Clonagem de DNA in silico com pDraw32

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Clonando e obtendo um RFLP in silico - o uso do pDraw32
Resumo da aula: Nesta aula vamos empregar uma ferramenta de montagem de plasmídeos recombinantes in silico, que também analisa os
sítios de restrição presentes numa sequência de DNA qualquer e ainda cria um gel virtual de agarose, onde aparecem as bandas de
DNA correspondentes aos fragmentos gerados pela digestão do DNA com a enzima escolhida. Para tal vamos começar analisando uma
sequência de plasmídeo com o programa: seu tamanho, onde estão os sítios de restrição, onde está o poly-linker (ou MRS ou sítio
múltiplo de clonagem). Em seguida vamos olhar da mesma forma o inserto, que é uma sequência de Leishmania escolhida ao acaso no
banco de dados ProGeNE (Programa Genoma Nordeste). Depois vamos estudar pelo Word ou outro processador de texto o local de
corte único de uma enzima (SacI) com a qual abriremos o plasmídeo para inserir um pedaço da sequência da Leishmania. Uma vez
observado como é o corte, tanto no vetor como no DNA doador, vamos acrescentar o inserto ao vetor, usando de novo o programa
pDraw. O plasmídeo recombinante será então nossa base de trabalho para estudar quais enzimas podem ser empregadas para cortá-lo
e produzir um gel de agarose com bandas diferentes quando o inserto estiver num sentido ou no outro. Desde já é preciso ter na mente
que as enzimas que vão ser usadas para este fim NÃO SÃO as enzimas que foram usadas para a clonagem! Os dois géis vão, finalmente,
ser comparados um ao outro.
Índice dinâmico:
Abrindo o PDraw32 e adicionando uma sequência de nucleotídeos
Batizando o plasmídeo e tornando-o circular (como convém...)
Selecionando enzimas para cortar o plasmídeo
Construindo o plasmídeo quimérico
Repetindo os passos para o vetor carregando o inserto na direção oposta (reverse)
Distinguindo o sentido do inserto
 
Abrindo o PDraw32 e adicionando uma sequência de nucleotídeos
O programa pode ser baixado do site da empresa que o desenvolveu (www.acaclone.com) e sua instalação não requer maiores
explicações. Abra a caixa de diálogo para adicionar uma nova sequência de nucleotídeos clicando sobre o botão File e optando por
Enter new sequence, como mostrado abaixo (Figura 1a). Imediatamente uma caixa para colar a sequência aparece. Colamos nela a
sequência do plasmídeo pCR2.1 TOPO (Figura 1b), disponibilizada aqui (sequência de nucleotídeos).
 
Figura 1a: Menus de abertura do programa pDraw32 
Figura 1b : Caixa de colagem da sequência nova (no caso, a sequência
do plasmídeo pCR2.1 TOPO)
Em seguida vamos visualizar a sequência ainda linear do plasmídeo, com os sítios de restrição assinalados para todas as enzimas que
cortam em uma ou mais posições a sua sequência (Figura 2). Observe que há uma grande concentração de sítios de restrição no início da
sequência, que corresponde ao poly-linker. Na figura a sequência ainda não tem nome (new DNA entry), mas já tem um comprimento:
3908 pb. As cores que aparecem na barra horizontal correspondem à porcentagem de GC na sequência (em blocos de 9 pb), como
indicado pelo código de cores na parte de baixo da figura.
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Figura 2: Sequência do plasmídeo pCR2.1 TOPO linearizada, mostrando as posições para corte (sítios de restrição) de dezenas de diferentes enzimas de
restrição. está assinalado também o comprimento da sequência de DNA
 
Batizando o plasmídeo e tornando-o circular (como convém...)
É possível "batizar" a sequência com o nome real do plasmídeo ou outro qualquer que possamos desejar e ainda transformá-la num
círculo, como convém. Para isso, o programa disponibiliza uma janela de diálogo onde se pode escolher a forma circular do DNA (num
botão de rádio) e designar o nome do DNA (numa caixa de texto) (Figura 3). Dando-se OK o programa vai circularizar o plasmídeo e
"batizá-lo" corretamente (Figura 4)..
Figura 3: Janela de diálogo onde se pode escolher a forma circular do DNA (num botão de rádio) e designar o nome do DNA (numa caixa de texto).
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Figura 4: Aspecto do plasmídeo pCR2.1 TOPO, como visualizado pelo pDraw32, circularizado, nomeado, com seu comprimento identificado e com os sítios de
restrição para o conjunto de enzimas do banco de dados de enzimas de restrição do programa já assinalados.
 
Selecionando enzimas para cortar o plasmídeo
Entretanto, quando clonamos um inserto num vetor não podemos abrir o vetor em mais de 1 ponto. Então, podemos estudar que enzimas
cortam o plasmídeo em apenas 1 ponto. Para tal usamos a caixa de diálogo disponibilizada em Settings/ Enzyme selection e mostrada
abaixo (Figura 5).
 
Figura 5: Caixa de diálogo para seleção de enzimas. Na caixa podemos escolher o número mínimo e máximo de cortes para a sequência toda ou para trechos
dela (até 4 trechos). Observe que a caixa tem várias abas e a figura está mostrando apenas a primeira delas.
Uma vez selecionado o número de cortes e a área do plasmídeo que pode se cortada, clica-se no OK e a resposta imediata mostra a
figura 6 abaixo. Se tivéssemos selecionado apenas da base 1 a 400, por exemplo, só os sítios de restrição próximos ao poli-linker
apareceriam. 
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Figura 6: Mapa do pCR2.1 TOPO mostrando os sítios únicos de restrição. Note a aglomeração de sítios na região do poly-linker, à direita, em cima da figura.
A lista a seguir representa todos os sítios de restrição entre a base 1 e 400, todos eles no poli-linker, em ordem alfabética:
Acc651 BfrBI KpnI SacI
AflII EcoICRI NotI SpeI
ApaI EcoO109I NsiI XhaI
AvaI EcoRV PspOMI XhoI
BamHI HindIII PspXI 
Da mesma forma que fizemos para o plasmídeo, podemos proceder com a análise do inserto (a sequência completa do gene da Leishmania
está disponível abaixo da do plasmídeo, no mesmo link sequência de nucleotídeos), estudando as posições dos sítios de restrição de
enzimas que cortam o trecho da ORF do gene em apenas dois lugares. A figura 8a abaixo mostra como é cortado o trecho inicial do
gene, e a Figura 8b ao lado direito é a representação dos dois ponto de corte para uma enzima selecionada, a SacI. Ela corta o gene
nas posições 1884 e 2671. Observe que a enzima cria extremidades coesivas já que corta o DNA em posições diferentes numa fita e na
outra, A maneira como a enzima corta está indicada na figura 8b: G_AGCT'C. Isto indica que a fita "de cima" é cortada mais adiante
que a "de baixo", criando uma protuberância 3 ´ (chamada 3´overhang, em inglês). As extremidades formadas estão mostradas na
figura 7 abaixo:
 A seleção da enzima SacI (na caixa de Enzyme selection, é preciso escolher a aba Explicitly select, então escolher SacI da lista e
ainda ativar a caixa de escolha Explicitly selected enzymes only), que já sabemos corta o vetor em apenas um ponto, dentro do poly-
linker, resulta no mapa da figura 8c.
Figura 8a: Vê-se o início do gene da Leishmania com os sítios indicados para
 
Figura 8b: Pode-se selecionar uma ou mais enzimas que terão seus sítios
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as enzimas que cortam duas vezes o inserto. representados na figura. No caso, a enzima foi a SacI, indicada sobre o gene,
que o corta em dois pontos, formando extremidades coesivas no fragmento
central, que será o inserto clonado no plasmídeo.
Figura 8c: O sítio de corte da SacI está também indicado no plasmídeo. A enzima só corta o plasmídeo neste ponto, formando extremidades coesivas
 
Construindo o plasmídeo quimérico
As extremidades coesivas formadas pelo corte com SacI, tanto no fragmento central do DNA de Leishmania como no plasmídeo, são
usadas para construir o vetor quimérico, ou recombinante. Observando cuidadosamente as posições de corte da enzima no vetor e no
DNA da Leishmania, podemos construir no Word a quimera,como mostrado abaixo:
Figura 9: Trecho do plasmídeo pCR2.1 TOPO, aberto (segmentos acima e abaixo da figura), mostrando no interior o segmento intermediário do DNA de
Leishmania cortado pela enzima SacI (segmento no meio da figura). Os círculos marcam os sítios de restrição (clivados) da SacI em cada uma das sequências de
DNA
Na parte de cima da figura vemos o trecho do plasmídeo da base 1 (que é uma escolha do fabricante) até a base em que o corte foi
feito. Em vermelho está indicado o trecho do sítio de restrição que ficou ainda no plasmídeo (no caso, foi um overhang 3 )´, cercado com
um círculo vermelho. Separado por um espaço vem o trecho de sequência de DNA correspondente ao segmento central do DNA de
Leishmania, cortado com a SacI. Repare que há só uma base restante no sítio, porque esta é a extremidade 5 ,´ e está indicada por uma
base em vermelho, contornada por um círculo verde. De forma análoga, ao fim do inserto está indicado o resto do sítio de restrição
(círculo verde), assim como o resto (uma base) do sítio de restrição que ficou na outra ponta do plasmídeo (círculo vermelho). Basta
colar esta sequência (nem precisa emendar) na caixa de diálogo do programa pDraw (open/enter new sequence) e o novo plasmídeo,
desta vez recombinante, será criado (mas ainda não batizado nem anotado). Alternativamente, posso pegar o arquivo que já tinha
criado (Figura 10a) e acrescentar no lugar certo da sequência do plasmídeo o meu inserto! O resultado será o plasmídeo mostrado na
Figura 10b: está batizado, mas ainda podemos anotar algumas coisas sobre ele, como veremos a seguir.
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Figura 10a: Colando o inserto em um ponto da sequência do plasmídeo. Basta
abrir a sequência do plasmídeo e colar a do inserto, sem precisar dar atenção
a números na margem e espaços em branco.
 
Figura 10b: Aspecto inicial do plasmídeo recombinante. Ele ainda não
tem a indicação do que é o inserto, mas comprimento já mudou (agora são
4695 pb, contra 3908 do plasmídeo vazio)
Agora podemos adicionar outras informações à figura 10b, para torná-la mais clara. Vamos usar a caixa de diálogo DNA Information,
que já usamos antes para batizar o plasmídeo. Na figura 11 abaixo estão as instruções para a adição das informações sobre a posição
do corte da enzima (a) e para a identificação do inserto (b).
 
Figura 11a: Preenchimento da caixa de diálogo DNA Information para
identificar o local de corte, e a enzima. Usa-se a opção tick mark
 
Figura 11b: Preenchimento da caixa de diálogo DNA Information para
identificar o inserto e sua direção. As duas informações podem ser
adicionadas simultaneamente.
O resultado final pode ser visto na Figura 12 abaixo, onde se vê o inserto identificado, os sítios de corte, o nome da enzima e, de
quebra, o sítio de restrição, mostrando até que ele gera um overhang 3´quando cortado. As setas finas pretas são ORFs que o
programa encontra no plasmídeo (e no inserto). As ORFs podem corresponder a genes que, de fato, existem, e são expressos no
plasmídeo. No caso do inserto, ele de fato contém uma ORF (parte dela) de um gene expresso pela Leishmania chagasi. 
Figura 12: Plasmídeo recombinante anotado. Vê-se inserto identificado, os sítios de corte, o nome da enzima e o sítio de restrição, indicando que tipo de 
overhang ele gera quando cortado (neste caso, 3 )´.
 
Repetindo os passos para o vetor carregando o inserto na direção oposta (reverse)
Como exercício deixamos ao leitor a tarefa de criar um plasmídeo como o acima (figura12), contendo o inserto no sentido inverso. Para
obter a sequência complementar do DNA da Leishmania ( é daí que é preciso começar) deve-se copiar a sequência do arquivo Word ou
txt (não pegar apenas o inserto, já cortado com a SacI, mas a sequência toda) e colar na caixa de diálogo que se abre quando
selecionamos Utilities/ Sequence manipulator tool, como mostrado na Figura 13 abaixo.
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Figura 13: Caixa de diálogo que permite a manipulação da sequência que desejamos estudar. Pode-se acrescentar sítios de restrição nas pontas da sequência e
alterar qualquer base. A sequência complementar (reversa) aparece quando selecionamos a opção Reverse complement e clicamos em Calculate sequence.
A sequência de DNA complementar à que entramos pode ser copiada e colada onde quisermos. No caso, vamos estudá-la como fizemos
com a sequência no sentido original, vendo onde são os cortes com a enzima SacI. O segmento interno será copiado e colado no
plasmídeo, e os demais passos explicados antes vão conduzir a uma figura análoga à 12, mas com o inserto apontando na direção oposta.
 
Distinguindo o sentido do inserto
Quando fazemos uma clonagem bi-direcional, como a indicada acima, o inserto de fato pode ficar em qualquer um dos dois sentidos.
Como saber, para um clone qualquer, o sentido em que está o inserto? Uma forma possível é extrair os plasmídeos e cortá-los com uma
enzima de restrição que produza cortes em posições favoráveis à visualização da posição do inserto. O número mínimo de cortes que
podemos dar é 2: um no plasmídeo e outro no inserto. O do inserto deve ser mais próximo a uma da extremidades, e não no meio. O do
plasmídeo pode, em princípio, ser em qualquer lugar. Na figura 14 abaixo estudamos os pontos onde cortam 3 enzimas de restrição que
cortam o plasmídeo recombinante em 3 pontos cada. Repare que empregamos o plasmídeo com o inserto reverse para isso, mas é igual se
usarmos o plasmídeo com o inserto forward. Para fazer aparecer apenas as enzimas que desejamos (entre as que dão no mínimo 3 e no
máximo 3 cortes, apenas as 3 da figura), procedemos em duas etapas: selecionamos a cinemas que cortam no mínimo 3 e no máximo 3
vezes a sequência completa. Em seguida clicamos sobre as que queremos visualizar e habilitamos a opção Explicitly selected enzymes
only (um pequeno quadrado), como mostrado na figura 15 abaixo.
Figura 14: Estudo dos pontos de corte de 3 enzimas de restrição na construção pCR2.1 + inserto reverse
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Figura 15: Ativando a visualização de algumas enzimas de um conjunto oferecido. No caso, escolhemos enzimas que cortavam 3 vezes o plasmídeo recombinante.
Quando observamos a figura 14, fica claro que a enzima PstI não serve, porque corta o inserto quase no meio. Sobram as duas outras,
O exemplo a seguir usa a ApaLI (o I no final é um 1 romano) e as duas outras, mesmo sabendo que provavelmente o resultado será
melhor com a ApaLI.
Temos que, uma vez entrada a sequência do plasmídeo recombinante e feita a seleção das enzimas, clicar sobre View, que abre uma lista
de opções. Aí escolhemos Agarose Gel Electrophoresis e assim que clicarmos sobre ela, vai aparecer o "gel" virtual, como mostrado na
figura 16 abaixo:
Figura 16: Imagem do "gel virtual" gerada pelo programa pDraw32 para o plasmídeo recombinante com inserto reverse, cortado por 3 diferentes enzimas de
restrição, cada uma delas dando 3 cortes no plasmídeo. 
Espera-se, naturalmente, 3 bandas para cada digestão. É verdade para NaeI e PstI, mas ApaLI só apresenta duas bandas! A razão é
simples: duas delas têm quase o mesmo tamanho, e migram juntas.
Se repetirmos a mesma operação com o plasmídeo recombinante contendo o inserto na direção forward, teremos um segundo gel virtual.
Os dois estão mostrados abaixo (Figura 17).
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Figura 17: Montagem das imagens de dois géis virtuais, a partir dos plasmídeos recombinantes contendo o inserto num sentido ou no outro. É evidente que a
enzima ApaLI gera um padrão de bandas muito diferente nos dois casos. As duas outras mostram pequenas diferenças, mas que ainda assim podem ser usadas
para distinguir a posição dos insertos.
Quando comparamos os perfis de bandas gerados pelas digestões das 3 enzimas nas duas construções, fica claro que a ApaLi é a que dá
um resultado mais claro. Entretanto, quando corridas lado a lado,as digestões com as demais enzimas também permitem a diferenciação
dos insertos.