Determinação de Proteínas - Relatório

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Universidade Federal de Viçosa
 Centro de Ciências Exatas e Tecnológicas
 Departamento de Tecnologia de Alimentos
 TAL 469 – Análise de Alimentos
Determinação de Proteínas
Renata Machado Penna – 64256
Viçosa – MG
Maio 2012
1: Introdução:
As proteínas podem ser encontradas em produtos animais como carne, peixe, ovos, leite e seus derivados e em alimentos vegetais como cereais, grãos e sementes. Todas as fontes de proteínas contêm alguns dos aminoácidos essenciais, mas em quantidades variadas (REVISTA ISTOÉ, 2002).
As proteínas são compostas de aminoácidos e têm a função de reparar os tecidos, participam no equilíbrio entre os fluidos do corpo, de acordo com sua estrutura molecular, tem uma função biológica associada às atividades vitais. São encontradas nas carnes vermelhas, frango, peixe, ovos, leite e derivados. Nos alimentos, além da função nutricional, as proteínas têm propriedades organolépticas e de textura. Podem vir combinadas com lipídeos e carboidratos (CECCHI, 2003).
MÉTODOS BASEADOS NO TEOR DE NITROGÊNIO: Nitrogênio é o elemento de propriedades mais distintas presente nas proteínas. O teor em materiais biológicos não provém somente das proteínas, mas também de outros componentes como ácidos nucleicos, aminas carboidratos e lipídios substituídos por radicais nitrogenados, aminoácidos não protéicos etc. A medida de nitrogênio é uma boa estimativa do conteúdo de proteínas de materiais biológicos. A análise de nitrogênio total é o método mais usado para diferenciar carboidratos e lipídeos de proteínas (JOSÈ CARLOS E GUSTAVO, 2011).
Vários métodos podem ser empregados para a análise das proteínas, dentre esses métodos podemos citar os métodos de Kjeldahl e Formol.
O método de Kjeldahl determina N orgânico total, isto é, o N protéico e não protéico orgânico. Porém, na maioria dos alimentos, o N não protéico representa muito pouco no total. A razão entre o nitrogênio medido e a proteína estimada depende do tipo de amostra e de outros fatores (CECCHI, 2003).
O método consiste em aquecer inicialmente a mostra contendo nitrogênio com excesso de ácido sulfúrico concentrado até que todo carbono seja oxidado a CO2. Modificações posteriores usam da adição de catalisadores, para acelerar a oxidação. Após a digestão, basifica-se com hidróxido de sódio para destilação da amônia (NH3) formada (JOSÈ CARLOS E GUSTAVO, 2011).
Adiciona-se NaOH concentrado e aquece-se para a liberação da amônia dentro de um volume conhecido de uma solução de ácido bórico, formando borato de amônia. O borato de amônia formado é dosado com uma solução ácida (HCL) padronizada (CECCHI, 2003).
O método do formol e muito aplicado para proteínas do leite e, dentro de certos limites, rende boas correlações entre proteína por Kjeldahl e proteínas por titulação após reação com formol. Essencialmente, o método é baseado no princípio de que, na região de pH 8,3, grupos amino livres das proteínas (-NH2 terminal, –NH2 da lisina e, até certo ponto, arginina) reagem com aldeído fórmico formando compostos amínicos e com consequente liberação de prótons. Esse método é altamente correlacionado com o teor de proteína. O princípio do método consiste na reação do formaldeído com os grupos –NH2 das proteínas, deslocando o equilíbrio químico no sentido da liberação de prótons, que estavam anteriormente ligados a esses grupos formando os grupos –NH3+. Ao reagir com os grupos –NH2, o formaldeído desloca o equilíbrio químico para manter a constante que governa tal equilíbrio. Os prótons liberados são neutralizados (titulados) com uma solução de hidróxido de sódio, formando uma correlação entre quantidade de proteína e quantidade de hidróxido de sódio gasta para neutralizá-los (JOSÈ CARLOS E GUSTAVO, 2011).
LEITE: As proteínas do leite constituem ingredientes dos mais valorizados pelas suas excelentes propriedades nutritivas, tecnológicas e funcionais. Suas propriedades nutritivas e tecnológicas derivam da composição em aminoácidos que atendem à maioria das exigências fisiológicas do ser humano e de suas propriedades físico-químicas, que proporcionam propriedades funcionais de grande interesse tecnológico como: solubilidade, absorção e retenção de água e de gordura, capacidade emulsificante e estabilidade das emulsões, capacidade espumante e estabilidade de espuma, geleificação, formação de filmes comestíveis e biodegradáveis, formação de micropartículas, melhoria nas propriedades sensoriais e na aceitação dos produtos (MODLER, 2000; WONG et al., 1996).
Do ponto de vista nutritivo e industrial, as proteínas do leite de mais ampla aplicação e valor econômico são as caseínas e as proteínas do soro. A concentração de proteína total e a relação entre caseína e proteína de soro são muito variáveis entre as espécies (SGARBIERI, 1996).
O valor biológico de uma proteína está determinado pelo seu conteúdo em aminoácidos essenciais. As proteínas de origem animal possuem, devido à sua composição em aminoácidos, um valor biológico mais elevado que as proteínas de origem vegetal (ROÇA, R.O, 1986).
CARNES: Com relação ao grupo das carnes, sabe-se que a carne bovina magra, similarmente à carne branca das aves (sem pele) e ao lombo suíno, é fonte importante de proteína e deve fazer parte de uma dieta balanceada com os nutrientes dos demais grupos de alimentos. A solubilidade das proteínas da carne é o principal fator que determina as propriedades de suculência. A solubilidade é influenciada pelo pH, temperatura e início do rigor-mortis. Na carne PSE possui menor solubilidade de proteínas que a carne normal. Na técnica de avaliação da solubilidade, por métodos de extração são separadas: proteínas solúveis em água, proteínas solúveis em sal (1%), proteínas sarcoplasmáticas e proteínas miofibrilares (ROÇA, R.O, 1986).
PTS: A proteína testurizada de soja, também conhecida como carne de soja ou seitan; a proteína concentrada de soja; e a proteína isolada de soja, que apresentam respectivamente 52%, 65% e de 80% a 90% de proteína. A PTS é oferecida em grãos ou pedaços maiores: com uma estrutura alinhada e fibrosa, resulta em um produto alimentício de textura similar à carne. Depois de corretamente hidratada, apresenta cor semelhante à da carne. O consumo de 50g de PTS equivale em termos proteicos ao de um bife pequeno (MARIA, 2009).
 As proteínas vegetais vêm sendo largamente utilizadas na indústria alimentícia como substitutas da proteína animal, além de agir como um ingrediente funcional nos mais variados produtos. Dentre as proteínas mais utilizadas encontra-se a proteína texturizada de soja. Seu processamento envolve uma etapa de secagem que é uma das operações unitárias mais relevantes e desafiadoras para a indústria alimentícia (CASSINI, ALINE SCHILLING 2004).
Na maioria dos alimentos, o N não proteico representa muito pouco no total. Para converter o nitrogênio medido em proteína, multiplica-se o conteúdo de nitrogênio por um fator geral que é obtido com base no fato de que, na maioria das proteínas, o teor de N é em torno de 16%.
100 g proteínas -------------- 16g N x = n x 100 n x 6,25 g proteínas
 x g proteínas -------------- n g N 16
Com isso, o fator geral de conversão do N em proteínas é 6,25. Mas, em alguns casos, emprega-se um fator diferenciado de 6,25, conforme descrito na Tabela 2. 
Tabela 1 - Teor de proteína em alguns alimentos usuais e sua classificação como fonte de aminoácidos essenciais para a nutrição humana (VICENZI, 2000).
	PROTEÍNA - %
	ALIMENTO
	30-44
20-25
6-10
8-11
8-15
3,5
12
15-25
18-20
20-35
20-24
	Soja
Feijão
Arroz
Milho
Trigo
Leite de vaca (in natura)
Ovos de galinha
Carne de mamífero
Carne de galinha
Amendoim
Crustáceos e peixes
No cálculo para se obter a porcentagem de proteína na amostra é utilizado um fator empírico de correção “f”. Multiplica-se este fator pelo valor total de N obtido na determinação analítica. A Tabela 2 apresenta alguns exemplos de fator “f”. Se o resultado for expressoem % de proteína o fator usado deve ser indicado.
Tabela 2 – Exemplos de fator “f” para diferentes produtos alimentícios (VICENZI, 2000)
	Tipo de amostra
	Fator f
	Geral
Gelatina
Ovos
Produtos lácteos
Soja
Farinha trigo
Arroz
Carnes
	N x 6,25
N x 5,55
N x 6,68
N x 6,38
N x 6,00
N x 5,70
N x 5,95
N x 6,25
2: Objetivo: 
Apresentar os métodos usuais de determinação de proteínas em Leite, Carne e Proteína Texturizada de Soja, utilizando o método de Kjeldahl e método do formol.
3: Materiais e Equipamentos: 
MÉTODO DE KJELDAHL:
Ácido Sulfúrico
Catalizadores
Béquer 
Proveta
Erlenmeyer
Balança analítica
Digestor
Tubos de Ensaios
Destilador de Nitrogênio
Hidróxido de Sódio 35-40%
Indicador
Ácido clorídrico 0,05N e 0,1N
MÉTODO DO FORMOL:
50 mL de leite, pH = 6,6
25 mL de água destilada
2,0 mL de oxalato de potássio saturado
1,0 mL solução alcoólica de fenolftaleína 1% m/v 
NaOH 0,1N padronizada
Frasco Erlenmeyer de 250 mL
5,0 mL de aldeído fórmico (formol) 40% m/v
4: Procedimentos:
MÉTODO DE KJELDAHL: A amostra orgânica foi pesada e posta juntamente com uma mistura catalítica em um tubo de ensaio, adicionando então 3 ml de H2SO4, levando assim para o tubo digestor, em uma temperatura inicial de 100°C , aumentando continuamente 50°C em 20 minutos até uma temperatura de 400°C ou até a amostra encontrar-se de cor clara, com o aquecimento em si o ácido ajudará a acelerar a decomposição da matéria orgânica, restando apenas o composto nitrogenado, evaporando água e outros componentes. Ao final da digestão ouve a formação do sulfato de amônio ou bisulfato de amônio. Após a digestão, a amostra foi transferida para o destilador de nitrogênio onde ocorreu à destilação da mesma. Em um Erlenmeyer colocou-se aproximadamente 10 ml de ácido bórico (20%) juntamente com 4 gotas de metil – Orange e 6 gotas de verde de bromocresol; Colocou-se o frasco com o ácido bórico na saída do destilador, deixando a ponta do destilador mergulhada no ácido. Na amostra adicionou-se 40 mL de água destilada e 5 gotas de fenolftaleína e colocou-se no destilador de nitrogênio, onde aos poucos recebeu NaOH até atingir uma coloração roxa ou rosada. Logo após o ponto de viragem da amostra, ocorre a destilação da amostra. A amônia que em meio ácido estava sob a forma não–volátil, agora em meio básico, passa para a forma de NH3 volátil, que irá ser destilada e recolhida ao final do processo. Recebeu-se no frasco de ácido bórico, mais ou menos 2/3 da amostra destilada seguindo assim então para a ultima etapa que foi a titulação O destilado foi titulado com uma solução padronizada de HCl 0,1 M onde ocorreu a neutralização parcialmente do ácido. Ao atingir o ponto de viragem foi anotado o volume gasto de ácido clorídrico. Após todo o processo foi calculado a porcentagem de proteínas com os dados obtidos. A realização do branco é necessária, pois elimina a interferência do N2 do ar.
Para se determinar a taxa de recuperação, durante a etapa de destilação, o nitrogênio presente na proteína da amostra é transferido quantitativamente para a solução de ácido bórico. Para verificar-se a eficácia dessa transferência, calcula-se a taxa de recuperação, utilizando um padrão (substância com teor de nitrogênio conhecido). Esse padrão é um aminoácido, como a lisina ou o triptofano, na prática foi utilizado a lisina. Pesa-se exatamente 100mg do aminoácido e realiza-se o mesmo procedimento apresentado anteriormente.
	Observam-se dois nitrogênios terminais na fórmula estrutural da lisina (figura ao lado). Como o peso molecular de cada N é 14g/mol, e o peso molecular da lisina-HCl é 182,66, obtemos a seguinte relação:
 182,66 ------------100%
 28------------ T
 T=15,3% = % de N estequiométrico
	A porcentagem de N estequiométrico relaciona-se com a porcentagem de N encontrada, resultando, assim, na taxa de recuperação.
DIGESTÃO:
 H2SO4/catalisador
Matéria orgânica (NH4)2SO4 + SO2 + CO2 + SO3 +H2O
 
DESTILAÇÃO: 
(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH4OH + Na2SO4
 
NH4OH NH3 + H2O
NH3 + H3BO3 NH4H2BO3
TITULAÇÃO:
NH4H2BO3 + HCL H3BO3 + NH4Cl
Indicador de Tashiro
MÉTODO FORMOL: Titulou-se a amostra até pH 8,3, utilizando fenolftaleína como indicador, com solução de hidróxido de sódio 0,1N padronizada. Adicionou-se o aldeído fórmico, e a seguir titulou-se com a mesma solução de hidróxido de sódio suficiente para retornar ao pH de 8,3. Para determinação de proteína transferiu-se 50,0 mL de leite para um erlenmeyer de 250 mL; adicionando 25 mL de água destilada a 2,0 mL de uma solução saturada de oxalato de potássio, acrescentando 1,0 mL de solução alcoólica de fenolftaleína 1% m/v deixando em repouso por dois minutos. Em seguida, titulamos com solução de NaOH 0,1N padronizada até coloração rósea. Adicionamos 5 mL de aldeído fórmico (formol) 40% m/v, agitamos e deixamos em repouso por dois minutos. Titulamos com solução de NaOH 0,1N padronizada até coloração rósea. Preparamos um ensaio em branco em um erlenmeyer de 250 mL adicionamos 50,0 mL de água, 2,0 mL de oxalato de potássio saturado, 1,0 mL de fenolftaleína e 5,0 mL de aldeído fórmico 40% m/v, titulamos com solução de NaOH 0,1N padronizada até coloração rósea.
 
5: Resultados e Discussão: 
MÉTODO DE KJELDAHL:
 
Onde, ƒc = 1,070, PE = 14 e, para micro Kjeldahl, N = 0,05.
 
Onde, X = porcentagem de N na amostra, P = peso da amostra 3.
Onde, ƒ(conversão) da soja é 5,71.
Taxa de recuperação da amostra 4: 99,3%
Método N total modificado:
	Amostra
	Massa ou
Volume
	Vol. Gasto
HCl
	% Nitrogênio
	% Proteína
	Leite
	3,1143 g
3,1534 g
	21,4 mL
21,6 mL
	0,54 %
	3,44 %
	Carne
	406,6 mg
401,2 mg
	18,3 mL
18,0 mL
	3,34 %
	20, 9%
	PTS
	213,4 mg
223,0 mg
	12,5 mL
13,1 mL
	4,39%
	25,1%
	4) Lis-HCl
	112,2 mg
103,2 mg
	23,0 mL
23,3 mL
	15,4%
	---
	Branco
	
	0,1 mL
	
	
METODO FORMOL: 
Volume da NaoH gasto na titulação
Leite: VolumeA1 = 13,2 mL VolumeA2 = 13,7 mL Vmédio = 13,5 mL
Branco: VolumeB1 = 2,3 mL VolumeB2 = 2,6 mL Vmédio = 2,5 mL
% Ptn = % N x fc 
Onde, fc = 1,0103
mEq NaOH= N x (VA- VB) x fc
mEq NaOH = 1,1111
50 mL amostra ----- 100% 
 X ---- 3,44% pnt X = 1,72 mg de pnt
1,72/ 1.1111 = 1,55 mg de ptn por mEq deNaOH
O leite pelo método de Kjedahl = 3.44%, assim pelo método do Formol temos:
3,44% ptn ---- 1 mEqNaOH 
 X ------ 1,1111 mEqNaOH X = 3,82% ptn
De acordo com os resultados apresentados, podemos observar que o método Formol, obteve um maior Desvio Padrão quando comparado aos resultados obtidos pelo método de Kjeldahl, o que sugere que o método de Kjeldahl demonstra maior reprodutibilidade de seus resultados. Outro fato é que o método de formol decorre da quantificação de prótons das cadeias laterais dos aminoácidos, o que pode ocorrer de forma insatisfatória. A partir dos resultados obtidos, verificou-se que o método de Formol, ainda que não oficial, pode ser uma alternativa para a Indústria de Laticínios, apresentando resultados satisfatórios quando comparado ao método Kjeldahl. Tendo em vista o custo desta análise, o fator segurança que é primordial e o tempo necessário para que se tenha em mãos o resultado final da análise. O método Formol pode ser uma realidade dentro das Indústrias, ainda que seu uso esteja limitado para amostras lácteas.
6: Conclusão: 
Vimos que, diversos fatores devem ser analisados antes da escolha de uma metodologia para a determinação de proteínas totais, sendo essencial o conhecimento e da natureza dos constituintes da amostra e de suas concentrações aproximadas. Facilitando assim a identificação dos possíveis interferentes o que ajudará na escolhado método mais apropriado para cada situação. Outros fatores como, a sensibilidade necessária que é dependente da concentração de proteína na amostra e do volume de amostra disponível, a rapidez e o custo da metodologia e o grau de confiabilidade nos resultados obtidos devido aos interferentes no método escolhido, também são de extrema importância.
7: Referências Bibliográficas:
JOSÉ CARLOS GOMES, GUSTAVO FONSECA OLIVEIRA. Análises Físico-Químicas de Alimentos. Editora UFV, 2011.
CASSINI, ALINE SCHILLING, Análise das características de secagem da proteína texturizada de soja; Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Escola de Engenharia. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. 2004.
MODLER, H.W. Milk processing. In: NAKAI, S.; MODLER, W. (Eds.). Food proteins: processing applications. Wiley-VCH, Inc., 2000. p.1-21.
SGARBIERI, V.C. Proteínas em alimentos proteicos: propriedades, degradações, modificações. São Paulo: Editora-Livraria Varela, 1996. 517 p., p.139-157.
CECCHI, Heloisa Mascia. Fundamentos teóricas e praticas em analise de alimentos. 2. ed. Campinas: UNICAMP, 2003. 
ROÇA, R.O. Desenvolvimento de fiambres com carne de frango. Campinas:F.E.A./UNICAMP, 1986. 183p. Tese (Mestrado em Engenharia de Alimentos, Área de Tecnologia de Alimentos) - Faculdade de Engenharia de Alimentos - Universidade Estadual de Campinas.
Guia da Saúde Familiar - revista ISTOÉ - Volume 16 - 03/2002
VICENZI, Raul. Química Industrial de Alimentos – UNIJUI - 2000.MONTANARINI MARIA, Soja: Nutrição e Gastronomia; São Paulo: Editora Senac, 2009.
	
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