se eliminar as celulas B com o anti-CD20.
Polarização de citocinas: sabe-se que IL2, IFN, TNF, IL12, citocinas que vao gerar TH1 é uma resposta inflamatoria e problematica. Se for tentar gerar TH2 ou TH3 atraves de IL10 u IL4, favore-se uma resposta que as vezes é mais branda.
Mediadores inflamatórios: muitas dien;cas são causadas por excesso de TNF. Pode-se tentar bloquear o TNF com anticorpo ou injetando receptor soluvel. 
As doenças auto-imunes são geralmente associadas ao HLA. Na espodilite esclerosante, se for expresso no MHC classe 1 a proteina B e expressar o alelo 27 da proteina B, vai se ter um risco de 87.5% de apresenta-la.
Em geral, a expressao de determinados genes proteinas, tanto de MHC de classe 1 ou 2 leva a uma incidencia maior a uma doença autoimune. E há uma doença maior em mulheres do que em homens.
10/10
Imunidade de Mucosa
Hipersensibilidades, Doenças Autoimunes, Imunodeficiências
PERFIS FUNCIONAIS DE LINFÓCITOS CD4+ PERIFÉRICOS
A partir de um linfócito CD4 que sai do timo como TH0, antes de ser ativado, ele fica apenas mantendo a sua sobrevivencia através de uma proliferação basal homeostático, utilizando principalmente IL2. Quando ele for ativado, dependendo do ambiente de ativação (de células dendriticas e macrófagos, que vão estar apresentando o antigeno) vai haver muita secreção de IL12 ou IL-4, pelas células que estão no meio. Se houver muita secreção de IL12 o TH0 vai se diferenciar, preferencialmente, para uma Th1, que tem o fator Tbet de transcrição, importante para que a Th1 secrete o que normalmente secreta, como IFNgama, TNFalfa, receptor para IL2, IL2, IL6, GMSF.
Caso haja muita IL4 no meio, ele vai diferenciar para um outro perfil, o Th2, que expressa o fator de transcrição GATA3 que vai ser responsavel pela trancrição de genes que conferem esse perfil Th2. Vai fazer essa celula secretar IL4, IL5, IL6, IL3, recepetor de IL4. A IL4 tem efeito inibitorio sobre a diferenciação de Th1, e o INFgama tem um efeito inibitório sobre Th2. A tendencia é que começando a diferenciar para um perfil, se mantenha esse perfil.
LINFÓCITOS T HELPER PERIFÉRICOS