Microbiologia de alimentos: definições, conceitos úteis, microorganismos nos alimentos, avaliação e critérios, fatores intrínsecos e extrínsecos, Obstáculos de Leistner

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Universidade Federal Fluminese 
Nutrição – Microbiologia de alimentos
Microbiologia: definições e conceitos úteis
Micro-organismos nos alimentos: noções iniciais
Avaliação dos alimentos: critérios e credibilidade 
Fatores que controlam o desenvolvimento microbiano no alimento
4.1 Intrínsecos
4.2 Extrínsecos
5. Teoria dos obstáculos de Leistner
6. micro-organismos indicadores de qualidade microbiologica
1. Microbiologia: definições e conceitos úteis
	Microbiologia é o ramo da biologia que estuda os seres microscópicos, envolvendo procariotos (bactérias, archaeas), eucariotos inferiores (algas,protozoários e fungos) e os vírus. 
	Com a presença de micro-organismos, podem acontecer alterações nos alimentos, sejam elas indesejadas, desejadas (como por exemplo, em vinhos, cervejas...) ou pode haver a presença de patógenos veiculados por alimentos, sem alteração visível.
	A qualidade de um alimento -microbiologicamente falando- normalmente se dá por fatores associados: a quantidade e o tipo de micro-organismos presentes nesse alimento inicialmente (sendo essa contaminação dada pela qualidade de matéria-prima utilizada e pelos processos higiênicos envolvidos com os manipuladores, superfícies e ambientes) e a multiplicação desses micro-organismos no alimento (isso vai estar diretamente ligado com as características do alimento e as condições ambientais que ele se encontra).
	Portanto, há um conjunto de fatores que determina a qualidade de um alimento, de maneira geral. A qualidade da matéria-prima usada e os métodos de processamento (corretos ou incorretos) vão influenciar diretamente no produto final. Além disso, o transporte desse alimento e o armazenamento do mesmo também são fatores que influenciam diretamente em sua qualidade e vida útil.
2. Micro-organismos nos alimentos: noções iniciais
 
	Existem alguns micro-organismos de interesse nos alimentos: deteriorantes (estragam o alimento mais rapidamente que o normal, diminuindo sua vida útil), patogênicos (causadores de doenças), produtores de alimento (que através de processos de fermentação alcoolica, lactica... dão características próprias ao alimento) e indicadores (como o próprio nome já diz, indicam alguma contaminação no alimento. Normalmente são coliformes).
	Como dito anteriormente, alguns micro-organismos provocam alterações que são desejáveis no alimento, conferindo maior resistência a eles, além de odor, textura e sabor característicos. O uso de culturas “starter” é bastante comum na produção de alimentos fermentados como iogurtes (usando Lactococcus Lactis e Lactobacillus vulgaris) e queijos (usando Propionibacterium shermanii, como no queijo suíço).
	O uso de probióticos e prebióticos tem sido bastante difundidos nos últimos tempos, provocando um pouco de confusão. Os probióticos são alimentos que administram micro-organismos vivos – como lactobacillus casei, bifidobacteria e acidophilus- em quantidades adequadas para promover benefícios à saúde do hospedeiro (como prevenção do câncer de intestino a longo prazo e redução das placas de colesterol das artérias). Os prebióticos são componentes não digeríveis -como fibras e oligossacarídeos- que afetam beneficamente e estimulam seletivamente a proliferação e atividade de bactérias desejáveis no cólon, auxiliando o trânsito intestinal.
3.Avaliação dos alimentos: critério e credibilidade
	Cada alimento tem suas próprias características e seu micro-organismo “principal”. A análise microbiologica de um alimento fornece informações que determinam se ele está apto ou não para ser consumido, através da análise do resultado de procedimentos que seguem critérios pré-definidos. Os critérios de avaliação se dão quanto as condições de processamento, de armazenamento e distribuição, vida útil desse alimento (determinando uma validade comercial) e o risco à saúde do consumidor.
	A credibilidade de um resultado se dá a partir da existencia de um critério: são estabelecidos requisitos globais que os alimentos em questão devem atender para serem considerados próprios ou impróprios. Além disso, o critério deve estar voltado para a realidade do alimento.
	O Codex Alimentarius é um documento que determina esses critérios, uniformizando-os. Através de um plano de amostragem, podemos ter margens de trabalho seguras. A definição do micro-organismo a ser estudado nos dá uma diretriz de pesquisa. A definição da metodologia uniformiza o trabalho, orientando o pesquisador a alcançar um resultado verdadeiramente positivo ou negativo. Por fim, a definição de padrões reforça esses resultados e nos aponta a realidade sobre o alimento.
	O plano de amostragem, proposto em 1974 pelo ICMSF, tem a finalidade de avaliar a condição microbiologica de LOTES e permitir sua aceitação ou rejeição. Seu funcionamento é simples: quanto maior o risco do micro-organismo, maior as amostras retiradas de um lote e menor a tolerância caso encontre-se uma amostra defeituosa. Por isso, há um plano de amostragem em “3 classes” e em “2 classes”
		3 classes: utilizando o método de CONTAGEM, aceita ou reprova os lotes dentro de um limite de aceitação e rejeição, determinados por um número mínimo (m) de UFCs e um número máximo (M) de UFCs. Portanto, por “aceitar” amostra defeituosa, é válido para micro-organismos indicadores, não para patógenos.
		2 classes: mais rigoroso, utiliza a PRESENÇA/AUSENCIA de micro-organismos, aceitando ou reprovando lotes caso eles tenham ou não uma amostra defeituosa (já que sua tolerância é 0 amostras defeituosas). É usado para micro-organismos de risco moderado de de difusão extensa (como Salmonella sp.) e de risco direto e grave (como Salmonella, cólera, e. Coli).
	Os micro-organismos são divididos, nesse plano de amostragem em:
		Classe 7,8, 9 – B. Cereus e S. Aureus
		Classe 10, 11 e 12 – Salmonella shigella, etc.
		Classe 13, 14 e 15 – Salmonella typhi, C. Botulinium, E. Coli, V. cholerae		
	
	Após os testes no lote, esse é aprovado ou reprovado. Ele é aprovado provisoriamente se o número de unidades toleráveis for igual ao número de defeituosas permitidas e nenhuma unidade for recusada. É aceito sem contestações se todas as análises forem menores que o mínimo permitido e é recusado se o número de unidades defeituosas for maior que o permitido ou se uma ou mais unidades forem recusadas por estarem acima do número máximo. Quando um lote é recusado, o mesmo pode ser: devolvido, a licença do fabricante pode ser suspensa, deve ser destruído ou reprocessado e os problemas devem ser alertados.
	Exemplo:
	Lotes de Classe 4. m= 2UFC/g M= 4UFC/g
	
	Lote 1 1UFC, 2UFC, 2UFC, 2UFC, 1UFC = OK
	Lote 2 1 UFC, 2UFC, 3UFC, 2UFC, 1UFC = 1 defeituosa
	Lote 3 1 UFC, 2 UFC, 3UFC, 2UFC, 4UFC = 2 defeituosas
	Lote 4 4 1 UFC, 2UFC, 2UFC, 1UFC, 5UFC = 1 acima de M
	Lote 5 5 2 UFC, 1UFC,1UFC, 1UFC,2UFC = OK
	
	LOTE 1 e 5 = APROVADO
	LOTE 2 e 3 = APROVADO PROVISORIAMENTE
	LOTE 4 = RECUSADO
	
	Os padrões são obrigatórios na pesquisa de micro-organismos, enquanto as normas da indústria e as orientações do comércio são de orientação. A RDC 12 de 02/01/2001 orienta o comércio enquanto o MAPA (ministério da agricultura, pecuária e abastecimento) orienta a indústria. 
4. Fatores que controlam o desenvolvimento microbiano no alimento
	Um alimento possui microbiota originária da matéria-prima utlizada, do ambiente, dos equipamentos e de seus manipuladores (mãos, vias aéreas, etc.). A partir disso, seu desenvolvimento irá ser determinado pela característica do alimento em questão, se suas características próprias são favoráveis ou não para a sobrevivência e desenvolvimento desses indivíduos (como atividade de água (água livre disponível para uso), ph, potencial de oxidação, estrutura biológica, antimicrobianos naturais, oferta de nutrientes em sua composição, interação entre micro-organismos presentes, etc.) e as características do ambiente onde esse alimentos encontra-se acondicionado(temperatura, umidade, atmosfera...)
	Esses fatores, conforme modificados, modificam a duração da fase lag, modificam a velocidade de crescimento, número final de células, composição química e enzimática dos micro-organismos, etc.
4.1 Intrínsecos
4.1.1 Atividade de água (Aa) – 
 É a água livre no alimento para uso. É o principal determinante de sobrevivência, crescimento e desenvolvimento de uma comunidade bacteriana. Depende da disponibilidade de água e da concentração de solutos. 
 Existem faixas favoráveis para cada micro-organismo. Bactérias se desenvolvem entre 1,0 – 0,85, assim como Leveduras. Bolores se desenvolvem entre 1,0 – 0,80. Bactérias Halófilas podem sobreviver entre 0,9 – 0,75, Xerófilas entre 0,85 – 0,65 e leveduras osmófilas entre 0,85 – 0,60.
 Na redução da atividade de água, seja por adição de soluto (sal, açúcar, glicerol) ou por remoção de H20 (congelamento, desidratação) os micro-organismos sofrem perda de água para o ambiente (lembre-se do equilíbrio osmótico), aumento da fase Lag, queda na taxa de crescimento e interrupção/mudança na produção de substâncias. Com isso, desenvolvem estratégias para sobrevivência mais adaptada ao meio, protegendo-se através do acúmulo de solutos compatíveis como K, glutamato, glutamina, prolina, etc. (assim evitam o estresse osmótico pela perda de água).
 Os indívíduos podem ser classificados de acordo com sua afinidade ao ambiente, de acordo com os solutos presentes no alimento:
a) Halofílicos: necessitam de alta concentração salina para sobreviver. Aa em torno de 0,76
b) Halodúricos: suportam alta concentração de sal.
c) Xerofílicos: possuem afinidade a ambientes secos. Aa em torno de 0,60
d) Osmofílicos: necessitam de baixa atividade de água, como produtos açucarados.
e) Osmodúricos: suportam concentrações elevadas de açúcar.
		Bactérias de interesse: E. Coli não tolera sal. Aa em torno de 0,96.
					 S aureus: Halodúricos (ou Halotolerantes).
					 Vibrio Fischer: Halófilo
					 Halobacterium Salinarum: Halófilo extremo, necessita de sal.
	
4.1.2 Ph
	É a medida que calcula acidez, variando de 0 a 14, onde 7 é neutro. Normalmente o ph dos alimentos varia de 5,0 a 9,0, tendo poucas espécies habilidade de sobreviver em abaixo de 2 e acima de 10.
	Existem os indivíduos neutrófilos (6,0 a 8,0), acidófilos (abaixo de 6,0) e alcalófilos (acima de 8,0). Acima de 4,5 predominam as bactérias. Na faixa entre 4,0 – 4,5, as Leveduras, bolores aróbios, bactérias lácticas, bacillus e clostridium botullinum (o causador do botulismo).
	Em um indivíduo, o ph irá influencias as atividades enzimáticas e o transporte de nutrientes, já havendo um alto gasto de energia para manter o Ph intracelular.
	Quando este é modificado, as proteínas do micro-organismo podem sofrer desnaturação (inclusive as do DNA), alteração na atividade enzimática e redução na velocidade de crescimento. As estratégias mais comuns de defesa é permitir a entrada ou retirada de íons H+ de acordo com a necessidade, evitando destruição de DNA e ATP, e a produção de compostos neutros como acetoínas e descarboxiladores de aminoácidos.
4.1.3 Potencial de oxidação- redução
	Capacidade de um substrato de perder elétrons (oxidação) e de ganhar elétrons (redução). A atmosfera é um fator que ao entrar em contato com o alimento pode modificar as condições de E h do mesmo. 
	Os indivíduos podem ser classificados como:
	Aeróbios: sobrevivem na faixa de +300 a +500, isso é, na presença abundante de 0². São os bolores, as leveduras oxidativas. 
	Anaeróbios facultativos: sobrevivem na faixa de +100 a +300, são as leveduras fermentadoras, as enterobactérias
	Anaeróbios: na faixa de +30 a -250, morrem no contato com 0²: não fermentam. Formam H²O² que é mortal, não possuindo enzimas que neutralizam. São os Clostridium e os Desulfotomaculum.
	Microaerófilos: Sobrevivem em potenciais levemente redutores. Exemplo: Campylobacter
4.1.4 Composição do alimento
	Os nutrientes utilizados pelos micro-organismos para produção de energia e síntese celular são os que estão compondo o alimento. Em sua maioria, os indivíduos usam os carboidratos. Clostridium utiliza mais substancias nitrogenadas enquanto bolores utilizam proteínas e lipídios. 
	Entre as bactérias, as Gram positivas são as mais exigentes. Em seguida, bactérias Gram negativas. Leveduras e bolores se reproduzem mais facilmente.
	Entre as vitaminas utilizadas, as principais são biotina, ácido fólico, riboflavinas, pois são fatores de crescimento. Os sais minerais utilizados são, principalmente, Mg (pela duplicação de DNA), Na e K (pela bomba sódio-potássio), P (pela produção de ATP) e S (pelos aminoácidos sulfatados e enzimas).
4.1.5 Componentes antimicrobianos naturais:
 	Os alimentos possuem substâncias características e naturais que mantem a estabilidade contra ataques de micro-organismos, retardando e até mesmo inibindo a multiplicação bacteriana.
São os condimentos (óleos essenciais, como o eugenol no cravo, a alicina no alho), as lisozimas e avidinas na clara o ovo, as Igs, o fator complemento, macrófagos e linfóciots no leite do gado, etc.
 Tornou-se comum a adição de componentes como o benzoato de sódio, o sorbato, o citrato, etc. E ainda existem os antimicrobianos produzidos pelos micro-organismos próprios do alimento, como o ácido láctico, o alcool, antibióticos, bacteriocinas, etc.
4.1.6 Estrutura biológica do alimento
	O alimento defende-se naturalmente de sofrer invasões por micro-organismos. Cascas, membranas, ceras e a pele protegem-no do meio externo. Um exemplo clássico é o coco. Sua casca muito resistente, caso fosse quebrada em um ambiente estéril, revelaria um interior com poucas ou nenhumas formas de micro-organismos residindo internamente.
4.1.7 Interação entre micro-organismos
	A produção de metabólitos, a produção de água oxigenada (por estreptococcus e lactobacillus), substancias bactericidas e a exclusão competitiva (usado em aves contra salmonella e campylobacter) tornam mais difícil a proliferação de micro-organismos.
4.2 Extrínsecos
4.2.1 Temperatura
		É o fator mais importante que determina o crescimento bacteriano. Ideal em 35ºC, a temperatura de crescimento pode variar entre -8 e 90ºC. Alguns micro-organismos conseguem fazer adaptações ao frio, produzindo enzimas que funcionam melhor em temperaturas baixas e desnaturam-se em temperatura branca, produzindo acidos graxos que se envolvem na membrana reduzindo a perda de calor e lipídios de membrana com ácidos graxos poliinsaturados.
	Podem ser classificados como:
	Psicrotróficos: são contaminantes mais fáceis, variando de -5 a 5, 25 a 30 e de 30 a 35
	Psicrófilos: indo de -5 a 20. 
	Mesófilos: funcionando bem em temperatura ambiente
	Termófilos: Sobrevivem bem ao calor
4.2.2 Atmosfera que envolve o alimento
	Seleciona micro-organismos aeróbios de anaeróbios, usando atmosfera restrita em oxigenio (vácuo) ou controlada em CO² e O³
4.2.3 Umidade relativa
	É diferente de atividade de água (que é um fator intrínseco) mas possui relação estreita com a mesma. Alimentos estabelecem relações com o ambiente, perdendo água para o meio ou ganhando água do mesmo. 
Teoria dos obstáculos de Leistner
A ação conjunta de fatores podem potencializar ou não -e até limitar- o efeito isolado dos fatores sobre os micro-organismos contaminantes, aumentando a vida útil do alimento, impedindo ou retardando deterioração e dificultando a veiculação de doenças.
	Exemplos: o leite em pó sofre alteração na atividade de água (por desidratação) e é fechado em uma embalagem com pouca oferta de 0² (modificando a atmosfera). O leite UHT sofre processo de alta temperatura e embalagem estéril, hermeticamente fechada. As conservas sofrem alteração no pH (para mais ácido) e são hermeticamente fechados. O bacalhau salgado tem alteração na atividade de água pela salga e depois, em casa, pela conservaçãodessalgado na geladeira em baixa temperatura. 
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